CN110183309A - 一种从工业大麻根中提取抑菌物的方法及抑菌物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从工业大麻根中提取抑菌物的方法，属于植物有效成份提取领域，该方法包括：1)将工业大麻根进行预处理，制得粉碎后的大麻根；2)将预处理后的大麻根和乙醇溶液混合以提取根混合物；3)将根混合物减压浓缩以制的抑菌物；本发明还公开了一种按照上述所述方法以及改进的方法以及按照上述方法所提取的抑菌物。

Description

一种从工业大麻根中提取抑菌物的方法及抑菌物
技术领域
本发明涉及工业大麻提取领域。
背景技术
工业大麻是指四氢大麻酚含量低于0.3％的大麻，我国将工业大麻称为汉麻，是大麻科大麻属1年生草本植物，分为工业大麻和毒品大麻，现在国内外广泛应用的大麻为工业大麻。
目前国内外关于大麻化学成分的文献报发表较多，大麻化学成分及结构非常复杂，结构复杂主要以次生代谢产物为主等。迄今为止，从大麻全植物中分离鉴定出了500多种化合物，分为大麻素化合物和非大麻素类化合物。
大麻素类化合物具有多种生理活性，可治疗青光眼，降低眼压；抑制和抗肿瘤；缓解疼痛等。大麻提取物具有抑制肿瘤扩散转移的作用能够保护神经，具有抗炎作用。在对植物治病真菌黑曲霉和产黄青霉的抑菌作用中，提取物中的大麻素类化合物具有不同程度的抑制作用，大麻叶中的黄酮类物质cannflavin A和cannflavin B具有抑制类风湿的功效，并具有抗疟疾、黑热病的作用。
大麻具有抗菌、除臭的作用，它含有微量的大麻酚类物质和十多种对人体健康有益的微量元素。根据国内外有关研究报告和军事医学院微生物流行病研究所测试，大麻制品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、青霉、曲霉等有明显的杀灭、抑制作用。
工业大麻的花叶用于提取化学物质CBD，茎主要用来作为大麻纤维，而目前对大麻的根研究较少，根的利用很少见，大麻的根具有非常多的纤维，粉碎处理起来极为困难，也限制了对大麻根的研究利用。现有的文献也没有记载大麻根具有抑制真菌的效果，同时现如今的大多数大麻茎叶提取物的抑菌多针对食源性的细菌，对真菌的研究及产品较少，也存在提取工艺繁琐，效率不高等问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现在技术的空白和缺陷，提出了在大麻根中提取抑菌物质并公开了这种提取抑菌物质的方法，所述的根提取物抑菌物质能够有效的抑制真菌，可作为天然的抗真菌剂，用于生物农药或治疗脚气病。
在本发明提取的根提取物中，经检测含有大量的大麻素类物质和环萜类化合物，其中主要为CBD、CBDV、CBN以及齐墩果酸和齐墩果烯；该提取物对油菜菌核菌、水稻白叶枯、稻曲菌、稻瘟病菌、小麦赤霉菌、马铃薯早疫、玉米纹枯病菌、玉米生平脐蠕孢、烟草赤星、西瓜枯萎、灰霉、层生镰刀菌、苹果炭疽病菌等植物致病菌，以及红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、絮状表皮癣菌等致脚气菌，均有不同程度的抗菌效果。
本发明的抑菌物包括直接从根中提取的抑菌物、通过进一步的工艺从石油醚相提取的抑菌物、通过进一步的工艺从乙酸乙酯相提取的抑菌物。
在本发明中，本发明提供了一种从工业大麻根中提取抑菌物的方法，该方法包括：
1)将工业大麻根进行预处理，制得粉碎后的大麻根；
2)将预处理后的大麻根和乙醇溶液混合以提取根混合物；
3)将根混合物减压浓缩以制的抑菌物。
为了使得大麻根能够满足处理的工艺条件，在预处理的时候通常包括对采摘的大麻根进行洗净、干燥、粉碎等工艺操作，特别的根据大麻根纤维多、难处理的特点，粉碎采用中药铡刀切片后，采用自吸式粉碎机对其进行粉碎以能够达到提取要求。
在一个具体的实施例中，所述步骤2粉碎后的大麻根和乙醇溶液的料液比为1∶10～1∶20，以达到最佳的提取效果。
在一个具体的实施例中，所述的步骤3的减压浓缩是在40℃～60℃下完成。
