CN1689626A - 治疗乳腺增生的中药复方及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗乳腺增生的中药复方制剂及其制备方法、质量控制方法。该中药组合物主要由青皮、柴胡、王不留行(炒)、三棱、莪术、延胡索(醋制)、蒲黄、浙贝母、夏枯草、白芷、冰片组成，经过醇提、浓缩、加辅料、加热使溶解、得浸膏、涂布，脱膜，得贴膜。同时本发明还提供了对该组合物采用成分鉴别、含量测定的质量控制方法。本发明的膜剂，使用方便、具有抑制增生，散结去瘀，镇痛，降低血清雌二醇含量、血浆粘度和血小板聚集数作用，是治疗乳腺增生病的有效药物。

Description

治疗乳腺增生的中药复方及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药复方制剂及其制备方法、质量控制方法，特别是涉及一种治疗乳腺增生的中药复方制剂及其制备方法、质量控制方法。

背景技术

乳腺囊性增生病，是乳腺主、间质慢性增生的总称，又称乳腺结构不良，属于祖国医学“乳癖”、“乳核”范畴。临床症状以乳房肿块和疼痛为主要特征，好发于20～40岁妇女，男性和儿童偶有患者。本病发病率高，在乳腺疾病中居于首位。现代医学治疗本病的主要方法是对于较大的肿块实施手术切除，但术后有复发的可能，很多病人出于对手术的恐惧心理以及对术后复发的担忧，往往拒绝手术。而且，在本病早期，当肿块较小时，也不适于手术。中医药治疗本病的方法目前多采用内服，临床上除根据辨证论治的原则广泛使用汤剂外，中成药如乳块消片、乳癖消片、乳增宁片、乳核内消液、百消丹等，分别治疗不同证型的乳癖证，均有一定效果。由于本病发生局部，其病位较为局限，比较适合外治，但目前适合本病外治使用的中成药尚属空白。

发明内容

本发明目的在于提供一种中药复方制剂；一种治疗乳腺增生的中药复方制剂及其外用贴膜剂制备方法，本发明另一目的在于提供该中药复方制剂的质量控制方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现：

本发明是通过如下原料组成(按重量份)：

青  皮80-120    柴  胡80-120    王不留行80-120

三  棱80-120    莪  术80-120    延胡索80-120

蒲  黄80-120    浙贝母80-120    夏枯草80-120

白  芷80-120    冰  片8-12

上述原料优选配比为(按重量份)：

青  皮100    柴  胡100    王不留行_(炒)100

三  棱100    莪  术100    延胡索_(醋制)100

蒲  黄100    浙贝母100    夏枯草100

白  芷100    冰  片10

本发明膜剂制备工艺如下：

以上十一味，除冰片外，其余青皮等十味加50-70％乙醇回流提取两次，每次1-3小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.10～1.11(60℃)，得中药提取浸膏备用；另取聚乙烯醇65-95重量份，用乙醇洗涤两次，加水320-480重量份，加热使溶解，加入聚乙烯吡咯烷酮8-12重量份，甘油40-60重量份，氮酮7-11重量份及冰片(用80％乙醇溶解)，混匀，与上述浓缩液合并，搅匀，得贴膜药物浸膏；匀均涂布，晾干，脱膜，制片，分装，即得贴膜；或将药物浸膏干燥，粉碎，加入淀粉和/或其他适宜的辅料，混匀，制粒，装胶囊或直接压片或制成颗粒等适宜的制剂。本组合物制成药剂的质量控制方法包括鉴别和/或含量测定。

鉴别方法包括下列方法中的一种和/或几种：

a、取贴膜4片，剪碎，加甲醇20-30ml，置水浴上加热回流1-1.5小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20-30ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次15-25ml，弃去乙醚液，再用水饱和正丁醇提取3次，每次20-30ml，合并正丁醇液，加入等体积的氨试液，振摇，放置使分层，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1-3ml使溶解，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材1g，加乙醚20-30ml，加热回流30-60分钟，弃去乙醚液，药渣挥干，加甲醇30-40ml，加热回流30-60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1-3ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10-15∶40-50∶20-25∶8-12氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％对二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇溶液(1→10)，在70℃加热至斑点显色清晰，分别置365nm日光及紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点或黄色荧光的主斑点。

b、取贴膜2片，加水20-30ml，加热使溶解，再加乙醚15-25ml，超声处理10-15分钟，分取乙醚层，挥干，残渣加醋酸乙酯1-3ml使溶解，作为供试品溶液。另取莪术对照药材0.5克，加30～60℃石油醚15-25ml，超声处理20-30分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以8-10∶1-2正己烷-醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。

c、取贴膜5片，剪碎，加乙醇40-60ml，置水浴上加热回流1-1.5小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸15-25ml使溶解，用60～90℃石油醚提取2次，每次10-15ml，取水层，用浓氨水调节pH值至9～10，再用乙醚提取3次，每次15-25ml，合并乙醚液，挥干，残渣加氯仿0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索乙素对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3μl，分别点于同一以含2％氢氧化钠的羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以7-9∶3-5∶1-1.5正己烷-氯仿-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏5-10分钟，取出，放置30-40分钟，置365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

d、取鉴别c项下供试品溶液，作为供试品溶液。另取贝母素甲、贝母素乙对照品，加氯仿分别制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照品溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以7-9∶3-5∶1-1.5苯-醋酸乙酯-二乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

e、取鉴别b项下供试品溶液，作为供试品溶液。另取欧前胡素对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以30～60℃3-4∶2-3石油醚-乙醚为展开剂，在25℃以下展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

f、取鉴别b项下供试品溶液，作为供试品溶液。另取冰片对照品，加氯仿制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以15-18∶2-4环己烷-醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

含量测定方法包括下列方法：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-磷酸(15-20∶80-85∶0.01)为流动相；检测波长284nm。理论板数按橙皮苷标准品峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取重量差异项下的本品，剪碎，取0.2-0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理1-1.5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每片含青皮以橙皮苷(C₂₈H₃₄O₁₅)计，不得少于6.0mg。

