CN109266688A - 一种党参多糖的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种党参多糖的制备方法及其应用，所述党参多糖的制备方法包括以下步骤：将党参干燥后粉碎过筛，得党参粉末；将党参粉末与干酵母溶液混合后，经过恒温发酵培养获得党参提取液；除去党参提取液中的蛋白质和色素后，经过浓缩形成浓缩液；对浓缩液进行醇沉处理后使固液分离，收集沉淀物并干燥，制得党参多糖。本发明通过酵母发酵法进行党参多糖的提取，对党参多糖进行去杂纯化，提高了所提取出的党参多糖的产量和纯度。

Description

一种党参多糖的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及中药提取技术领域，特别涉及一种党参多糖的制备方法及其应用。
背景技术
党参(学名：Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.)，桔梗科党参属，多年生草本植物。研究表明党参具有益气，补肺养脾的药用价值。现代药理研究表明，党参具有调节血液中血糖浓度，促进人体的生理调节能力等功效。党参有效成分主要为甾醇类、糖苷和挥发性物质等，但总多糖含量较少。多糖类成分广泛存在于各种天然植物中，研究表明该类化学物质在清除自由基、增强人体免疫力，抗衰老等方面具有明显的药理作用。
党参多糖还具有抗氧化活性，有学者通过建立D-半乳糖诱导小鼠衰老模型，研究党参粗多糖(CPPS)的抗氧化作用，研究结果表明CPPS具有一定抗氧化延缓衰老的作用。
对于党参多糖的提取方法，基本上都是通过水提醇沉法(也称水醇法，是指在中药的水提浓缩液中，加入乙醇而达到不同的含醇量，某些药物成分在醇溶液中溶解度降低析出沉淀，然后固液分离后使水提液得以精制的方法)进行提取。但是，现有通过水提醇沉法提取出来的党参多糖的产量普遍较低。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种党参多糖的制备方法及其应用，旨在提高党参多糖的提取率。
为实现上述目的，本发明提出一种党参多糖的制备方法，包括以下步骤：
将党参干燥后粉碎过筛，得党参粉末；
将党参粉末与干酵母溶液混合后，经过恒温发酵培养获得党参提取液；
除去党参提取液中的蛋白质和色素后，经过浓缩形成浓缩液；
对浓缩液进行醇沉处理后使固液分离，收集沉淀物并干燥，制得党参多糖。
优选地，将党参粉末与干酵母溶液混合后，经过恒温发酵培养获得党参提取液的步骤中：
所述干酵母溶液的浓度为0.1～0.3mg/mL；和/或，
所述党参粉末与所述干酵母溶液混合时，所述党参粉末与所述干酵母的质量比为1：(0.4～0.8)。
优选地，将党参粉末与干酵母溶液混合后，经过恒温发酵培养获得党参提取液的步骤中：
所述恒温发酵培养的温度为20～30℃，时间为16～24h。
优选地，除去党参提取液中的蛋白质和色素后，经过浓缩形成浓缩液的步骤，包括：
将党参提取液浓缩后与Sevage溶液混合，然后弃去形成的蛋白质沉淀并保留上清液；
使用大孔树脂吸附上清液中的色素，得透明溶液；
将透明溶液再次浓缩形成浓缩液。
优选地，将党参提取液浓缩后与Sevage溶液混合，然后弃去形成的蛋白质沉淀并保留上清液的步骤中：
所述浓缩后的党参提取液与所述Sevage溶液的体积比为1：1；和/或，
所述Sevage溶液为氯仿和正丁醇以3:1的体积比混合形成的混合溶液。
优选地，对浓缩液进行醇沉处理后使固液分离，收集沉淀物并干燥，制得党参多糖的步骤，包括：
向浓缩液中加入乙醇溶液，然后在3～5℃下静置10～14h，得到形成有沉淀物的醇沉产物；
使醇沉产物固液分离后收集沉淀物并干燥，得党参多糖。
优选地，向浓缩液中加入乙醇溶液，然后在3～5℃下静置10～14h，得到形成有沉淀物的醇沉产物的步骤中：
所述浓缩液与所述乙醇溶液的体积比为1：1；和/或，
