CN108272793A - 花青素在制备治疗由对氨基苯砷酸引起的细胞损伤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了花青素在制备治疗由对氨基苯砷酸引起的细胞损伤的药物中的应用。本发明通过建立体外鸡胚成纤维DF‑1细胞模型研究对氨基苯砷酸和花青素在DF‑1细胞凋亡中的作用，本发明首次发现，对氨基苯砷酸对DF‑1细胞具有细胞毒性，能诱导细胞凋亡；一定浓度的花青素(50‑100μg/ml)能够拮抗对氨基苯砷酸所引起的细胞凋亡。本发明拓展了花青素的医药用途，有利于以花青素为有效成分的具有新适应症药物的开发。

Description

花青素在制备治疗由对氨基苯砷酸引起的细胞损伤的药物中 的应用

技术领域

本发明涉及花青素的医药用途领域，具体涉及花青素在制备治疗由对氨基苯砷酸引起的细胞损伤的药物中的应用。

背景技术

对氨基苯砷酸(Arsanilic acid，ASA)，俗称阿散酸，分子式为C₆H₈AsNO₃，是通过将苯胂酸苯环4-位被氨基取代形成的有机砷化合物。对氨基苯砷酸具有促生长、抗菌和防治疾病等作用，因此常作为药物饲料添加剂在畜禽养殖业中广泛使用。上世纪50年代初美国率先研制生产出能用于作为饲料添加剂的对氨基苯砷酸，随后在各国推广使用。中国在20世纪80年代开始研究使用对氨基苯砷酸并广泛应用于养殖与疾病防控中(耿安静等,2017)。在1993年我国农业部才正式批准生产使用有机砷，包括对氨基苯砷酸和洛克沙胂。中华人民共和国农业部168号中规定氨苯砷酸预混剂在猪、鸡混合饲料中添加计量为100mg/kg，出栏宰杀休药期为5天。在养禽业中，雏鸡日粮中添加对氨基苯砷酸能显著提高雏鸡机体的免疫抵抗力；肉鸡饲料中添加对氨基苯砷酸能提高肉鸡的体增重、降低料肉比、提高生产效益(何雄等,2003)；产蛋鸡日粮中添加对氨基苯砷酸可提高抗病力、雏鸡的育成率以及产蛋率。肉鸭日粮中添加阿散酸可显著提高增重以及饲料转化率，增强机体抵抗力，减少死亡(黄瑞煜,1999)。猪饲料中添加对氨基苯砷酸能提高生长速度、降低料肉比、增强机体抵抗力(曹志坚等,2000)。饲料中添加对氨基苯砷酸有助于猪消化系统对营养物质的吸收以及抑制肠道微生物(鲁银,2012)。对氨基苯砷酸还具有治疗猪附红细胞体病、鸡球虫病以及防止硒中毒的作用。

随着对氨基苯砷酸作为饲料添加剂在畜禽业中的广泛应用，对氨基苯砷酸在动物机体中蓄积以及对环境的危害也逐渐暴露出来。对氨基苯砷酸经口进入机体，少部分被动物机体转化吸收，大部分以原型随粪便尿液排出对环境造成污染。对氨基苯砷酸与环境微生物发生作用会转变成其他的砷化物。环境中的砷化物可通过作物以及饮水威胁人类的健康。

花青素(Anthocyanins)，又称花色素、花青苷，是自然界中一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属于酚类化合物中的生物类黄酮类。花青素主要以糖苷的形式存在于表皮细胞的胞液内，是花和果实中的主要色素(顾林等,2007)。花青素在自然状态下常与各种单糖形成糖苷，成为花色苷。

花青素的基本结构是2-苯基苯并吡喃阳离子，即花青素核。花青素核结构有双键存在,能吸收可见光而呈一定的颜色。花青素核的苯环-C3桥-苯环是发色基团。花青素在波长范围分别为465～560nm和270～280nm有最大光吸收。B环的R1和R2基团主要是-H，-OH和-OCH₃，取代基不同决定着花青素的种类和颜色。目前已经得到确定的花青素有23种之多，在一般植物中存在的花青素6大类，分别是矢车菊色素(cyanindin，Cy)、天竺葵色素(pelargonidin，Pg)、飞燕草色素(delphinidin，Dp)、芍药色素(peonidin，Pn)、牵牛色素(petunidin，Pt)以及锦葵色素(malvidin,Mv)(Alcalde-Eon et al.,2004)。自然条件下游离状态的花青素极少见,主要以糖苷形式存在，花青素常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷。已知天然存在的花色苷有250多种(缪少霞等,2012；王日为等,2002)。花青素广泛存在于开花植物(被子植物)中，据初步统计，27个科，73个属植物中含花青素。