按本发明制备工艺所得的产品临床试用有效，可增加局部血药浓度，作为膜剂使用，携带方便、干净、卫生，具有抑制增生，散结去瘀，镇痛，降低血清雌二醇含量、血浆粘度和血小板聚集数等作用，是治疗乳腺增生病的有效药物。下列实验例进一步说明本发明制备工艺的先进性及其在治疗乳腺增生病的药物中的应用。

实验例1：提取工艺路线的设计

本方剂原为临床水煎使用，治疗乳腺增生症有效，但用量较大，考虑到该病症的解剖学结构特点，我们将其改为外用制剂。橙皮苷、柴胡皂苷、贝母素、延胡索乙素、白芷香豆素、夏枯草苷等均为醇溶性成分，又根据皮肤对醇溶性成分更易吸收的特点，故而确定工艺提取溶剂选择稀乙醇。

虽然处方中青皮、柴胡、三棱、莪术、白芷含有挥发油，但实验显示，除莪术外，其余药味单提均难以获得游离挥发油，将该5味药合并水蒸气蒸馏提取挥发油的收油率亦不足千分之一，提取无意义，并使水溶性杂质提出率增加，给制剂方面造成一定的困难；同时，莪术有行气破血、消积止痛的功效，为进一步验证上述设计，以镇痛作用为指标，补充了单独醇提工艺制成制剂(工艺I)和醇提工艺加莪术等蒸馏挥发油制成制剂(工艺II)的药效学对比实验，方法与结果如下：

取小鼠80只，雌雄各半，18-22克。于试验前24小时在小鼠背部脱毛，脱毛面积2×2cm²。24小时后将小鼠随机分为8组，每组10只。对照组为赋形剂组、阳性药吲哚美辛、工艺I高、中、低剂量组、工艺II高、中、低剂量组。给药1.5小时后，各鼠均腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只。观察15分钟内各鼠出现的扭体反应数。

结果显示，工艺I和工艺II具有一定的镇痛作用，高剂量组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。但工艺I和工艺II组间无显著性差异。见表1。

                     表1：对醋酸扭体反应的镇痛作用

组别	剂量(含生药g/kg)	动物数(只)	扭体反应数(只)	扭体反应数( x±s)
					对照组	-	10	10	29.60±10.43
阳性药组	8.0mg/kg	10	4***	0.6±0.97***
					高剂量组(工艺II)	8.0	10	10	15.8±7.86*
中剂量组(工艺II)	4.0	10	9	18.8±8.76
					低剂量组(工艺II)	2.0	10	10	20.0±11.51
高剂量组(工艺I)	8.0	10	10	14.1±7.43*
					中剂量组(工艺I)	4.0	10	10	17.0±10.51
低剂量组(工艺I)	2.0	10	10	17.0±12.05

注：与空白组相比***P＜0.001，*P＜0.05

由此可见，为简化工艺过程，降低生产成本，挥发油可不另行单独提取。实验例2：提取工艺技术条件的研究

正交设计试验

                 表2：正交试验因素水平

因素	水平
				乙醇浓度	60％	70％	80％
乙醇用量	5倍	8倍	10倍
				提取时间	1.0小时	1.5小时	2.0小时

指标成分测定原理、方法与实验结果

本试验以柴胡总皂苷为结果判定指标之一，由于本处方提取药味共有十味药组成，含杂质较多，故用1％KH₂PO₄及氨试液洗涤，以除去杂质，免除了阴性干扰。

柴胡皂苷测定方法如下：精密称取柴胡皂苷a标准品1.00mg，用乙醇溶解并定容于10ml容量瓶中，作为标准溶液。取此标准溶液，70℃水浴蒸干，加入1％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1ml，70℃水浴温热10min，取出，冷却后加入磷酸4ml，于70℃水浴中反应30min，取出，放置冷却，用磷酸定容5ml后，进行全波长扫描。并测得其最大吸收波长为545nm。

正交试验结果与方差分析

柴胡总皂苷方差分析见表3；

80％乙醇浸出物方差分析见表4。

表3：柴胡总皂苷方差分析

方差来源	离均差平方和	自由度	方差	F值	临界值	显著性
							A	0.0109	2	0.0055	5.0230	F0.05(2，20)＝3.49	*0.01＜P＜0.05
B	0.0085	2	0.0043	3.9171	F0.01(2，20)＝5.85	*0.01＜P＜0.05
							C	0.0028	2	0.0014	1.2903
e＝e1+e2	0.0217	20	0.0011

表4：80％乙醇浸出物方差分析

方差来源	离均差平方和	自由度	方差	F值	临界值	显著性
							A	14.58	2	7.29	6.87	F0.05(2，20)＝3.49	**(P＜0.01)
B	13.84	2	6.92	6.52	F0.01(2，20)＝5.85	**(P＜0.01)
							C	3.58	2	1.79	1.69
e＝e1+e2	21.22	20	1.06

由上述实验结果及方差分析可知，A(乙醇浓度)、B(乙醇用量)两因素对实验结果有显著影响，可初步认为选用A₁、B₃，即10倍量60％的乙醇为较佳提取工艺；C(提取时间)影响不大，三个水平间无显著性差异，但直观结果C₃＞C₂和C₁，考虑到适当延长提取时间有助于药物成分的溶出，故提取时间选择C₃，最佳提取工艺确定为A₁B₃C₃，即处方药味以8～10倍量60％乙醇回流提取2次，每次2小时。

实验例3：制剂成型工艺研究

1、聚乙烯醇(PVA05-88)不同用量的比较试验

表5

PVA用量	成膜性能	载药量
			30％	好	大
40％	好	小
			50％	好	小

PVA以30％为最佳用量。

2、甘油不同用量的比较试验

表6

甘油用量	韧性	脱膜情况	药膜含药量
				10％	差	差	大
15％	好	好	较大
				20％	好	好	小

甘油以15％为最佳用量。

3、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的使用：PVP具有粘合、增稠、助悬、分散、助溶、络合、成膜等多种特性和作用，于本品中加入少量PVP，有助于中药提取浸膏在高分子成膜材料溶液中的分散与助溶，但其用量多少与膜剂成型关系不大，且PVP属进口药用辅料，价格较高，为尽量降低成本，故选用1％用量添加。