所述乙醇溶液的体积浓度为85～95％。
优选地，使醇沉产物固液分离后收集沉淀物并干燥，得党参多糖的步骤中：
所述沉淀物的干燥方式为真空干燥，干燥温度设置为28～32℃。
优选地，将党参干燥后粉碎过筛，得党参粉末的步骤，包括：
将党参在温度设置为60～70℃的真空干燥箱中干燥20～26h，然后将干燥后的党参粉碎后过60～140目筛，得党参粉末。
本发明还提出如上所述的党参多糖的制备方法制得的党参多糖在制备抗氧化和/或增强免疫活性的药物和/或保健品中的应用。
本发明提供的技术方案中，采用酵母发酵法进行党参多糖的提取，利用酵母在发酵繁殖过程中不能吸收多糖，而仅仅利用单糖和低聚糖进行繁殖的特性，以酵母发酵的方式对党参多糖进行去杂纯化，然后脱除党参提取液中的蛋白质和色素后进行醇沉，使党参提取液中的党参多糖沉淀后进行分离和干燥，制得党参多糖，提高了党参多糖的提取率和纯度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的党参多糖的制备方法的一实施例的流程示意图；
图2为本发明应用实施例中党参多糖对ABTS自由基的清除率；
图3为本发明应用实施例中党参多糖对超氧阴离子的清除率；
图4为本发明应用实施例中党参多糖对金属离子的清除率。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
现有技术中党参多糖的提取方法，基本上都是通过水提醇沉法进行提取，但是，此种方法提取出来的党参多糖的产量普遍较低，而且纯度不高，通常还含有单糖和多聚糖等杂质，为解决上述问题，本发明提出一种党参多糖的制备方法，其通过酵母发酵提取后进行醇沉，提高了党参多糖的提取率和纯度，图1所示为本发明提供的党参多糖的制备方法的一实施例。请参阅图1，在本实施例中，所述党参多糖的制备方法包括以下步骤：
步骤S10、将党参干燥后粉碎过筛，得党参粉末；
对党参进行干燥的方式有多种，可以是自然晒干，也可以是使用烘箱进行干燥，使用烘箱进行干燥所需的时间更短，进一步地，可以采用鼓风干燥箱、真空干燥箱或者微波干燥箱等常规的干燥烘箱进行，不做具体限定。在本发明的一具体实施例中，优选为使用真空干燥箱对党参进行干燥，具有干燥效率高、不影响被干燥物质自身性能的优点，具体可采用以下方式进行：将党参在温度设置为60～70℃的真空干燥箱中干燥20～26h，然后将干燥后的党参粉碎后过60～140目筛，得党参粉末，其中，干燥温度设置为60～70℃均可，例如可以是60℃、62℃、65℃、68℃或70℃等等，优选为65℃；对应的，干燥时间设置为20～26h均可，例如可以是26h、24h、22h或20h等等，优选为24h。所述党参的粉碎可以采用研磨或高速粉碎的方式进行，在本实施例中采用研磨机进行磨粉，具有操作简便、使用安全性高的优点，具体操作方法为：将干燥后的党参放入研磨机中进行高速打磨，打磨之后的党参粉用60～140目的药材筛进行过筛，得到党参细粉以及残留于筛上的党参粗粉，将党参粗粉再次投入研磨机中进行研磨并过筛，最终将党参全部粉碎为粒径为0.1～0.25mm的党参粉末，其中，所述药材筛选用60～140目均可，例如可以是60目、80目、100目、120目或140目等等，即可对应获得粒径约为0.25mm、0.18mm、0.15mm、0.125mm或0.106mm左右的党参粉末。
步骤S20、将党参粉末与干酵母溶液混合后，经过恒温发酵培养获得党参提取液；