花青素广泛存在于许多植物中，因其具有众多生理活性备受各界的关注，目前已发现其拥有抗氧化、清除自由基、改善肝功能、预防心血管疾病、抗癌抗炎和保护视力等多种生理作用。但尚未见有花青素在拮抗对氨基苯砷酸所引起的细胞凋亡方面的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供花青素在制备治疗由对氨基苯砷酸引起的细胞损伤的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供花青素在制备治疗由对氨基苯砷酸引起的细胞损伤的药物中的应用。

优选的，所述花青素为龙葵花青素。

进一步的，所述龙葵花青素由如下方法制备而成：

将龙葵鲜果打浆，制得浆液；以pH＝1的盐酸水溶液作为提取溶剂，进行超声提取，得到龙葵花青素的粗提液；将龙葵花青素的粗提液采用乙酸乙酯进行萃取，得到龙葵花青素的萃取液；将龙葵花青素的萃取液采用大孔树脂柱纯化，制备得到龙葵花青素。

优选的，浆液与提取溶剂的质量比为1：(6-8)；超声提取条件为：超声功率500-700W，超声时间20-30min，超声次数2-4次。

优选的，所述萃取具体为：将龙葵花青素的粗提液与乙酸乙酯按体积比1:3混合，充分振荡混匀后进行第一次萃取，收集下层水溶液；再将下层水溶液与乙酸乙酯按体积比1:3进行混合，充分振荡混匀后进行第二次萃取，收集下层水溶液，得到龙葵花青素的萃取液。通过萃取除去黄酮类、脂溶性的蛋白、多糖、色素等杂质。

优选的，所述大孔树脂纯化具体为：将龙葵花青素的萃取液按0.5-2倍柱体积/h的速度加入到大孔树脂中，先用pH＝1的盐酸水溶液洗涤吸附后的树脂，以除去未被吸附的杂质，待洗下的液体澄清不浑浊时停止洗涤，再用pH＝1的95％乙醇进行洗脱，洗脱速度为1-3倍柱体积/h，直至洗脱下的液体没有紫红色为止，收集龙葵花青素洗脱液，将洗脱液浓缩，真空冷冻干燥，制得纯度在40-50％的龙葵花青素。

优选的，所述龙葵花青素的浓度为50-100μg/ml。

本发明的第二方面，提供一种治疗由对氨基苯砷酸引起的细胞损伤的药物，所述药物以浓度为50-100μg/ml的花青素作为活性成分。

本发明的有益效果：

本发明通过建立体外鸡胚成纤维DF-1细胞模型研究对氨基苯砷酸和花青素在DF-1细胞凋亡中的作用，本发明首次发现，对氨基苯砷酸对DF-1细胞具有细胞毒性，能诱导细胞凋亡；一定浓度的花青素(50-100μg/ml)能够拮抗对氨基苯砷酸所引起的细胞凋亡。本发明拓展了花青素的医药用途，有利于以花青素为有效成分的具有新适应症药物的开发。

附图说明

图1：对氨基苯砷酸(花青素)24小时处理后DF-1细胞活性。

图2：流式细胞仪检测不同浓度花青素抑制对氨基苯砷酸诱导DF-1细胞凋亡的流式象限图。

图3：花青素抑制对氨基苯砷酸诱导DF-1细胞凋亡。

图4：激光共聚焦技术检测细胞凋亡(20×)。

图5：定量分析断裂的DNA片段。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：龙葵花青素的制备

(1)将龙葵鲜果去掉叶柄并洗净，用榨汁机打浆，制得浆液。

(2)以pH＝1的盐酸水溶液作为提取溶剂，对浆液进行超声提取，提取溶剂与浆液的质量为1:6，超声功率为600W，超声3次，每次30min，三次之后用200目纱布过滤，得到龙葵花青素的粗提液。