4、氮酮作为透皮吸收促进剂，一般用量为0.5％～2％，因其用量多少与膜剂成型关系不大，故选用1％用量添加。

实验例4：柴胡的定性鉴别试验

本鉴别是以柴胡药材为阳性对照，鉴别制剂中含有柴胡的定性鉴别。取本品4片，剪碎，加甲醇30ml，置水浴上加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次15ml，弃去乙醚液，再用水饱和正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，加入等体积的氨试液，振摇，放置使分层，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材1g，加乙醚30ml，加热回流30分钟，弃去乙醚液，药渣挥干，加甲醇30ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％对二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇溶液(1→10)，在70℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材相应位置上，显相同颜色的主斑点或黄色荧光的主斑点。阴性对照供试液无干扰。

实验中，采用柴胡皂苷a、d化学对照品作为对照，但鉴别效果不如采用柴胡对照药材，故此项鉴别使用了柴胡对照药材。

实验例5：莪术的定性鉴别试验

本鉴别是以莪术对照药材为阳性对照，鉴别制剂中存在莪术的定性鉴别。取本品2片，加水15ml，加热使溶解，再加乙醚20ml，超声处理10分钟，分取乙醚层，挥干，残渣加醋酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。取莪术对照药材0.5克，加入石油醚(30-60℃)20ml，超声处理20分钟，分取石油醚层，浓缩至约1ml，作为对照药材溶液。吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(8.5∶1.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点清晰。在日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材相应位置上，显相同颜色的斑点。

实验中，用0.5％CMC-Na的硅胶G板，以石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，2％香草醛硫酸试液显色，供试品与阳性对照在相同位置显相同的紫红色斑点，阴性对照无干扰；曾用过石油醚(60～90℃)-氯仿-水(6∶1∶0.5)；石油醚(60～90℃)等展开剂，但鉴别效果不如采用正己烷-醋酸乙酯(8.5∶1.5)为展开剂。

实验例6：元胡的定性鉴别试验

本鉴别是以延胡索乙素为阳性对照，鉴别制剂中含有元胡的定性鉴别。取本品5片，剪碎，加乙醇50ml，置水浴上加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸20ml使溶解，用石油醚(60～90℃)提取2次，每次10ml，取水层，用浓氨水调节pH值至9～10，再用乙醚提取3次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加氯仿0.5ml使溶解，作为供试品溶液。取延胡索乙素，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各3μl，分别点于同一以含2％氢氧化钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-氯仿-甲醇(7.5∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏5分钟，取出，放置30分钟，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

用0.5％CMC-Na的硅胶G板，以乙醚-环己烷-甲醇(5∶3∶0.5)为展开剂，用碘蒸气显色，挥干后，在紫外灯365nm下检视，供试品与阳性对照在相同位置显相同的黄色荧光斑点，阴性对照无干扰，但鉴别效果不如采用正己烷-氯仿-甲醇(7.5∶4∶1)为展开剂。

实验例7：浙贝的定性鉴别试验

本鉴别是以贝母素甲、乙为阳性对照，鉴别制剂中存在浙贝的定性鉴别。取贝母素甲、贝母素乙对照品，加氯仿制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取延胡索鉴别项下的供试品溶液10μl及上述对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-二乙胺(8∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液，日光下检视。供试品与阳性对照在相同位置处有相同的颜色斑点。贝母素甲、乙和延胡索乙素都是生物碱类成分，样品提取方法相同，因此本试验中的供试品溶液采用了延胡索鉴别项下的供试品溶液。

实验中还选用2％NaOH的0.5％CMC-Na的硅胶G板，以正己烷-氯仿-甲醇(7.5∶4∶1)为展开剂，两次展开，分别用稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液显色，供试品与阳性对照在相同位置显相同的黄色斑点，阴性对照无干扰，但斑点分离度不如上法好。还用过醋酸乙酯-甲醇-浓氨试液(17∶2∶1)；氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(3∶4∶1.5∶1)下层溶液为展开剂，但鉴别效果不如采用苯-醋酸乙酯-二乙胺(8∶4∶1)为展开剂。

实验例8：白芷的定性鉴别试验

本鉴别是以欧前胡素为阳性对照，鉴别制剂中含有白芷的定性鉴别。取欧前胡素对照品，加醋酸乙酯制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取莪术鉴别项下供试品溶液10ul及上述对照品溶液5ul，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-乙醚(3∶2)为展开剂，在25℃以下展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品与阳性对照在相同位置处有相同的颜色荧光斑点。

实验中，还使用过硅胶H板，硅胶GF₂₅₄板，用过甲苯-醋酸乙酯-甲酸(6.5∶1.5∶0.5)为展开剂，但鉴别效果不如采用石油醚(30～60℃)-乙醚(3∶2)为展开剂。

实验例9：冰片的定性鉴别试验

本鉴别是以冰片对照品为阳性对照，鉴别制剂中含有冰片的定性鉴别。取冰片对照品，加氯仿制成1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。吸取莪术鉴别项下供试品溶液及上述对照品溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯(17∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热数分钟，至斑点清晰。供试品与对照品色谱相应位置上，显相同的颜色斑点。

实验例10：含量测定的实验研究

1、含量测定对象及测定成分选择依据

本制剂由青皮、柴胡、王不留行、三棱、莪术、延胡索、蒲黄、浙贝母、夏枯草、白芷和冰片十一味中药组成，其中青皮为君药，有疏肝破气、消积化滞之功。青皮的化学有效成分为其所含的橙皮苷。本制剂选取君药青皮，并对其所含橙皮苷制订含量测定。

2、标准曲线及线性范围

精密称取橙皮苷对照品2.08mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准品溶液，浓度为0.208mg/ml。精密吸取上述橙皮苷溶液2、5、8、10、15μl，分别注入液相色谱仪，按上述条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，橙皮苷进样量为横坐标，绘制标准曲线(见图1)，并计算回归方程为：A＝1610.1x+50.055  R＝0.9997