在一个具体的实施例中，在减压浓缩以制得抑菌物后，进一步的将抑菌物和水混合，用石油醚萃取，得到石油醚相抑菌物，其中所述的石油醚相抑菌物成份和效果不同于直接减压浓缩制得的抑菌物。进一步的，为了获得石油醚相抑菌物中的成分物，在一个处理工艺中，将石油醚相抑菌物与硅胶拌样后，按质量比为1∶5～50装柱，进行硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯做洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1，每个梯度收集两个柱体积；收集每个梯度洗脱液，浓缩蒸干，结晶，分别得到化合物A-C以及其他大麻素类物质，其中化合物A-C的结构和名称如下文所记载。
在另一个具体的实施例当中，在减压浓缩以制得抑菌物后，进一步的将抑菌物和水混合，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相抑菌物。进一步的，为了获得乙酸乙酯相抑菌物的成份，将乙酸乙酯相抑菌物与大孔树脂按质量比为1∶5～50装柱，进行柱层析，用乙醇/水做洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为乙醇、80％乙醇、60％乙醇、40％乙醇，每个梯度收集两个柱体积，收集40％-60％乙醇洗脱液，浓缩蒸干，得到浸膏，浸膏依次通过C18中压色谱柱层析、MCI中压色谱柱层析，分别得到化合物D、E以及其他环萜类物质，其中化合物D和E的结构和名称如下文记载。
本发明同时公开了上述方法制备的抑菌物，所述的抑菌物包括直接减压浓缩制备的抑菌物、从石油醚相萃取的抑菌物、从乙酸乙酯相萃取的抑菌物。具体而言，直接减压浓缩制备的抑菌物包括大麻二酚、次大麻二酚、大麻酚、齐墩果烯、齐墩果酸的一种或多种。从石油醚相萃取的抑菌物包括大麻二酚(CBD)、次大麻二酚(CBDV)、大麻酚(CBN)。从乙酸乙酯相萃取的抑菌物包括齐墩果烯、齐墩果酸。
附图说明
图1是化合物A的分子结构图；
图2是化合物B的分子结构图；
图3是化合物C的分子结构图；
图4是化合物D的分子结构图；
图5是化合物E的分子结构图。
具体实施方式
下面对本发明作详细的说明。
通用技术和定义
除特殊说明外，本文使用的所有科技术语均应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。如无特说明，本发明的抑菌物是指从大麻根的提取物或者指大麻根提取物浸膏。
一、抑菌物质提取和分离
1)抑菌物质的提取：
将1kg工业大麻根在洗净、干燥、粉碎后，加入10kg 95％的乙醇溶液中渗漉提取，得到渗漉液；将渗漉液在55℃下减压浓缩，回收溶剂，得工业大麻根提取物浸膏(抑菌物)约760g。
2)不同相的抑菌物的提取：
将上述浸膏(抑菌物)加水混悬，然后依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取分别萃取1～3次，回收溶剂，得到石油醚相(PE)370g、乙酸乙酯相(EA)200g、正丁醇相(BA)110g及水相(W)60g四个相的浸膏。
3)石油醚相浸膏的成份分离：
将石油醚相浸膏用少量硅胶拌样后装柱，进行硅胶柱层析，柱体积1.7L。用石油醚/乙酸乙酯做洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1，每个梯度收集两个柱体积；所得各洗脱液通过HPLC分析检测，收集每个梯度洗脱液，浓缩蒸干，结晶，分别得到化合物A-C以及其他大麻素类物质，其中化合物A为大麻二酚(CBD)，化合物B为次大麻二酚(CBDV),化合物C为大麻酚(CBN)，分子结构式见附图1-3。
4)乙酸乙酯相浸膏的成份分离：