(3)将龙葵花青素的粗提液与乙酸乙酯按体积比1:3混合，充分振荡混匀后进行第一次萃取，收集下层水溶液；再将下层水溶液与乙酸乙酯按体积比1:3进行混合，充分振荡混匀后进行第二次萃取，收集下层水溶液，得到龙葵花青素的萃取液。

(4)将龙葵花青素的萃取液按1倍柱体积/h的速度加入到大孔树脂中，先用pH＝1的盐酸水溶液洗涤吸附后的树脂，以除去未被吸附的杂质，待洗下的液体澄清不浑浊时停止洗涤，再用pH＝1的95％乙醇进行洗脱，洗脱速度为2倍柱体积/h，直至洗脱下的液体没有紫红色为止，收集龙葵花青素洗脱液，将洗脱液浓缩，真空冷冻干燥，制得高纯度的龙葵花青素。

对制备的龙葵花青素的纯度进行检测，具体为：以实施例1制备的龙葵花青素粉末为材料，进行紫外-可见光分光光度法检测。首先制备标准品溶液，精确称取标准品矮牵牛色素-3-(顺-香豆酰基)芸香糖苷-5-葡萄糖苷1.245mg，溶解于5mL的pH1.0的氯化钾缓冲液中并测最大吸收峰处的吸光度，以此将标准品溶液稀释到4倍、8倍、16倍的最大吸收峰处吸光度，绘制标准曲线。将龙葵花青素粉末溶于氯化钾缓冲液中并测吸光度。依据标准曲线计算龙葵花青素的含量，经检测，本实施例制备的龙葵花青素的纯度为48％。

实施例2：CCK-8法检测细胞存活率

1.试验方法：

利用CCK-8法检测细胞存活率来研究对氨基苯砷酸和花青素在DF-1细胞凋亡中的作用。花青素为实施例1制备得到的龙葵花青素。

培养DF-1，细胞融合度达到80％以上时，将细胞(5×10⁵个/孔)传代至96孔板(每孔100μL)，培养24h。试验分为三个处理，分别为：对照组、ASA组、NA与ASA共孵育组；其中，对照组为空白对照，不做处理；ASA组用0-100mM/L的对氨基苯砷酸处理细胞24h；NA与ASA共孵育组用10mM/L的对氨基苯砷酸和0-200μg/ml的花青素处理细胞24h。

24h后，每孔加入10μLCCK-8试剂。在培养箱中孵育2h。注意不要在孔中生成气泡，气泡会影响O.D值读数。用酶标仪测定450nm处的吸光度。按下式计算细胞存活率，

细胞存活率＝[(试验孔-空白孔)/(对照组-空白组)]×100％。

2.试验结果：

对氨基苯砷酸对DF-1细胞的IC₅₀是10mM，并且对DF-1细胞具有显著的细胞毒性以及降低细胞存活率。

添加花青素浓度为50μg/mL-100μg/mL与对氨基苯砷酸共孵育时，细胞毒性作用减轻且细胞存活率显著上升(p＜0.01)，低于50μg/mL浓度的花青素拮抗对氨基苯砷酸细胞毒性效果较差；而高于100μg/mL浓度的花青素在对氨基苯砷酸所致细胞毒性作用中保护效果不如50-100μg/mL浓度的花青素。部分浓度试验结果如图1所示。

结果表明，对氨基苯砷酸对DF-1有毒性作用，并且能降低细胞存活率。花青素作为一种保护剂能显著的拮抗对氨基苯砷酸引起的细胞毒性且呈浓度剂量依赖。

实施例3：流式细胞术检测细胞凋亡率

1.试验方法：

(1)细胞培养：培养DF-1细胞，细胞融合度达到80％以上，传代至6孔板，培养24h。

(2)细胞染毒：实验分为四组，对照组，对氨基苯砷酸(ASA)攻毒组，单独ASA(10mM)组，花青素(NA)(50μg/mL)+ASA(10mM)共孵育组、NA(100μg/mL)+ASA(10mM)共孵育组，染毒时间为24h。花青素为实施例1制备得到的龙葵花青素。

(3)细胞收集：吸取旧培养液于离心管中保存，用PBS清洗细胞2次，收集清洗液于离心管中，用不含EDTA的胰酶消化细胞，消化时间控制在5～7min。消化完成收集细胞。1000rpm离心，3min，弃上清。加PBS后1000rpm离心3min，弃上清，重复本步骤一次。