通过酵母发酵法对所制得的党参粉末进行提取，在发酵过程中，所述干酵母在发酵繁殖过程中仅仅利用单糖和低聚糖，而不能吸收多糖，如此，去除党参提取物中的单糖和低聚糖，提高了提取物中党参多糖的纯度。在进行所述恒温发酵的过程中，如果所述干酵母的添加量太少，则无法达到充分吸收党参提取物中的单糖和低聚糖的效果，而在所述干酵母的添加量足够吸收单糖和低聚糖的基础上，应尽量减少所述干酵母的用量以节约成本。在本实施例中，所述党参粉末与所述干酵母溶液混合时，所述党参粉末与所述干酵母的质量比为1：(0.4～0.8)，例如可以是每1g所述党参粉末对应加入0.4g、0.5g、0.6g、0.7g或0.8g的干酵母，优选为0.5～0.6g；和/或，所述干酵母溶液的浓度为0.1～0.3mg/mL，例如可以是0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL或0.3mg/mL，优选为0.2mg/mL。如此，在所述恒温发酵的过程中，所述干酵母即可完全吸收掉党参提取物中的单糖和低聚糖，实现提高党参多糖提取纯度的目的。
进一步地，为使所述干酵母在恒温发酵过程中充分生长和繁殖，在本实施例中，所述恒温发酵培养的温度为20～30℃，例如可以是20℃、23℃、25℃、28℃或30℃等等，优选为20～25℃；所述恒温发酵培养的时间为16～24h，例如可以是16h、18h、20h、22h或24h等等，优选为20～22h。可以理解的是，在所述恒温发酵培养时，待发酵的混合物(党参粉末与干酵母溶液的混合物)中还加有蒸馏水，在本发明提供的另一实施例中，优选为每1g所述丹参粉末对应加入50mL的蒸馏水；另外，为保证所述干酵母发酵时的营养所需，所述待发酵的混合物中还添加有葡萄糖、蛋白质胨以及酵母提取物等营养物质，以作为所述干酵母繁殖阶段的营养源。
步骤S30、除去党参提取液中的蛋白质和色素后，经过浓缩形成浓缩液；
常用的去除多糖中蛋白质的方法有Sevage法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法等，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，在本实施例中优选为采用Sevage方法脱除所述党参提取液中的蛋白质，对蛋白质的脱除效果较好。由于党参多糖是有色的，所以在这里需要将其脱除色素以达到需要的色度要求，脱除色素可以采用活性炭等吸附剂进行吸附，也可以采用大孔树脂法进行，在本实施例中优选为采用大孔树脂吸附法进行。进一步地，在本实施例中，步骤S30具体包括：
步骤S31、将党参提取液浓缩后与Sevage溶液混合，然后弃去形成的蛋白质沉淀并保留上清液；
Sevage法是指用氯仿与戊醇或丁醇等混合形成的Sevage溶液，加入到样品中充分混合，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，然后除去所形成的不溶物，在本实施例中，所述浓缩后的党参提取液与所述Sevage溶液的体积比为1：1；和/或，所述Sevage溶液为氯仿和正丁醇以3：1的体积比混合形成的混合溶液。
步骤S32、使用大孔树脂吸附上清液中的色素，得透明溶液；
大孔树脂作为一种新型的高分子材料，因其独特的三维空间立体孔架构，还有一定尺寸的孔径和孔内表面积，在除色素方面具有除色效果好、应用也十分广泛，价格便宜，能满足一般的需求，在具体操作时，可以参照现有技术中大孔树脂吸附法的一般处理流程进行，通过大孔树脂预处理、样品装填以及洗脱等工序，即可完成色素的吸附与脱除，在此不做赘述。在本实施例中，所述大孔树脂可选用型号为Amberlite XAD-4的非离子型大孔树脂。
步骤S33、将透明溶液再次浓缩形成浓缩液。
脱除所述党参提取液中的蛋白质和色素后得到的透明溶液，然后将其浓缩形成浓缩液。其中，在步骤S31和步骤S33中，所述党参提取液和所述透明溶液在浓缩时可以通过蒸发浓缩的方式进行，例如采用常压蒸发、减压蒸发等，在本实施例中优选为采用旋转蒸发仪，将待浓缩的溶液加热至70℃左右旋蒸浓缩。
步骤S40、对浓缩液进行醇沉处理后使固液分离，收集沉淀物并干燥，制得党参多糖。
在通过酵母发酵法除去党参提取物中的单糖和低聚糖，以及脱除所述党参提取物中的蛋白质和色素后，再采用醇沉处理，使其中的党参多糖沉淀出来，然后分离出所形成的沉淀物，即为党参多糖提取物，在本实施例中，步骤S40具体包括：