将工业大麻根提取物乙酸乙酯相与大孔树脂按质量比为1:5～50装柱，进行柱层析，用乙醇/水做洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为乙醇、80％乙醇、60％乙醇、40％乙醇，每个梯度收集两个柱体积，通过HPLC分析检测，收集40％-60％乙醇洗脱液，浓缩蒸干，得到浸膏。浸膏依次通过C18中压色谱柱层析、MCI中压色谱柱层析，通过HPLC分析检测，收集每个梯度洗脱液，浓缩蒸干，结晶，分别得到化合物D、E以及其他环萜类物质，化合物D为齐墩果烯、化合物E为齐墩果酸，分子结构式见附图4-5。
二、抑菌性能试验
1)药液制备
分别取工业大麻抑菌物浸膏、石油醚相浸膏、乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相(BA)浸膏及水相(W)浸膏，分别制成药液浓度为0.1g/mL～0.25g/mL，并且用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，备用。
分别取纯化后A-E化合物，制成药液浓度为0.1mg/mL～0.25mg/mL，提取液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，备用。
2)抑菌实验
2.1供试菌种：油菜菌核菌、水稻白叶枯、稻曲菌、稻瘟病菌、小麦赤霉菌、马铃薯早疫、玉米纹枯病菌、玉米生平脐蠕孢、烟草赤星、西瓜枯萎、灰霉、层生镰刀菌、苹果炭疽病菌、红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、絮状表皮癣菌
2.2实验方法
(1)培养基平板的制备：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，加塞、包扎；120℃灭菌20min左右后，冷至50-60℃，在紫外线灭过菌的洁净工作台内，摇匀后倒入无菌的9cm培养皿内，每皿15-20mL，半开皿盖，通风半个小时左右，直至平板内培养基凝固，无肉眼可见的水滴，合上皿盖，备用。
(2)利用不同的药液，制备不同的药物平板，并分别加入各培养皿，取6mm相应的菌块(菌块为上述列出的16种真菌的菌块)放入不同浓度的药物平板上，将平板倒置于28℃的细菌培养箱中培养72h，观察菌丝生长情况。空白对照组在培养皿中仅加入甲醇溶液，阳性对照组在培养基加入配制好的水杨酸(工作浓度50μg/mL)，其他操作与实验组一致。
实验结果如下：
表1工业大麻根提取物对不同菌种的抑菌作用
-表示未出现抑菌作用；+表示抑菌作用为10％-40％；++表示抑菌作用为40％-70％；+++表示抑菌作用大于70％。
从表1的抑菌效果来看，工业大麻根提取物对表中的真菌均有不同程度的抑菌作用，其中对西瓜枯萎抑菌效果最佳，对油菜菌核菌、烟草赤星以及苹果炭疽病菌抑菌效果较差。HPLC及分光光度计检测大麻根提取物，其中大麻素类物质占45％，环萜类占60％，其余为多糖物质和脂肪酸。THC含量低于0.03％。
菌种 空白 水杨酸 PE EA BA W
油菜菌核菌 - +++ +++ - - -
水稻白叶枯 - +++ +++ ++ - -
稻曲菌 - +++ ++ ++ - -
稻瘟病菌 - +++ ++ ++ - -
小麦赤霉菌 - +++ ++ + - +
马铃薯早疫 - +++ + + + +
玉米纹枯病菌 - +++ + - + -
玉米生平脐蠕孢 - +++ + - + -
烟草赤星 - +++ ++ ++ - +
西瓜枯萎 - +++ ++ + - -
灰霉 - +++ + - + +
层生镰刀菌 - +++ + ++ - -
苹果炭疽病菌 - +++ + ++ - -
红色毛癣菌 - +++ ++ + - +
石膏样毛癣菌 - +++ ++ + + -
絮状表皮癣菌 - +++ + - - -
表2不同相浸膏的抑菌作用
-表示未出现抑菌作用；+表示抑菌作用为10％-40％；++表示抑菌作用为40％-70％；+++表示抑菌作用大于70％