                      表7：橙皮苷线性范围考察结果

进样量(μl)	2	5	8	10	15
						进样量(μg)	0.416	1.040	1.664	2.080	3.120
峰面积均值	694.26	1719.35	2799.63	3377.45	5505.54

由图1可知，橙皮苷在0.416～3.120μg之间呈直线关系。

3、进行精密度试验、稳定性试验、重现性试验、回收率试验、空白试验、对照品与药材对照试验，对3批样品按质量标准草案所述含量测定方法进行测定，其结果如下：

           表8：样品含量测定结果

批号	含量(mg/片)	平均含量(mg/片)
			991116	9.649.71	9.67
991214	9.929.57	9.75
			000117	9.869.95	9.91

根据上表结果，本品含量限度已可定出，但考虑到药材及生产的实际情况，暂定本品含量限度为每片含青皮以橙皮苷(C₂₈H₃₄O₁₅)计，不得少于6.0mg。

实验例11：FRANZ扩散池法进行体外透皮渗透试验

动物离体皮肤的制备：取大鼠(体重185～205g)、小鼠(体重约30g)，用脱毛剂分别脱去大鼠腹部和小鼠背部的毛，饲养一天，试验前将它们处死，剥离大鼠腹部和小鼠背部的皮肤，小心剔除皮下脂肪，用蒸馏水和生理盐水洗净皮肤，浸泡于生理盐水中，备用。

实验装置及方法：采用循环式流通扩散装置，将已知含量的由本发明制备工艺所得贴膜剪成与接收室口表面积大小相同的小片(约0.1355g，面积4.4cm²)，精密称定重量，将供试药膜贴于离体鼠皮上，使之与皮肤密切接触，放置在改进Franz扩散池的扩散室与接受室之间，上下层夹紧，如图1所示，接收室有效面积为4.4cm²，有效容积为14.2ml。在接收室中加入含0.5％吐温80的生理盐水14.2ml，驱除气泡，开启磁力搅拌器连续搅拌并调节水浴温度37℃±1℃恒温，磁力搅拌器转速约为120r/min。在1、2、4、6、8、10、12、24小时分别精密吸取接受液1ml，同时补加等体积的接受液。样品经微孔滤膜过滤，精密吸取50μl样品液，注入高效液相色谱仪，测定出接受液中橙皮苷的含量，计算出累积渗透量(Q)，并计算透皮实验12小时和24小时橙皮苷的透过率，结果见表9、表10和图2。

表9：不同时间大鼠皮肤收液池中橙皮苷累积渗透量(n＝3)

时间	1h	2h	4h	6h	8h	10h	12h	24h
									峰面积	10061	44499	177017	305389	418601	535121	599481	933839
累积渗透量(μg/cm2)	0.363	1.63	6.52	11.5	16.0	20.5	23.1	35.4
									RSD(％)	1.11	0.94	0.71	0.64	0.66	0.68	0.79	0.94
12小时橙皮苷累积渗透量占总贴敷量的百分率＝5.40％24小时橙皮苷累积渗透量占总贴敷量的百分率＝8.28％

表10：不同时间小鼠皮肤收液池中橙皮苷累积渗透量(n＝3)

时间	1h	2h	4h	6h	8h	10h	12h	24h
									峰面积	87220	237521	354171	556154	725797	809573	884833	1167814
累积渗透量(μg/cm2)	3.15	8.81	13.4	21.0	27.7	31.1	34.1	44.5
									RSD(％)	1.52	0.97	0.79	0.83	0.67	0.98	0.76	0.88
24小时橙皮苷累积渗透量占总贴敷量的百分率＝7.98％24小时橙皮苷累积渗透量占总贴敷量的百分率＝10.4％

由表9、10，图2可以看出，由本发明制备工艺所得贴膜外贴于大鼠和小鼠皮肤后，膜中指标成分橙皮苷1小时即可透过皮肤，且透过量随时间的延长而增加，并能维持24小时以上。表明由本发明制备工艺所得贴膜中药物有效成分可以透过皮肤而发挥作用，适于透皮给药。

由本发明制备工艺所得贴膜中的橙皮苷经大鼠腹部皮肤的12小时、24小时累积渗透量占总贴敷量分别为5.4％、8.28％；经小鼠背部皮肤的12小时、24小时累积渗透量占总贴敷量分别为7.98％、10.4％。表明由本发明制备工艺所得贴膜具有较好的透皮性能。

实验例12：薄层色谱法分析药物成分

1、标准对照液：

①取延胡索乙素对照品加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液。

②取冰片对照品加氯仿制成每1ml含2mg的溶液。

2、样品液的制备：

①集取由本发明制备工艺所得贴膜24小时的透皮吸收液50ml，加0.1mol/L盐酸调节pH值至2～3，用石油醚(60～90℃)提取3次，每次20ml，分取石油醚层，水浴上挥干，残渣加氯仿0.5ml，作为样品液A。

②分取上述水层，用浓氨水调节pH值至9～10，再用乙醚提取3次，每次30ml，合并乙醚液，挥干，残渣加氯仿0.5ml使溶解，作为样品液B。

3、薄层层析：条件见下表

表11

	薄层板	点样	展开剂	显色剂/紫外灯	色谱斑点
						I	硅胶G	冰片对照液3ul，样品液A 5ul	环己烷-醋酸乙酯(17∶3)	5％香草醛硫酸溶液喷雾烘烤显色	两个紫色斑点(龙脑、异龙脑)

4、结果

试验I、II的薄层色谱图，冰片、延胡索乙素等斑点清晰可见，说明由本发明制备工艺所得贴膜中的冰片等脂溶性成分以及延胡索乙素等生物碱类成分能够透过皮肤被吸收。

实验例13：家兔乳腺增生模型试验

雌性家兔30只，正常饲养两周后，取5只作为正常对照组肌肉注射生理盐水0.5ml(kg·d)，其余25只肌肉注射苯甲酸雌二醇0.3ml(kg·d)，连续25天，停止注射，随机分为高、中、低剂量组、模型组和阳性对照药组5个组，每组5只，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别给与由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏1.8g生药/kg、3.6g生药/kg及5.4g生药/kg(均匀涂抹在家兔的6个乳腺上)，用塑料膜覆盖并用纱布固定4～6小时，每天给药1次，阳性药对照组每只家兔的每个乳腺给与2×5cm²乳癖消贴膏，模型组和正常对照组给与生理盐水，连续20天。