步骤S41、向浓缩液中加入乙醇溶液，然后在3～5℃下静置10～14h，得到形成有沉淀物的醇沉产物；
将所述浓缩液与乙醇溶液充分混合后，在3～5℃温度下静置10～14h，例如可以是在3℃下静置14h、4℃下静置12h或5℃下静置10h，优选为在4℃下静置12h，利用党参多糖在高浓度醇溶液中的溶解度降低而析出的特性，使党参多糖在静置期间内尽量沉淀，其中，所述浓缩液与所述乙醇溶液的体积比为1：1；和/或，所述乙醇溶液的体积浓度为85～95％，例如可以是85％、90％或者95％，优选为95％。
步骤S42、使醇沉产物固液分离后收集沉淀物并干燥，得党参多糖。
步骤S42中所述的使固液分离的方法有多种，例如过滤或离心等，其中离心处理具有固液分离率高、操作方便的优点，故在本实施例中优选为采用离心的方式进行固液分离。进一步地，在步骤S42中，所述沉淀物的干燥方式也有多种，例如可以是鼓风干燥、真空干燥或微波干燥等等方式，其中真空干燥具有具有干燥效率高、不影响被干燥物质自身性能的优点，故在本实施例中优选为采用真空干燥的方式对所述沉淀物进行干燥处理，干燥温度设置为28～32℃，例如可以是28℃、30℃或32℃等等，优选为30℃，干燥至所述恒重时，即获得党参多糖。
本发明提供的技术方案中，采用酵母发酵法进行党参多糖的提取，利用酵母在发酵繁殖过程中不能吸收多糖，而仅仅利用单糖和低聚糖进行繁殖的特性，以酵母发酵的方式对党参多糖进行去杂纯化，然后脱除党参提取液中的蛋白质和色素后进行醇沉，使党参提取液中的党参多糖沉淀后进行分离和干燥，制得党参多糖，提高了所提取出的党参多糖的纯度，而且也提高了党参多糖的提取率。
本发明还提出如上所述的党参多糖的制备方法制得的党参多糖在制备抗氧化和/或增强免疫活性的药物和/或保健品中的应用，本发明所制备的党参多糖纯度高，具有显著的抗氧化活性，可有效清除ABTS自由基、超氧根离子和金属离子，可用于制备具有抗氧化功效和/或增强免疫活性的产品，例如天然抗氧化剂、抗氧化保健品和抗肿瘤药物等等，应用前景广阔。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
(1)干酵母活性判定
配制细胞培养基(1000mL无菌水，10g食盐，10g蛋白胨，5g酵母提取物)，用250mL锥形瓶分装50mL液体细胞培养基在高温蒸汽灭菌锅内进行121℃、30min灭菌，然后加入5mL浓度为0.2mg/mL的干酵母溶液，在24℃摇床上以180r/min的速度放置16h，观察瓶内液体清晰度情况，判定此酵母不需要活化。
(2)党参提取液的制备
①将党参(市购)剪成1cm左右的小段，放入温度设置为65℃的真空干燥箱中干燥24h，然后取出放入研磨机中进行30s的高度打磨，打磨完后的党参粉用孔径为0.01cm的药材筛过筛，收集得到的细粉并将筛上的粗粉再次研磨为细粉，制得党参粉末；
②取1g党参粉末加入250mL已灭菌的锥形玻璃瓶中，然后加入0.5g蛋白胨、0.25g酵母提取物、50mL的蒸馏水以及浓度为0.2mg/mL的干酵母溶液，放置到生化培养箱中进行恒温发酵培养，得到党参提取液，其中，以恒温发酵培养过程中的发酵时间X1、发酵温度X2以及干酵母添加量X3为自变量，以吸光度(党参提取液在490nm波长处的吸光度值OD490)为响应值，利用Box-Benhnken中心组合设计3因素3水平试验，如下表1所示，对应进行多组试验，即为如表2所示的实施例1至实施例17。
表1 Box-Behnken设计因素及编码值
表2各实施例中干酵母溶液的体积以及恒温发酵培养的时间和温度条件
利用Design Expert 8.0对实施例1至实施例17中的数据进行统计分析，得到二次多项式回归方程：
Y＝-0.24785+0.026625X1+0.12380X2+0.028719X3-0.00095X1X2-0.00025X1X3-0.0001875X2X3-0.000492X1 2-0.025550X2 2-0.00055X3 2，对上述回归方程进行方差分析，分析结果如下表3所示(表3中，P<0.05为显著作用；P<0.01为高度显著作用；P<0.001为极显著作用)。
