CN114306511A - 一种复方组合物及其在制备用于防治马拉色菌属病菌引起的皮肤疾病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种复方组合物,是由以下原料制备得到的:苦豆子提取物、马桑提取物、土木香提取物、白及提取物;苦豆子提取物中,包含有苦豆碱和/或槐定碱;并提供了其在制备用于防治马拉色菌属病菌引起的皮肤疾病的药物中的应用。本发明的特点及优点是:本发明复方组合物,采用了纯中药提取物,苦豆子、马桑、木土香和白及,分别采用不同的提取方法进行提取,再复配得到的复方组合物,其原料来源广泛,经前期试验,能够较好的抑制多种马拉色菌,也具有良好的马拉色菌相关皮肤疾病防治效果,且无副作用,可以起到良好的治疗效果;为防治马拉色菌相关性皮肤病,开发安全、绿色、天然、副作用小的中草药复方洗剂或相关护理产品奠定了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明涉及致病菌防治技术领域,具体涉及一种复方组合物及其在制备用于防治马拉色菌属病菌引起的皮肤疾病的药物中的应用。
背景技术
马拉色菌(Malasezia)是一种嗜脂性酵母样真菌,是人体皮肤表面的常驻菌之一。由于其生长需依赖脂质的生理特性(除厚皮马拉色菌外),其主要分布于人体皮脂丰富的部位,如头皮、面部及胸背部。有数据统计,马拉色菌约占键康人群皮肤定植真菌的50-80%。马拉色菌为条件致病菌,与人及动物的多种皮肤病相关,可直接感染皮肤及其附属器引起花斑糠疹、马拉色菌毛囊炎,同时在一定条件下,参与某些疾病的发生发展,如脂溢性皮炎、特应性皮炎、甲真菌病、外耳道炎和包皮龟头炎等,其中球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌是引起上述疾病的主要致病菌。马拉色菌引起的皮肤感染病种多、发病率高,易反复发作,给患者身体健康带来较大的影响。目前在临床上治疗马拉色菌相关性皮肤病时采用全身治疗或局部治疗。全身治法以口服抗真菌药,如酮康唑、伊曲康唑、氟康唑等;局部治法采用抗真菌外用药膏等,如采乐、康王等。也可用糖皮质激素和免疫抑制剂,但其易产生耐药性、副作用大,使用时常出现瘙痒、水肿症状限制了这些药物的应用。因此,有必要积极寻找具有不同结构,抑菌杀菌作用不同的抗真菌药物替代治疗,从而提高敏感性,增强疗效。
随着现代中药提取、分离技术的不断发展,且中药来源广泛、对皮肤的刺激性小,不易使致病菌产生耐药性,中药抗菌成分受到国内外专家学者的重视。苦豆子( Sophora alopecuroidesL.) 是豆科槐属多年生半灌木植物,其别名苦豆根、苦豆草、苦甘草,主要分布于中国北方的荒漠、半荒漠地区,甘肃、宁夏、青海、新疆等地区资源分布面积广,蕴藏量丰富。苦豆子的干燥全草、根及种子均可药用。由于极高的生态价值和药用价值,其资源的合理保护与开发越来越引起人们的重视。苦豆子主要成分为生物碱和黄酮,此外还有挥发油、有机酸、多糖氨基酸等。基础研究表明:苦豆子具有清热解毒、抗炎、抗菌、抗病毒、提高免疫功能的作用,其中所含生物碱对白色念珠菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、表皮葡萄球菌均有一定的抑制作用,且具有一定的抗炎效果。另外,槐定碱还具有增强机体免疫的功能,增加机体对病原微生物的抵抗力,减少感染。苦豆子提取物同时具备了抑菌抗炎、提高免疫力的作用,能充分发挥中药的优点。苦豆子的此种特性,将可能在治疗马拉色菌相关性皮肤病的领域中取得一定成果,进一步开发出治疗马拉色菌相关性皮肤病的安全、绿色、天然、副作用小的中草药复方洗剂或相关护理产品。
马桑(Coriariasinica Maxim)为双子叶植物纲木兰亚纲马桑科(Coriariaceae)马桑属(Coriaria Linn)植物,前期研究发现,马桑提取物具有一定的抑菌作用(《马桑提取物的抑菌作用和抑菌机理的初步研究》,《四川大学学报:自然科学版》,作者: 周莉君等)。
土木香提取物以菊科植物土木香(Inula helenium L.)的根为原料提取,主要含有萜类、黄酮、挥发油、氨基酸和多糖等成分;具有抗菌、细胞毒、保肝、抗肿瘤、驱虫以及降糖等作用,对黄瓜白粉菌、黄瓜霜毒菌、黄瓜炭疽菌、番茄灰霉菌、番茄叶霉菌等都有较强的抗菌活性。