1、肉眼观察分级结果，见表12。

表12：由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏对乳腺增生作用肉眼观察结果

组别	剂量G/kg	动物数(只)	分级			U值
							-	+	++
			模型对照组	-	5					0	1	4
正常对照组	-	5				5	0	0	2.74**
			药物浸膏组	1.8	5					0	2	3	0.55
药物浸膏组	3.6	5				0	2	3	0.55
			药物浸膏组	5.4	5					4	0	1	2.08*
乳癖消组	2×2.5cm2/个乳腺	5				3	1	1	1.97*

注：与模型对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

从肉眼观察兔乳头大体形态，由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏高剂量组(5.4g生药/kg)可以明显抑制乳腺的肿大(P＜0.01)，由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏低剂量组(1.8g生药/kg)和中剂量组(3.6g生药/kg)与模型组比较无明显差异(P＞0.05)。

2、光镜结果：

模型组5例中有4例，乳腺小叶增生，数量增多，腺泡上皮增生为双层或多层，导管上皮增生，有上皮簇形成，导管扩张，数目增多，间质纤维组织增生，较致密；另1例仅见乳腺小叶增生。

由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏低剂量组和中剂量组与模型组相似。

由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏高剂量组5例中有4例，乳腺小导管上皮增生较轻，导管扩张不明显，腺泡上皮为单层或双层，无明显增生。另1例可见乳腺小叶增生及导管的扩张。

乳癖消组5例中有3例乳腺小导管上皮为单层或双层，无上皮簇形成，导管扩张不明显，腺泡亦无明显增生；另2例乳腺导管上皮增生呈复层或多层，出现上皮簇，导管扩张较明显，腺泡无明显增生。

正常对照组5例乳腺小导管均为单层柱状上皮细胞，腺泡上皮为单层立方上皮，外被基底膜，其间可见肌上皮细胞，间质为疏松结缔组织，乳腺小叶腺体和间质比例正常。

光镜结果初步表明高剂量由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏可以较显著地抑制乳腺增生，低剂量由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏与阳性对照药相似也有一定的抑制乳腺增生作用。

3、电镜结果：

正常对照组乳腺腺泡上皮细胞立方形或柱状，腔面有少或中量微绒毛，细胞间有连接复合体，细胞基底部可见肌上皮细胞和肌膜，胞质内细胞器量中等，线粒体、高尔基体、内质网、分泌泡正常。

模型组乳腺腺体和导管上皮细胞层次增多，极性无紊乱，可见微绒毛不规则，连接复合体正常，胞质内粗面内质网、线粒体、高尔基体数目增多，密电子分泌颗粒数目增多，内质网内纤维细胞和胶原细胞数量增加，肌上皮细胞增多，基极增厚。

高剂量组乳腺腺体和导管上皮细胞层次正常或增多，极性正常，微绒毛排列较规则，连接复合体正常，胞质内细胞器数目大致正常，可见密电子分布颗粒，间质内纤维细胞和胶原纤维数量正常或略增多，肌上皮细胞正常，基极略增厚。

电镜结果表明，高剂量由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏可使增生的乳腺基本恢复正常。

实验例14：血清雌二醇含量测定实验。

表13血清雌二醇含量( X±s)

组别	动物	剂量g/kg	雌二醇含量(pg/ml)
				正常对照组	5	-	33.62±5.42**
模型对照组	5	-	48.59±6.74
				药物浸膏组	5	1.8	34.93±1.71**
药物浸膏组	5	3.6	35.16±1.92**
				药物浸膏组	5	5.4	33.22±3.88**
阳性对照组	5	4×2.5cm2/个乳腺	29.97±7.06**

注：与模型对照组比较^**P＜0.01

由表13可见，高、中、低剂量组、阳性对照组、正常对照组血清雌二醇含量与模型对照组均有显著性差异，表明高、中、低剂量组及阳性对照组均可显著降低血清雌二醇含量。

实验例15：血液粘度检测实验

由表14可见，模型组的血浆粘度，血浆纤维蛋白原及血小板聚集数与正常对照组比较均有变化，而低剂量组和中剂量组的血小板聚集数及高剂量的血浆粘度、血小板聚集数与模型对照组相比均有显著差异(P＜0.05)，其他各项指标与正常对照组或模型对照组无显著性差异(P＞0.05)，提示由本发明制备工艺所得贴膜是通过降低血浆粘度和血小板聚集数而具有散结化瘀作用，从而抑制乳腺增生。

                                                                         表14：血液粘度检测结果( X±s)

组别	血液粘度(mpa·s)				血浆比粘度(mpa·s)	红细胞压积(％)	血浆纤维蛋白原(G/L)	血小板聚集
										1(5s)	2(10s)	3(35s)	4(120s)	扩大型(％)	聚集数(个)
	模型对照	17.0±6.5	10.5±4.0	6.8±2.0				5.3±1.9	1.79±0.06*							42.7±3.2	4.18±0.18**	21.8±1.9*	47.6±2.4*
药物浸膏组(低)					14.1±6.6	8.2±1.8	5.2±0.8			4.1±0.7*	1.73±0.07	41.6±2.5	3.62±0.55	19.6±1.1	42.7±3.6#
	药物浸膏组(中)	14.8±7.1	8.6±1.7	5.1±0.9				4.2±1.1	1.72±0.09							41.9±1.9	3.69±0.61	19.7±1.3	42.9±2.5#
药物浸膏组(高)					13.0±3.7	9.5±2.8	5.9±1.6			4.8±1.7	1.69±0.03#	39.7±3.0	3.57±0.52	19.8±1.9	43.9±2.3#
	阳性对照	11.1±1.3	8.4±0.8	5.6±0.5				4.3±0.5	1.69±0.02##							42.2±3.0	3.44±0.74	20.3±1.7	44.7±3.3
正常对照					12.6±1.6	9.0±0.7	7.0±2.0			5.3±0.9	1.70±0.04#	43.4±2.9	3.20±0.38##	19.4±1.5#	42.8±2.8#