细胞处理：加入Annexin V Binding Solution，重悬细胞，加Annexin V,FITC结合液，再加入PI染料。室温避光孵育15min。

(4)上机检测：孵育完成后，冰盒保存，尽量在1h内完成检测。

2.试验结果：

试验结果如图2和图3所示，由图可知，对氨基苯砷酸组的凋亡细胞数量明显高于对照组(p＜0.01)；ASA+NA(50μg/mL)以及ASA+NA(100μg/mL)两组添加花青素与对氨基苯砷酸共孵育后，凋亡细胞的数量显著减少(p＜0.01)。说明，对氨基苯砷酸能明显的诱导DF-1细胞凋亡，添加花青素后，花青素能明显的抑制对氨基苯砷酸所致的细胞凋亡，并且呈现浓度剂量依赖效应。

实施例4：TUNEL法检测细胞凋亡

为进一步确定对氨基苯砷酸以及花青素在细胞凋亡中起的作用，本发明运用激光共聚焦技术检测在形态学上对细胞凋亡进行了检测。花青素为实施例1制备得到的龙葵花青素。

1.试验方法：

(1)细胞培养：培养DF-1细胞，细胞融合度达到80％以上，传代至有细胞爬片的24孔板，培养24h。

(2)细胞染毒：实验分为四组，对照组，对氨基苯砷酸(ASA)攻毒组，单独ASA(10mM)组，NA(50μg/mL)+ASA(10mM)共孵育组，NA(100μg/mL)+ASA(10mM)共孵育组。染毒时间为24h。

(3)固定：PBS洗涤细胞两次，加4％多聚甲醛固定细胞30min。

(4)通透：PBS洗涤细胞一次，加免疫染色强力通透液，室温孵育5min。

(5)染色：PBS洗涤细胞两次，用一次性注射器针头和眼科镊子取出爬片放于湿盒内，加50μlTUNEL检测液，37℃避光孵育60min，PBS洗涤细胞两次，加PI染色液，37℃避光孵育10min。

(6)爬片封片：PBS洗涤细胞两次，每次3min，滴加防荧光淬灭液封片。激光共聚焦显微镜观察。

2.试验结果：

试验结果如图4和图5所示，由图可以看出，与对照组相比，对氨基苯砷酸组DNA片段化数量显著增多；但是添加花青素与对氨基苯砷酸共孵育后，DNA片段化数量只有ASA+NA(100μg/mL)组较ASA组显著减少(p＜0.01)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.花青素在制备治疗由对氨基苯砷酸引起的细胞损伤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述花青素为龙葵花青素。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述龙葵花青素由如下方法制备而成：

将龙葵鲜果打浆，制得浆液；以pH＝1的盐酸水溶液作为提取溶剂，进行超声提取，得到龙葵花青素的粗提液；将龙葵花青素的粗提液采用乙酸乙酯进行萃取，得到龙葵花青素的萃取液；将龙葵花青素的萃取液采用大孔树脂柱纯化，制备得到龙葵花青素。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，浆液与提取溶剂的质量比为1：(6-8)；超声提取条件为：超声功率500-700W，超声时间20-30min，超声次数2-4次。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述萃取具体为：将龙葵花青素的粗提液与乙酸乙酯按体积比1:3混合，充分振荡混匀后进行第一次萃取，收集下层水溶液；再将下层水溶液与乙酸乙酯按体积比1:3进行混合，充分振荡混匀后进行第二次萃取，收集下层水溶液，得到龙葵花青素的萃取液。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述大孔树脂纯化具体为：将龙葵花青素的萃取液按0.5-2倍柱体积/h的速度加入到大孔树脂中，先用pH＝1的盐酸水溶液洗涤吸附后的树脂，待洗下的液体澄清不浑浊时停止洗涤，再用pH＝1的95％乙醇进行洗脱，洗脱速度为1-3倍柱体积/h，直至洗脱下的液体没有紫红色为止，收集龙葵花青素洗脱液，将洗脱液浓缩，真空冷冻干燥，制得纯度在40-50％的龙葵花青素。

7.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述龙葵花青素的浓度为50-100μg/ml。

8.一种治疗由对氨基苯砷酸引起的细胞损伤的药物，其特征在于，所述药物以浓度为50-100μg/ml的花青素作为活性成分。