白及,为兰科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎,白及提取物中的白芨多糖对大肠杆菌,变形杆菌,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长具有一定抑制作用。
发明内容
本发明的目的是提供了一种复方组合物及其在制备用于防治马拉色菌属病菌引起的皮肤疾病的药物中的应用。
本发明的上述目的可采用下列技术方案来实现:
一种复方组合物,是由按照重量份计的以下原料制备得到的:苦豆子提取物8-12份、马桑提取物0-5份、土木香提取物0-5份、白及提取物0-5份;所述苦豆子提取物中,包含有苦豆碱和/或槐定碱。
优选地,所述苦豆子提取物中,包含有苦豆碱、槐定碱和/或槐果碱。
进一步的,上述的一种复方组合物,是由按照重量份计的以下原料制备得到的:苦豆子提取物9-11份、马桑提取物1-4份、土木香提取物1-4份、白及提取物1-4份。
进一步的,上述的一种复方组合物,是由按照重量份计的以下原料制备得到的:苦豆子提取物10份、马桑提取物3份、土木香提取物3份、白及提取物3份。
进一步的,上述的一种复方组合物,所述苦豆子提取物中,包含有按照质量比计为1:(2-4)的苦豆碱和槐定碱。
优选地,苦豆子提取物中包含有按照质量比计为1:3的苦豆碱和槐定碱。
优选地,苦豆子提取物中还可以包含有按照质量比计为1:(2-4):(1-3)的苦豆碱、槐定碱和槐果碱;更优选地,按照质量比计为1:3:1。
进一步的,上述的一种复方组合物,所述苦豆子提取物的制备方法为:取苦豆子粉碎成细粉,加入浓度为60-70%的乙醇,浸泡0.5-1.5h后,进行回流提取5-7h,过滤,定容,所得滤液减压浓缩至相对密度为1.0-1.1,加水搅匀,静置3-6h,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至相对密度为1.0-1.1的清膏,将清膏在pH8-9下静置、离心分离,所得的上清液减压浓缩至相对密度为1.05-1.15,得到苦豆子提取物。
优选地,苦豆子提取物的制备方法为:取苦豆子粉碎成细粉,加入浓度为65%的乙醇,浸泡1h后,进行回流提取6h,过滤,定容,所得滤液减压浓缩至相对密度为1.05,加水搅匀,静置4.5h,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至相对密度为1.05的清膏,将清膏在pH8.5下静置、离心分离,所得的上清液减压浓缩至相对密度为1.1,得到苦豆子提取物。
进一步的,上述的一种复方组合物,所述马桑提取物的制备方法为:取马桑叶粉碎成粗粉,加100000 u/g的纤维素酶以酶用量为2-7mg/g,在pH6.0-7.5溶液中保温3-5h,再加入无水乙醇至乙醇终浓度为50-60%,料液比(6-12):1,加热回流提取2次,每次1.5-2.5h,过滤,减压浓缩至相对密度为1.0-1.1,加水搅匀,静置过夜,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至稠膏状,得到马桑提取物。
优选地,桑提取物的制备方法为:取马桑叶粉碎成粗粉,加100000 u/g的纤维素酶以酶用量为4.5mg/g,在pH 7溶液中保温4h,再加入无水乙醇至乙醇终浓度为55%,料液比9:1,加热回流提取2次,每次2h,过滤,减压浓缩至相对密度为1.05,加水搅匀,静置过夜,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至稠膏状,得到马桑提取物。
进一步的,上述的一种复方组合物,所述土木香提取物的制备方法为:取土木香根粉碎过70-90目筛得细粉,加入60%-70 %乙醇,浸泡过夜,35-45℃搅拌浸提2.5-3.5h,减压抽滤,滤渣再次加入180-220mL 95%乙醇,30-40℃,130-150r/min振荡浸提2.5-3.5h,减压抽滤,合并上述2次滤液,减压浓缩至稠膏状,得到土木香提取物。
优选地,土木香提取物的制备方法为:取土木香根粉碎过80目筛得细粉,加入70 %乙醇,浸泡过夜,40℃搅拌浸提3h,减压抽滤,滤渣再次加入200mL 95%乙醇,35℃,140r/min振荡浸提3 h,减压抽滤,合并上述2次滤液,减压浓缩至稠膏状,得到土木香提取物。