注：1.与正常对照组比较^**P＜0.01；^*P＜0.05

2.与模型对照组比较^##P＜0.01；^#P＜0.05

由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏可以抑制家兔肌注雌二醇引起的乳腺增生，降低血清雌二醇含量，降低血浆黏度及血小板聚集数。

实验例16：大鼠棉球肉芽肿试验

取120～150g雄性大鼠60只，随机分为6组，每组10只，乙醚麻醉，仰卧位固定，胸部碘酒消毒，75％酒精棉球脱碘，切1cm左右小口，用眼科镊将20mg的高压灭菌棉球(含青链霉素混合液0.2ml，浸泡，70℃烘干)，从切口处植入左右腋窝皮下，随即缝合皮肤，从手术当日起开始给药，即将药物浸膏涂在塑料膜上贴于手术刀口周围皮肤上，用胶布固定4～6小时，阴性对照不给药，高剂量组涂由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏8.0g生药/kg，中剂量组涂由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏4.0g生药/kg，低剂量组涂由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏2.0g生药/kg，乳癖消组敷3.3×4cm²/只，扶他林组给予0.3g/kg扶他林，以纱布胶布固定，各组每天给药1次，连续给药六天。第七天打开原切口，将棉球连同结缔组织一起取出，剔除脂肪组织，放烘箱中70℃烘干，称重，将称得的重量减去棉球原重量即得肉芽肿重量，t检验比较各组肉芽肿重量。

表15：贴膜药物浸膏对大鼠棉球肉芽肿的影响( X±s)

组别	动物(只)	剂量(g/kg)	肉芽肿重量(mg)
				阴性对照组	10	-	80.8±19.3
药物浸膏组	10	8	62.2±19.2*
				药物浸膏组	10	4	72.6±18.5*
药物浸膏组	10	2	83.5±67.0
				扶他林组	10	0.3	39.7±29.6**
乳癖消组	10	3.3×4cm2/只	64.5±27.1

注：与阴性对照比较^**P＜0.01，^*P＜0.05

高、中剂量组与阴性对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，显示其具有一定的抑制肉芽增生的作用。

实验例17：小鼠扭体法镇痛实验；

将小鼠按体重、性别随机分成6组，每组10只：(1)对照组涂蒸馏水0.1ml/20g；(2)低剂量组小鼠涂1.0g/kg；(3)中剂量组小鼠涂2.0g/kg；(4)高剂量组小鼠涂4.0g/kg；(5)乳癖消组小鼠贴乳癖消贴膏2.5×4cm²/只；(5)扶他林组小鼠涂扶他林乳胶剂2.0g/kg。实验前各组小鼠腹部根据用药需要进行脱毛，实验时将受试物涂抹于小鼠腹部脱毛区皮肤，并用纱布和胶布固定；40min后腹腔注射0.5％醋酸0.2ml/只，观察15min内小鼠扭体次数，结果进行t检验。

表16：贴膜药物浸膏浸膏对小鼠扭体次数的影响

组别	剂量(g/kg)	动物数(只)	扭体次数
				对照组	-	10	23.6±13.9
药物浸膏组	1.0	10	5.9±7.56**
				药物浸膏组	2.0	10	5.5±7.91*
药物浸膏组	4.0	10	5.2±5.71*
				扶他林组	2.0	10	5.0±5.96**
乳癖消组	2.5×4cm2/只	10	11.9±12.6

与对照组比较，^*p＜0.05，**p＜0.01

乳癖消有使小鼠扭体反应减少的趋势，但无统计意义，扶他林可明显减少小鼠扭体次数，由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏三个剂量组与扶他林有同样作用。

实验例18：小鼠热板实验

热板预热10分钟，使温度在55℃±5℃。筛选合格小鼠：取18-23g雌性小鼠数只，每次1只放在热板上，小鼠自放在热板上至出现舔后足所需时间(秒)作为该鼠的痛阈值。凡舔后足时间小于5秒或大于30秒或跳跃者弃之不用。将合格的小鼠(共60只)随机分为6组，重复测其正常痛阈值，取两次正常痛阈平均值，作为该鼠给药前痛阈值。实验前将小鼠腹部根据用药需要进行脱毛，实验前将药物涂于脱毛处，盖上塑料膜，胶布固定。由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏高剂量组给予4g生药/kg，中剂量组2g生药/kg，低剂量组1g生药/kg、扶他林组2g/kg均腹部涂抹，乳癖消贴膏腹部粘贴，给药后15、30、60分钟分别测小鼠痛阈值。如60秒仍无反应，将小鼠取出，以免烫伤，其痛阈值以60秒计。结果进行t检验。

表17：贴膜药物浸膏浸膏对小鼠热板法引起的疼痛的影响

组别	剂量(g/kg)	动物数(只)	给药前痛阈(s)	给药后不同时间痛阈(s)
								15min	30min	60min	120min
				对照组	-	10	14.1±4.9					15.7±5.9	16.4±8.7	17.3±9.2	17.7±8.8
药物浸膏组	1.0	10	11.9±2.8					13.6±7.2	15.1±6.6	17.1±7.0*	16.2±9.7
				药物浸膏组	2.0	10	11.1±2.6					12.8±8.1	15.1±7.1	17.5±7.6*	16.3±8.9
药物浸膏组	4.0	10	10.4±2.4					11.3±3.8	15.1±7.0	17.8±8.7*	15.9±5.0
				扶他林	2.0	10	14.5±4.2					29.9±17.4*	23.8±14.7	16.3±9.1	16.4±5.7
乳消癖	2.5×4cm2/只	10	15.1±2.7					16.3±7.6	13.6±7.6	15.7±6.6	16.1±7.2