表3回归方程方差分析
由表3可以看出，除了X1X2，X1X3即发酵时间发酵温度和发酵时间酵母添加量显著；X2即发酵温度高度显著外，其余均为极显著。这些数据表明实验所建立的模型是可行的。精密度(Adeq Precision)＝19.927，这个数据表明该模型可以预测实验结果。R2 Adj＝0.9703表明该模型可以证明预测97.03％的响应值；判定系数R2＝0.9870说明该模型拟合程度好，可以分析预测党参多糖的吸光度值。R2 Pred＝0.9578与R2＝0.9870无显著差别，说明无需进一步优化响应面方程。对最终的结果数据进行分析得出的结果：党参多糖提取的最佳发酵温度为24.57℃、最佳发酵时间为21.03h、最佳酵母添加量为0.592mg，按照此最佳发酵条件，根据上述步骤(2)进行党参多糖的提取，制备党参多糖提取液，记为实施例18。
(3)党参多糖的制备
①将党参提取液(实施例1至实施例18制得)在水温温度为70℃的旋转蒸发仪里旋蒸浓缩至100mL左右，然后向其中加入相同体积的Sevage溶液(氯仿与正丁醇以体积比3：1混合而成的混合溶液)，混合均匀后用分液漏斗分液并取其上清液；
②用大孔吸附树脂吸附上清液中的色素，得到透明溶液，然后将透明溶液在水温温度为70℃的旋转蒸发仪里再次旋蒸浓缩至50mL左右，得到浓缩液；
③向浓缩液中加入等体积的浓度为95％的乙醇溶液，然后置于温度设置为4℃的恒温冰箱中静置12h，在低温静置期间，党参多糖析出沉淀，再将静置后的混合物倒入离心管中，通过高速离心分离出沉淀物，最后将沉淀物放置在温度设置为30℃真空干燥箱中干燥至恒重，获得党参多糖并称重。
对比例
(1)党参提取液的制备
①将党参(市购)剪成1cm左右的小段，放入温度设置为65℃的真空干燥箱中干燥24h，然后取出放入研磨机中进行30s的高度打磨，打磨完后的党参粉用孔径为0.01cm的药材筛过筛，收集得到的细粉并将筛上的粗粉再次研磨为细粉，制得党参粉末；
②取1g党参粉末加入250mL已灭菌的锥形玻璃瓶中，然后加入50mL的蒸馏水，加热至60℃，搅拌提取2h，得到党参提取液；
(2)党参多糖的制备
①将党参提取液(步骤(1)制得)在水温温度为70℃的旋转蒸发仪里旋蒸浓缩至100mL左右，然后向其中加入相同体积的Sevage溶液(氯仿与正丁醇以体积比3：1混合而成的混合溶液)，混合均匀后用分液漏斗分液并取其上清液；
②用大孔吸附树脂吸附上清液中的色素，得到透明溶液，然后将透明溶液在水温温度为70℃的旋转蒸发仪里再次旋蒸浓缩至50mL左右，得到浓缩液；
③向浓缩液中加入等体积的浓度为95％的乙醇溶液，然后置于温度设置为4℃的恒温冰箱中静置12h，在低温静置期间，党参多糖析出沉淀，再将静置后的混合物倒入离心管中，通过高速离心分离出沉淀物，最后将沉淀物放置在温度设置为30℃真空干燥箱中干燥成粉末状，获得党参多糖并称重。
实施例1至18以及对比例制备的党参多糖的质量以及纯度如下表4所示。
表4各实施例和对比例制备的党参多糖的质量及纯度
由表4可知，相比于对比例中采用水提醇沉法提取党参多糖的方法，本发明实施例采用酵母发酵法提取党参多糖的提取率更高，且所提取的党参多糖的纯度也更高，说明本发明实施例提供的党参多糖的制备方法在提取效率和质量上优于现有技术中的水提醇沉法。
应用实施例党参多糖的抗氧化活性试验
以实施例18制备的党参多糖进行抗氧化活性试验，试验方法及结果如下：
(1)清除超氧阴离子活性
①实验试剂的配制：
配制浓度为50mmol/L的Tris-HCL缓冲液：配制一定体积的三羟甲基氨基甲烷溶液，然后用稀盐酸调节pH值到8.2；
配制浓度为25mmol/L的邻苯三酚溶液：用分析天平精密称取0.630g的邻苯三酚，用适量的蒸馏水溶解后用200mL的容量瓶定容至刻度线；