进一步的,上述的一种复方组合物,所述白及提取物的制备方法为:取白及干燥块茎粉碎成细粉,加水使料液比达(8-15):1,加热至70-80℃提取1.5-2.5h,提取2次,过滤定容,所得滤液浓缩之相对密度为1.0-1.2,加无水乙醇使乙醇浓度为75%,静置5-7h,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至稠膏状,得到土木香提取物。
优选地,白及提取物的制备方法为:取白及干燥块茎粉碎成80目细粉,加水使料液比达11:1,加热至75℃提取2h,提取2次,过滤定容,所得滤液浓缩之相对密度为1.1,加无水乙醇使乙醇浓度为75%,静置6h,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至稠膏状,得到土木香提取物。
本发明的第二个目的是提供了一种复方组合物在制备用于防治马拉色菌属病菌引起的皮肤疾病的药物中的应用,所述复方组合物为上述的复方组合物。
进一步的,上述的应用,所述马拉色菌属病菌为球形马拉色菌、糠秕马拉色菌、钝形马拉色菌及合轴马拉色菌;所述药物中,还包括有有效的药物载体、丙二醇和水。
本发明的特点及优点是:
本发明复方组合物,采用了纯中药提取物,苦豆子、马桑、木土香和白及,分别采用不同的提取方法进行提取,再复配得到的复方组合物,其原料来源广泛,经前期试验,能够较好的抑制多种马拉色菌,也具有良好的马拉色菌相关皮肤疾病防治效果,且无副作用,可以起到良好的治疗效果;为防治马拉色菌相关性皮肤病,开发安全、绿色、天然、副作用小的中草药复方洗剂或相关护理产品奠定了坚实的基础。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:
苦豆子提取物,取苦豆子粉碎成细粉,加入浓度为65%的乙醇,浸泡1h后,进行回流提取6h,过滤,定容,所得滤液减压浓缩至相对密度为1.05,加水搅匀,静置4.5h,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至相对密度为1.05的清膏,将清膏在pH8.5下静置、离心分离,所得的上清液减压浓缩至相对密度为1.1,得到苦豆子提取物。
苦豆子提取物也可以直接从企业购买。
苦豆碱,分子式:C15H24N2,分子量:232.365,分子结构如式Ⅰ所示:
式Ⅰ;
槐定碱,分子式:C15H24N2O分子量:248.37,分子结构如式Ⅱ所示:
式Ⅱ;
槐果碱,分子式:C15H22N2O 分子量:246.35,分子结构如式III所示:
式III。
以上3种单体成分都可在市场上直接购买得到,可通过高效液相色谱法对其进行含量分析。
本发明用于防治马拉色菌引起的皮肤性疾病的天然药物提取物或复方组合物,由以下配比的有效成分组成:
苦豆子提取物8-12份、马桑提取物0-5份、土木香提取物0-5份、白及提取物0-5份。该组合物可采用常规加工方法,制成纯中药洗剂、祛屑化妆品等。
本发明在制备防治痤疮药物中的应用:
苦豆子提取物10份、马桑提取物3份、土木香提取物3份、白及提取物3份,组成的复方组合物,可抑制马拉色菌的生长和繁殖,表明该组合物对马拉色菌致病的各种疾病有明显的作用。
实施例2:
1. 试验药物:苦豆子采自宁夏盐池县,由宁夏大学李小伟教授鉴定为豆科槐属植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.)的地上部分,自然晾干,备用。马桑、土木香和白及为安徽亳州药材市场购买。槐定碱(批号:190726-3)、苦豆碱(批号:190917-2)、槐果碱(批号:190922-3)购自宁夏都顺生物科技有限公司,酮康唑(批号:M1120A)购自美仑生物科技有限公司。
2. 菌株:球形马拉色菌(CBS9757),糠秕马拉色菌(CBS1878),钝形马拉色菌(CBS8176),合轴马拉菌(CBS9593),以上标准菌株均购自中国医学科学院皮肤病研究所医学真菌保藏中心,并保存于宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心微生物研究室-70℃冰箱中。
3. 培养基配制:
马拉色菌固体培养基:1%蛋白胨、2%琼脂、1%葡萄糖、0.2%酵母提取物、0.05%单硬脂酸甘油脂、0.5%吐温-60、1%甘油、0.8%牛胆盐及2%橄榄油,定容至1000mL,pH7.0-7.2。液体培养基中不加琼脂,其余成分相同。