注：与给药前相比*P＜0.05，**P＜0.01

由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏低、中、高剂量组和扶他林乳胶剂组分别在60min、15min时与给药前相比均有显著差异(P＜0.05)，表明各组由本发明制备工艺所得贴膜药物浸膏有明显的镇痛作用，乳癖消与给药前相比未显示出镇痛作用(P＞0.05)。

附图说明：

图1橙皮苷对照品标准曲线图

图2不同时间吸收液中橙皮苷累积渗透量变化趋势图

实施例1：

青  皮250g    柴  胡250g    王不留行(炒)250g

三  棱250g    莪  术250g    延胡索(醋)250g

蒲  黄250g    浙贝母250g    夏枯草250g

白  芷250g    冰  片25g

以上十一味，除冰片外，其余青皮等十味加60％乙醇回流提取两次，每次10倍量2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.10～1.11(60℃)，得中药提取浸膏备用；另取聚乙烯醇200g，用乙醇洗涤两次，加水1000ml，加热使溶解，加入聚乙烯吡咯烷酮25g，甘油100ml，氮酮25ml及冰片(用80％乙醇溶解)，混匀，与上述浓缩液合并，搅匀，涂布，晾干，脱膜，制成1000片(4cm×6cm)，每张药膜含生药2.525g。

实施例2：

青  皮80g     柴  胡120g    王不留行_(炒)80g

三  棱120g    莪  术80g     延胡索_(醋制)120g

蒲  黄80g     浙贝母120g    夏枯草80g

白  芷120g    冰  片8g

以上十一味，除冰片外，其余青皮等十味加60％乙醇回流提取两次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.10～1.11(60℃)，得中药提取浸膏备用；另取聚乙烯醇65g，用乙醇洗涤两次，加水320g，加热使溶解，加入聚乙烯吡咯烷酮8g，甘油40g，氮酮7g及冰片(用80％乙醇溶解)，混匀，与上述浓缩液合并，搅匀，得贴膜药物浸膏，匀均涂布，晾干，脱膜，制片，分装，即得贴膜。

实施例3：

青  皮120g    柴  胡80g    王不留行_(炒)120g

三  棱80g     莪  术120g    延胡索_(醋制)80g

蒲  黄120g    浙贝母80g     夏枯草120g

白  芷80g     冰  片12g

以上十一味，除冰片外，其余青皮等十味加60％乙醇回流提取两次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.10～1.11(60℃)，得中药提取浸膏备用；另取聚乙烯醇95g，用乙醇洗涤两次，加水480g，加热使溶解，加入聚乙烯吡咯烷酮12g，甘油60g，氮酮11g及冰片(用80％乙醇溶解)，混匀，与上述浓缩液合并，搅匀，得贴膜药物浸膏，匀均涂布，晾干，脱膜，制片，分装，即得贴膜。

实施例4：

a、取贴膜4片，剪碎，加甲醇30ml，置水浴上加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次15ml，弃去乙醚液，再用水饱和正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，加入等体积的氨试液，振摇，放置使分层，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材1g，加乙醚30ml，加热回流30分钟，弃去乙醚液，药渣挥干，加甲醇30ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以15∶40∶22∶10氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％对二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇溶液1→10，在70℃加热至斑点显色清晰，分别置365nm日光及紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点或黄色荧光的主斑点。

b、取贴膜2片，加水15ml，加热使溶解，再加乙醚20ml，超声处理10分钟，分取乙醚层，挥干，残渣加醋酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取莪术对照药材0.5克，加30～60℃石油醚20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以8.5∶1.5正己烷-醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。

c、取贴膜5片，剪碎，加乙醇50ml，置水浴上加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸20ml使溶解，用60～90℃石油醚提取2次，每次10ml，取水层，用浓氨水调节pH值至9～10，再用乙醚提取3次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加氯仿0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索乙素对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3μl，分别点于同一以含2％氢氧化钠的羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以7.5∶4∶1正己烷-氯仿-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏5分钟，取出，放置30分钟，置365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

d、取鉴别c项下供试品溶液，作为供试品溶液。另取贝母素甲、贝母素乙对照品，加氯仿分别制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照品溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以8∶4∶1苯-醋酸乙酯-二乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

e、取鉴别b项下供试品溶液，作为供试品溶液。另取欧前胡素对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以30～60℃下3∶2石油醚-乙醚为展开剂，在25℃以下展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

f、取鉴别b项下供试品溶液，作为供试品溶液。另取冰片对照品，加氯仿制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以17∶3环己烷-醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

实施例5：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-磷酸(17∶83∶0.01)为流动相；检测波长284nm。理论板数按橙皮苷标准品峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取重量差异项下的本品，剪碎，取约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每片含青皮以橙皮苷(C₂₈H₃₄O₁₅)计，不得少于6.0mg。

实施例6：

青  皮100g    柴  胡100g    王不留行_(炒)100g

三  棱100g    莪  术100g    延胡索_(醋制)100g

蒲  黄100g    浙贝母100g    夏枯草100g

白  芷100g    冰  片10g

PVA_05-88 80g；PVP_k-30 10g；甘油4ml(50g)；氮酮1ml(9g)；水400g

按本发明制备工艺制成贴膜400片(4cm×6cm)，每张药膜含生药2.525g。乳腺增生患者使用，每日每侧增生处1贴。

Claims (10)

1、一种药物组合物，其特征在于该药物组合物是由如下重量份的原料药制成：

青  皮80-120    柴  胡80-120    王不留行80-120

三  棱80-120    莪  术80-120    延胡索  80-120

蒲  黄80-120    浙贝母80-120    夏枯草  80-120

白  芷80-120    冰  片8-12。

2、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物是由如下重量份的原料药制成：

青  皮100    柴  胡100    炒王不留行100

三  棱100    莪  术100    醋制延胡索100

蒲  黄100    浙贝母100    夏枯草100

白  芷100    冰  片10。

3、如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于该组合物可以制成任何一种临床上或药学上可接受的剂型，如片剂、软胶囊剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、口服液体制剂，膜剂。