配制梯度浓度的党参多糖溶液：浓度分别为10mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL和1mg/mL。
②实验操作方法：往试管中加入4.5mL、50mmoL/L配制好的Tris-HCL缓冲液，放在25℃的水浴中加热20min，然后分别加入浓度梯度的党参多糖样品溶液各0.2mL，最后加入0.08mL、25mmol/L的邻苯三酚，在相同的的温度下反应5min，迅速加入0.2mL、8mmol/L的HCL溶液终止反应，用紫外分光光度计在波长为299nm处测量吸光度。
O2-清除率计算公式：清除率(％)＝[1-(B1-B2)/B0]×100
式中，B0为对照组的吸光度(用氯仿代替样品溶液)；B1为样品组的吸光度；B2为样品的本底吸光度(蒸馏水代替邻苯三酚溶液)。
计算结果如图2所示，从图2可以看出，党参多糖对超氧阴离子的清除率随着党参多糖浓度的增加而逐渐增大，当党参多糖的浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和10mg/mL时，对超氧阴离子的清除率分别为67.5％、80％、82.5％、89.0％和93％，说明本发明实施例制备的党参多糖能有效清除超氧阴离子，具有显著的抗氧化活性。
(2)清除金属离子活性
①试剂的配制：
配制浓度为5mmol/L的LFeCl2溶液：准确称取159.048mg的FeCl2·4H2O，用蒸馏水溶解并置于200mL容量瓶中加入蒸馏水到刻度线；
配制菲啰嗪试液：精密称取24.6mg的菲啰嗪溶于10mL的蒸馏水中；
配制梯度浓度的党参多糖溶液：浓度分别为10mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL和1mg/mL。
②实验方法：先取上述配好的梯度浓度的党参多糖样品溶液各100uL，分别加入10uL的FeCl2溶液、20uL的菲啰嗪试液和0.27mL的蒸馏水，在波长为562nm处测定其吸光度为A1。
金属离子清除率计算公式：清除率(％)＝[1-(B1-B2)/B0]×100
式中，B0为对照组的吸光度(样品溶液换成氯仿)；B1为样品的吸光度；B2为样品的本身的吸光度值(FeCl2溶液换成蒸馏水)。
计算结果如图3所示，从图3可以看出，党参多糖对金属离子的清除率随着党参多糖浓度的增加而逐渐增大，当党参多糖的浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和10mg/mL时，对金属离子的清除率分别为87％、90.4％、92％、93.5％和93.2％，说明本发明实施例制备的党参多糖能有效清除金属离子，具有显著的抗氧化活性。
(3)清除ABTS自由基活性
①实验试剂的配制：
配制7mmol/L的ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)试液：准确称量76.8mg的ABTS，先用少量蒸馏水溶解后定容于20mL的容量瓶中；
配制15mmol/L的过硫酸钾：精密称量802mg的过硫酸钾，溶于少量蒸馏水后置于200mL容量瓶中定容至刻度线；
配制梯度浓度的党参多糖溶液：浓度分别为10mg/mL、8mg/mL、4mg/ml、2mg/mL和1mg/mL。
②实验方法：首先取0.5mL的过硫酸钾溶液加入2.5mL的ABTS溶液，ABTS+阳离子的形成需要在室温下避光反应24h以上。将事先准备好的ABTS+阳离子储液用蒸馏水稀释，直至波长为734nm处吸光度值为0.7200-0.6800之间为止，放在阴暗处待用。取上述配好的梯度浓度的党参多糖样品溶液50uL后，分别加入200uL的ABTS+阳离子储液后摇晃均匀，在室温条件下反应10min，在734nm的波长处测定其吸光度。
ABTS自由基清除率计算公式：清除率(％)＝[1-(B1-B2)/B0]×100