4. 试剂:蛋白胨、酵母提取物、琼脂均购于青岛海博生物技术有限公司,葡萄糖、牛胆盐、甘油、橄榄油、吐温20、吐温-60等购自上海易汇生物科技有限公司,无水乙醇等分析纯试剂购自西安化学试剂厂。
5. 仪器与设备
EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);RE-52A真空旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DHP-9162智能型电热恒温培养箱(上海琅轩实验设备有限公司);YJ-875型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);YXQ-LS-50S立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司);iMark酶标仪(美国伯乐生命医学产品有限公司);TU1901紫外可见分光光度计(上海普析通用有限公司)等。
6. 试验过程
(1)原料提取物的制备:
苦豆子提取物的制备方法为:取苦豆子细粉,精密称定,分别加入 65%乙醇,浸泡1h后,进行回流提取6h,滤过,定容作为提取液。回流提取后过滤,所得滤液减压浓缩至相对密度为1.05,加水搅匀,静置4.5h,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至相对密度为1.05的清膏,将清膏在pH8.5下静置、离心分离,所得的上清液减压浓缩至相对密度为1.1,并将苦豆子提取物溶解于水中,使其浓度为50mg/mL。
马桑提取物的制备方法为:取马桑叶粉碎成粗粉,加100000 u/g的纤维素酶以酶用量为4.5mg/g,在pH7溶液中保温4h,再加入无水乙醇至乙醇终浓度为55%,料液比9:1,加热回流提取2次,每次2h,过滤,减压浓缩至相对密度为1.05,加水搅匀,静置过夜,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至稠膏状,得到马桑提取物。
土木香提取物的制备方法为:取土木香根粉碎过80目筛得细粉,加入70 %乙醇,浸泡过夜, 40℃搅拌浸提3 h,减压抽滤,滤渣再次加入200 mL 95%乙醇,35℃,140r/min振荡浸提3 h,减压抽滤,合并上述2次滤液,减压浓缩至稠膏状,得到土木香提取物。
白及提取物的制备方法为:取白及干燥块茎粉碎成80目细粉,加水使料液比达11:1,加热至75℃提取2h,提取2次,过滤定容,所得滤液浓缩之相对密度为1.1,加无水乙醇使乙醇浓度为75%,静置6h,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至稠膏状,得到土木香提取物。
苦豆子提取物、马桑提取物、土木香提取物和白及提取物的复合物组方如下:
复合物组一:苦豆子提取物9份、马桑提取物1份、土木香提取物1份、白及提取物1份。
复合物组二:苦豆子提取物11份、马桑提取物4份、土木香提取物4份、白及提取物4份。
复合物组三:苦豆子提取物10份、马桑提取物3份、土木香提取物3份、白及提取物3份。
复合物组四:苦豆子提取物10份、马桑提取物3份、土木香提取物3份。
复合物组五:苦豆子提取物10份、马桑提取物3份、白及提取物3份。
复合物组六:苦豆子提取物10份、土木香提取物3份、白及提取物3份。
复合物组七:苦豆子提取物10份、马桑提取物3份。
复合物组八:苦豆子提取物10份、白及提取物3份。
复合物组九:苦豆子提取物10份、土木香提取物3份。
复合物组十:马桑提取物3份、土木香提取物3份、白及提取物3份。
(2)阳性药物酮康唑和苦豆子提取物中主要生物碱及不同配比的配制:
将酮康唑、槐果碱和苦豆碱完全溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,加入一定量的超纯水,使药液浓度为1mg/mL,25mg/mL和25mg/mL。槐定碱溶解于超纯水中,使其浓度为25mg/mL。苦豆子提取物Ⅰ(含有苦豆碱:槐定碱1:2)、苦豆子提取物Ⅱ(含有苦豆碱:槐定碱1:4)、苦豆子提取物Ⅲ(含有苦豆碱:槐定碱1:3)、苦豆子提取物Ⅳ(含有苦豆碱:槐定碱:槐果碱1:3:1)
(3)菌株的活化和菌悬液的制备:
将低温保藏的受试菌株在马拉色菌固体培养基上连续传代培养2 次,第2次将球形、合轴和糠秕马拉色菌在35℃,钝形马拉色菌在30℃传代培养2d ,取菌落用1mL无菌生理盐水制成菌悬液,移液枪吹打均匀,用麦氏比浊管调整为0.5个麦氏单位,然后用马拉色菌液体培养基将菌悬液浓度稀释为(1~5)×106 CFU/L(CFU,Colony-Forming Units),备用。
(4)不同试药的抑菌活性测定:
采用牛津杯法进行体外抗菌活性试验。于马拉色菌固体培养基平板表面接种100μL 稀释好的菌悬液并用涂布器涂布均匀。并用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中,在水平放置的平皿中均匀地放置3只牛津杯。吸取一定浓度的上述药物溶液0.2mL至牛津杯中,注意不要溢出牛津杯外。钝形马拉色菌30℃和其余3种马拉色菌35℃培养48~72 h。观察结果,并用游标卡尺测量抑菌圈直径(mm)。平行进行3次试验,以3次结果相同为准,抑菌圈直径结果以3次的平均值进行计算。根据抑菌圈的大小,初步判断细菌对药物的敏感性。抑菌效果判定:抑菌圈直径>20mm为极敏感,15~20mm为高度敏感,10~15mm为中度敏感,抑菌圈<10mm为低度敏感,“-”为无抑菌活性。抗菌药的抑菌圈以临床和实验室标准研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute)制定的标准判定。
(5)最小抑菌浓度测定
根据美国临床和实验室标准化研究所针对酵母菌制定的M27-A3方案中微量液体培养基倍比稀释法,测定各种提取物、苦豆子生物碱和不同复合物组别抗马拉色菌的MIC值。取无菌96孔培养板,于每孔中加入培养液100 μ L,然后在第2列每孔加入受试药物100μ L,混匀后取出100 μ L移至第2排中,以此类推进行倍比稀释直至第9列混匀后弃掉 100μ L,使稀释后各孔中的受试药物浓度倍比减少,第1-10列每孔加入马拉色菌的菌悬液100μL,其中第10列作阳性对照,第11列孔中加药物作阴性对照,第12列孔中加入100 μL纯化水作为空白对照。将培养板置于30或 35℃ 恒温箱中,培养 48~72 h观察结果,及时观察生长情况,以阳性对照孔生长良好为准,取无肉眼可见菌生长的最低药物浓度孔位作为该活性成分的MIC。
(6)XTT 法检测苦豆子提取物对马拉色菌存活率的影响
将球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌加入液体培养基中,充分吹打均匀,调节浓度为 1×106 CFU/ml。根据苦豆草提取物Ⅳ、复合物组别二和复合物组别三的体外药敏试验MIC 结果,将最优浓度的苦豆子提取物Ⅳ、复合物组别二和复合物组别三加入马拉色菌培养体系,37℃ 培养。同时设立球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌单独培养组为对照,各组设3 个复孔。在培养第 24 小时,按照 XTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Kit 的操作流程,将制备的工作液分别加入各试验组和对照组的马拉色菌培养体系,置于37℃培养箱孵育2h。用酶标仪检测 450 nm 波长下的吸光度。真菌存活率 =(试验组吸光度/对照马拉色菌组吸光度) × 100%。
(7)马拉色菌脂肪酶活性测定
马拉色菌脂肪酶能够在体外水解硝基苯基棕榈酸酯 ( pNPP) ,并释放硝基苯酚( pNP) 。通过测定培养上清液中 pNP 的吸光度,可以提示脂肪酶的活性。球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌加入液体培养基,调节浓度为 1 × 106 CFU/ml马拉色菌,将最优浓度的苦豆子提取物Ⅳ、复合物组别二和复合物组别三加入马拉色菌培养体系,37℃ 培养。同时设立球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌单独培养组为对照,各组设 3 个复孔。培养结束时,吸取各培养组上清液0.05mL加入含 1% Triton-X、1mM pNPP 的 PBS 缓冲液,总体积5mL,37℃ 孵育 1 小时。用分光光度计检测 405 nm 波长下的吸光度。参照预先绘制的 pNP 浓度和吸光度的标准曲线,计算各组 pNP 浓度。
(8)马拉色菌脂质利用活性测定