4、如权利要求1或2所述的药物组合物膜剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

取原料药十一味，除冰片外，其余青皮等十味加50-70％乙醇回流提取两次，每次1-3小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩至60℃时相对密度为1.10～1.11，得中药提取浸膏备用；另取聚乙烯醇65-95重量份，用乙醇洗涤两次，加水320-480重量份，加热使溶解，加入聚乙烯吡咯烷酮8-12重量份，甘油40-60重量份，氮酮7-11重量份及用80％乙醇溶解的冰片，混匀，与上述浓缩液合并，搅匀，得贴膜药物浸膏，匀均涂布，晾干，脱膜，制片，分装，即得贴膜。

5、如权利要求4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

取原料药十一味，除冰片外，其余青皮等十味加60％乙醇回流提取两次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩至60℃时相对密度为1.10～1.11，得中药提取浸膏备用；另取聚乙烯醇80重量份，用乙醇洗涤两次，加水400重量份，加热使溶解，加入聚乙烯吡咯烷酮10重量份，甘油50重量份，氮酮9重量份及用80％乙醇溶解的冰片，混匀，与上述浓缩液合并，搅匀，得贴膜药物浸膏，匀均涂布，晾干，脱膜，制片，分装，即得。

6、权利要求1或2所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于该方法中的鉴别方法包括如下鉴别中的一种或几种：

a、取贴膜4片，剪碎，加甲醇20-30ml，置水浴上加热回流1-1.5小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20-30ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次15-25ml，弃去乙醚液，再用水饱和正丁醇提取3次，每次20-30ml，合并正丁醇液，加入等体积的氨试液，振摇，放置使分层，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1-3ml使溶解，作为供试品溶液；另取柴胡对照药材1g，加乙醚20-30ml，加热回流30-60分钟，弃去乙醚液，药渣挥干，加甲醇30-40ml，加热回流30-60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1-3ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10-15∶40-50∶20-25∶8-12氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％对二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇溶液1→10，在70℃加热至斑点显色清晰，分别置365nm日光及紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点或黄色荧光的主斑点；

b、取贴膜2片，加水20-30ml，加热使溶解，再加乙醚15-25ml，超声处理10-15分钟，分取乙醚层，挥干，残渣加醋酸乙酯1-3ml使溶解，作为供试品溶液；另取莪术对照药材0.5克，加30～60℃石油醚15-25ml，超声处理20-30分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以8-10∶1-2正己烷-醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；

c、取贴膜5片，剪碎，加乙醇40-60ml，置水浴上加热回流1-1.5小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸15-25ml使溶解，用60～90℃石油醚提取2次，每次10-15ml，取水层，用浓氨水调节pH值至9～10，再用乙醚提取3次，每次15-25ml，合并乙醚液，挥干，残渣加氯仿0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取延胡索乙素对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3μl，分别点于同一以含2％氢氧化钠的羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以7-9∶3-5∶1-1.5正己烷-氯仿-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏5-10分钟，取出，放置30-40分钟，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

d、取鉴别c项下供试品溶液，作为供试品溶液；另取贝母素甲、贝母素乙对照品，加氯仿分别制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照品溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以7-9∶3-5∶1-1.5苯-醋酸乙酯-二乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

e、取鉴别b项下供试品溶液，作为供试品溶液；另取欧前胡素对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以30～60℃3-4∶2-3石油醚-乙醚为展开剂，在25℃以下展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

f、取鉴别b项下供试品溶液，作为供试品溶液；另取冰片对照品，加氯仿制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以15-18∶2-4环己烷-醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

7、如利要求6所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于该方法中的鉴别方法包括如下鉴别中的一种或几种：

a、取贴膜4片，剪碎，加甲醇30ml，置水浴上加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次15ml，弃去乙醚液，再用水饱和正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，加入等体积的氨试液，振摇，放置使分层，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取柴胡对照药材1g，加乙醚30ml，加热回流30分钟，弃去乙醚液，药渣挥干，加甲醇30ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以15∶40∶22∶10氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％对二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇溶液1→10，在70℃加热至斑点显色清晰，分别置365nm日光及紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点或黄色荧光的主斑点；

b、取贴膜2片，加水15ml，加热使溶解，再加乙醚20ml，超声处理10分钟，分取乙醚层，挥干，残渣加醋酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；另取莪术对照药材0.5克，加30～60℃石油醚20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以8.5∶1.5正己烷-醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；

c、取贴膜5片，剪碎，加乙醇50ml，置水浴上加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸20ml使溶解，用60～90℃石油醚提取2次，每次10ml，取水层，用浓氨水调节pH值至9～10，再用乙醚提取3次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加氯仿0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取延胡索乙素对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3μl，分别点于同一以含2％氢氧化钠的羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以7.5∶4∶1正己烷-氯仿-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏5分钟，取出，放置30分钟，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

d、取鉴别c项下供试品溶液，作为供试品溶液；另取贝母素甲、贝母素乙对照品，加氯仿分别制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照品溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以8∶4∶1苯-醋酸乙酯-二乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

e、取鉴别b项下供试品溶液，作为供试品溶液；另取欧前胡素对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以30～60℃下3∶2石油醚-乙醚为展开剂，在25℃以下展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

f、取鉴别b项下供试品溶液，作为供试品溶液；另取冰片对照品，加氯仿制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以17∶3环己烷-醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

8、如利要求1或2所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于该方法中的含量测定为包括如下测定方法中的一种或几种：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；15-20∶80-85∶0.01的乙腈-水-磷酸为流动相；检测波长284nm；理论板数按橙皮苷标准品峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：取重量差异项下的本品，剪碎，取0.2-0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理1-1.5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本品每片含青皮以橙皮苷C₂₈H₃₄O₁₅计，不得少于6.0mg。

9、如利要求8所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于该方法中的含量测定为包括如下测定方法中的一种或几种：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；17∶83∶0.01的乙腈-水-磷酸为流动相；检测波长284nm；理论板数按橙皮苷标准品峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：取重量差异项下的本品，剪碎，取约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本品每片含青皮以橙皮苷C₂₈H₃₄O₁₅计，不得少于6.0mg。

10、如权利要求1或2所述的药物组合物在制备治疗乳腺增生的药物中的应用。

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