式中，B1为样品组的吸光度；B0为对照组的吸光度(使用氯仿替换样品溶液)；B2为样品的本底吸光度值(用ABTS+阳离子储液替换蒸馏水)。
计算结果如图4所示，从图4可以看出，党参多糖对ABTS自由基的清除率随着党参多糖浓度的增加而逐渐增大，当党参多糖的浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和10mg/mL时，对ABTS自由基的清除率分别为78.5％、86.7％、88.1％、90.8％和91.3％，说明本发明实施例制备的党参多糖能有效清除ABTS自由基，具有显著的抗氧化活性。
综上所述，本发明实施例制备的党参多糖具有显著的抗氧化活性，可有效清除ABTS自由基、超氧根离子和金属离子，可广泛用于制备具有抗氧化功效和/或增强免疫活性的产品，应用前景广阔。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种党参多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将党参干燥后粉碎过筛，得党参粉末；
将党参粉末与干酵母溶液混合后，经过恒温发酵培养获得党参提取液；
除去党参提取液中的蛋白质和色素后，经过浓缩形成浓缩液；
对浓缩液进行醇沉处理后使固液分离，收集沉淀物并干燥，制得党参多糖。
2.如权利要求1所述的党参多糖的制备方法，其特征在于，将党参粉末与干酵母溶液混合后，经过恒温发酵培养获得党参提取液的步骤中：
所述干酵母溶液的浓度为0.1～0.3mg/mL；和/或，
所述党参粉末与所述干酵母溶液混合时，所述党参粉末与所述干酵母的质量比为1：(0.4～0.8)。
3.如权利要求1所述的党参多糖的制备方法，其特征在于，将党参粉末与干酵母溶液混合后，经过恒温发酵培养获得党参提取液的步骤中：
所述恒温发酵培养的温度为20～30℃，时间为16～24h。
4.如权利要求1所述的党参多糖的制备方法，其特征在于，除去党参提取液中的蛋白质和色素后，经过浓缩形成浓缩液的步骤，包括：
将党参提取液浓缩后与Sevage溶液混合，然后弃去形成的蛋白质沉淀并保留上清液；
使用大孔树脂吸附上清液中的色素，得透明溶液；
将透明溶液再次浓缩形成浓缩液。
5.如权利要求4所述的党参多糖的制备方法，其特征在于，将党参提取液浓缩后与Sevage溶液混合，然后弃去形成的蛋白质沉淀并保留上清液的步骤中：
所述浓缩后的党参提取液与所述Sevage溶液的体积比为1：1；和/或，
所述Sevage溶液为氯仿和正丁醇以3:1的体积比混合形成的混合溶液。
6.如权利要求1所述的党参多糖的制备方法，其特征在于，对浓缩液进行醇沉处理后使固液分离，收集沉淀物并干燥，制得党参多糖的步骤，包括：
向浓缩液中加入乙醇溶液，然后在3～5℃下静置10～14h，得到形成有沉淀物的醇沉产物；
使醇沉产物固液分离后收集沉淀物并干燥，得党参多糖。
7.如权利要求6所述的党参多糖的制备方法，其特征在于，向浓缩液中加入乙醇溶液，然后在3～5℃下静置10～14h，得到形成有沉淀物的醇沉产物的步骤中：
所述浓缩液与所述乙醇溶液的体积比为1：1；和/或，
所述乙醇溶液的体积浓度为85～95％。
8.如权利要求6所述的党参多糖的制备方法，其特征在于，使醇沉产物固液分离后收集沉淀物并干燥，得党参多糖的步骤中：
所述沉淀物的干燥方式为真空干燥，干燥温度设置为28～32℃。
9.如权利要求1所述的党参多糖的制备方法，其特征在于，将党参干燥后粉碎过筛，得党参粉末的步骤，包括：
将党参在温度设置为60～70℃的真空干燥箱中干燥20～26h，然后将干燥后的党参粉碎后过60～140目筛，得党参粉末。
10.如权利要求1至9任意一项所述的党参多糖的制备方法制得的党参多糖在制备抗氧化和/或增强免疫活性的药物和/或保健品中的应用。
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