马拉色菌摄取脂质后会释放游离脂肪酸,测定游离脂肪酸的含量,可以判断马拉色菌利用脂质的能力。分别将 10mM Tween-20和 Tween-60 100mL 加入不同组液体培养基中。球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌加入液体培养基,调节浓度为 1 × 106 CFU/ml,将最优浓度的苦豆子提取物Ⅳ、复合物组别二和复合物组别三加入马拉色菌培养体系,37℃培养。同时设立球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌单独培养组为对照,各组设 3 个复孔。培养24 小时后吸取各组培养液上清,按照NEFA测定试剂盒说明,使用试剂盒检测上清液中游离脂肪酸。用分光光度计检440nm波长下的吸光度,计算游离脂肪酸的浓度。公式如下:培养液中NEFA含量(μmol/L)=(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)× 标准品浓度(1000μmol/L)。
7. 试验结果
(1)苦豆子提取物及不同复合物组别对4株不同马拉色菌的抑菌活性
从表1得知,以苦豆子提取物Ⅰ—Ⅳ、槐定碱、苦豆碱、槐果碱、不同复合物组别(复合物中的苦豆子提取物均采用苦豆子提取物Ⅳ的配比)对球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌均有不同程度的抑制作用。复合物组三对球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌的抑菌作用最为明显,其抑菌圈直径达到32.4,25.8,29.1和30.3 mm,为极敏感。苦豆子提取物Ⅳ的抑菌作用也较强,其中对球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌均为极敏感,其抑菌圈直径达到24.3,21.8,25.4和23.5 mm。阳性对照1.0 mg/mL酮康唑对球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌的抑菌圈直径分别为25.6mm、20.3mm、24.4mm和27.1mm。表1显示为苦豆子提取物Ⅰ—Ⅳ及组分、马桑提取物、土木香提取物、白及提取物和复合物对不同菌种的抑菌圈大小(mm,X + S,n=3)。
表1
(2)苦豆子提取物及其组分及不同提取物复合物对不同菌株的最小抑菌浓度测定
由表2可以看出:复合物组三对球形、合轴和钝形马拉色菌的抑菌效果较好,其MIC为0.19 mg/mL,对糠秕马拉色菌MIC的为0.39 mg/mL,其值最低,抑菌效果最明显。苦豆子提取物Ⅳ对4种马拉色菌的MIC为1.56和3.12 mg/mL。阳性对照酮康唑对4种马拉色菌的MIC都较低,为0.12和0.50 mg/mL。
试验过程中,阳性对照组始终生长旺盛,说明菌株在此培养基上生长良好,空白对照组始终无菌生长,说明试验过程中,无菌污染,测定结果可靠。
表2显示为苦豆子、马桑、土木香和白及提取物、槐定碱、苦豆碱、槐果碱和不同提取物组合物对4株马拉色菌的最小抑菌浓度(mg/ml)。
表2
(3)苦豆子提取物Ⅳ及复合物抑制马拉色菌的存活率
球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌分别单独培养 24 小时,真菌存活率分别为98.8%、100.5%、102.8%和99.9%,苦豆子提取物Ⅳ及较优组别物对4株马拉色菌培养 24 小时后,马拉色菌的存活率受到明显抑制,该结果提示苦豆草提取物Ⅳ和复合物在体外抑制马拉色菌的存活率达到抗真菌的作用,其中复合物三比复合物二和苦豆草提取物抑制的马拉色菌存活率更低,说明复合物三抑制马拉色菌的效果更强。XTT法检测苦豆子提取物Ⅳ及复合物对4株马拉色菌存活率的影响( + S,n=3)如下表3所示:
表3
(4)苦豆子提取物Ⅳ及复合物抑制马拉色菌脂肪酶活性:
由表7看出,各试验组和对照组马拉色菌在体外培养24 小时后,与球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌对照培养组相比,苦豆子提取物Ⅳ及较优组合物组分抑制了马拉色菌的脂肪酶活性,结果提示,苦豆子提取物Ⅳ及复合物除了可以抑制4株马拉色菌的存活率,对马拉色菌主要致病因子脂肪酶的活性也有抑制作用,其中复合物组三处理组中硝基苯酚释放量最低,提示复合物组三抑制马拉色菌脂肪酶活性更强。马拉色菌脂肪酶诱导硝基苯酚释放量( + S,n=3)如下表4所示:
表4
(5)苦豆子提取物Ⅳ及复合物抑制了糠秕马拉色菌对脂质的利用:
球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌在体外能够以吐温20,60为原料生长,分解吐温的过程中会释放游离脂肪酸。经过24 小时培养,4株马拉色菌利用吐温-20和吐温-60产生的游离脂肪酸均被苦豆子提取物Ⅳ及复合物显著抑制,由表5得出,苦豆子提取物Ⅳ、复合物组二和三对球形、糠秕、合轴和钝形马拉色菌利用脂质的能力具有广泛的抑制作用,其中复合物组三游离脂肪酸释放量最小,表明其对马拉色菌利用脂质的能力有很强的抑制作用。马拉色菌分离脂质释放游离脂肪酸水平(+ S,n=3)如下表5所示:
表5
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种复方组合物,其特征在于,是由按照重量份计的以下原料制备得到的:苦豆子提取物8-12份、马桑提取物0-5份、土木香提取物0-5份、白及提取物0-5份;所述苦豆子提取物中,包含有苦豆碱和/或槐定碱。
2.根据权利要求1所述的一种复方组合物,其特征在于,是由按照重量份计的以下原料制备得到的:苦豆子提取物9-11份、马桑提取物1-4份、土木香提取物1-4份、白及提取物1-4份。
3.根据权利要求1所述的一种复方组合物,其特征在于,是由按照重量份计的以下原料制备得到的:苦豆子提取物10份、马桑提取物3份、土木香提取物3份、白及提取物3份。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种复方组合物,其特征在于,所述苦豆子提取物中,包含有按照质量比计为1:(2-4)的苦豆碱和槐定碱。
5.根据权利要求4所述的一种复方组合物,其特征在于,所述苦豆子提取物的制备方法为:取苦豆子粉碎成细粉,加入浓度为60-70%的乙醇,浸泡0.5-1.5h后,进行回流提取5-7h,过滤,定容,所得滤液减压浓缩至相对密度为1.0-1.1,加水搅匀,静置3-6h,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至相对密度为1.0-1.1的清膏,将清膏在pH8-9下静置、离心分离,所得的上清液减压浓缩至相对密度为1.05-1.15,得到苦豆子提取物。
6.根据权利要求4所述的一种复方组合物,其特征在于,所述马桑提取物的制备方法为:取马桑叶粉碎成粗粉,加100000 u/g的纤维素酶,以酶用量为2-7mg/g,在pH6.0-7.5溶液中保温3-5h,再加入无水乙醇至乙醇终浓度为50-60%,料液比(6-12):1,加热回流提取2次,每次1.5-2.5h,过滤,减压浓缩至相对密度为1.0-1.1,加水搅匀,静置过夜,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至稠膏状,得到马桑提取物。
7.根据权利要求4所述的一种复方组合物,其特征在于,所述土木香提取物的制备方法为:取土木香根粉碎过70-90目筛得细粉,加入60%-70 %乙醇,浸泡过夜, 35-45℃搅拌浸提2.5-3.5 h,减压抽滤,滤渣再次加入180-220mL 95%乙醇,30-40℃,130-150r/min振荡浸提2.5-3.5 h,减压抽滤,合并上述2次滤液,减压浓缩至稠膏状,得到土木香提取物。
8.根据权利要求4所述的一种复方组合物,其特征在于,所述白及提取物的制备方法为:取白及干燥块茎粉碎成70-90目细粉,加水使料液比达(8-15):1,加热至70-80℃提取1.5-2.5h,提取2次,过滤定容,所得滤液浓缩之相对密度为1.0-1.2,加无水乙醇使乙醇浓度为75%,静置5-7h,沉淀后离心分离,所得上清液减压浓缩至稠膏状,得到土木香提取物。
9.一种复方组合物在制备用于防治马拉色菌属病菌引起的皮肤疾病的药物中的应用,其特征在于,所述复方组合物为权利要求1-8任一所述的复方组合物。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述马拉色菌属病菌为球形马拉色菌、糠秕马拉色菌、钝形马拉色菌及合轴马拉色菌;所述药物中,还包括有有效的药物载体、丙二醇和水。
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