从表2的抑菌数据上看，PE相和EA相的抑菌效果最好，BA相和W相几乎没有抑菌作用，可见在大麻根提取物中，能够起到抑菌作用的成份在后续的提取过程当中主要分布在PE相和EA相中。HPLC及分光光度计检测大麻根提取物石油醚相，其中大麻素类物质占75％以上，THC含量低于0.03％；检测大麻根提取物乙酸乙酯相环萜类占65％以上。在石油醚相中主要为大麻素类物质，乙酸乙酯相中主要为环萜类物质。
菌种 空白 水杨酸 A B C D E
油菜菌核菌 - +++ ++ + - + -
水稻白叶枯 - +++ ++ ++ + - +
稻曲菌 - +++ ++ ++ + + -
稻瘟病菌 - +++ ++ + + + +
小麦赤霉菌 - +++ +++ + + + +
马铃薯早疫 - +++ + ++ - - +
玉米纹枯病菌 - +++ ++ + ++ - -
玉米生平脐蠕孢 - +++ ++ + ++ - -
烟草赤星 - +++ ++ ++ - + -
西瓜枯萎 - +++ +++ ++ ++ + +
灰霉 - +++ + + ++ + +
层生镰刀菌 - +++ ++ ++ + - -
苹果炭疽病菌 - +++ ++ + - - +
红色毛癣菌 - +++ +++ ++ ++ + +
石膏样毛癣菌 - +++ ++ + + - -
絮状表皮癣菌 - +++ +++ + - - -
表3各成份的抑菌效果
-表示未出现抑菌作用；+表示抑菌作用为10％-40％；++表示抑菌作用为40％-70％；+++表示抑菌作用大于70％。
从表3的数据综合来看，化合物A对各真菌的抑菌效果最好，其次是化合物B和化合物C，化合物D和化合物E对各细菌的抑菌效果较差。
(3)最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)检测：用配置好的工业大麻根提取物的药液按照倍比稀释为不同浓度，制备不同浓度的药物平板，并分别加入各培养皿。取6mm菌块(上述各真菌菌块)放入不同浓度的药物平板上，将平板倒置于28℃的细菌培养箱中培养72h，观察菌丝生长情况。空白对照组在培养皿中仅加入甲醇溶液，其他操作与实验组一致。
实验结果如表4所述：
表4不同浓度的工业大麻根提取物的抑菌作用
-表示未出现抑菌作用；+表示抑菌作用为10％-40％；++表示抑菌作用为40％-70％；+++表示抑菌作用大于70％。
从表4看出，针对不同菌种的最小抑菌浓度有所不同，如针对稻曲菌的最小抑菌浓度为0.025g/mL，对稻瘟病菌、红色毛癣菌(脚气病的致病菌之一)的最小抑菌浓度为0.05g/mL，对其他菌种的最小抑菌浓度为0.1g/mL，可见工业大麻根提取物对稻曲菌、稻瘟病菌、红色毛癣菌具有优异的抑菌效果，能够作为相应菌种引起的疾病的治疗手段。
如针对水稻白叶枯、稻曲菌、稻瘟病菌、烟草赤星、西瓜枯萎、层生镰刀菌、红色毛癣菌及石膏样毛癣菌(脚气病的致病菌)的最小抑菌浓度为0.0125g/mL，对其他菌种的最小抑菌浓度为0.025g/mL，可见工业大麻根提取物对实验所选的大多数真菌有优异的抑菌效果，能够作为相应菌种引起的疾病的治疗手段。

Claims (10)

1.一种从工业大麻根中提取抑菌物的方法，其特征在于，该方法包括：
1)将工业大麻根进行预处理，制得粉碎后的大麻根；
2)将预处理后的大麻根和乙醇溶液混合以提取根混合物；
3)将根混合物减压浓缩以制得抑菌物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的预处理的工艺包括对大麻根进行洗净、干燥、用中药铡刀切片后，采用自吸式粉碎机对其进行粉碎，以能够形成提取抑菌物的条件。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2粉碎后的大麻根和乙醇溶液的料液比为1:10～1:20。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3的减压浓缩是在40℃～60℃下完成。
5.根据权利要求1-4任一项所述提取抑菌物的方法，其特征在于，该方法还包括，将抑菌物和水混合，用石油醚萃取，得到石油醚相抑菌物。
6.根据权利要求5所述提取抑菌物的方法，其特征在于，该方法进一步包括将石油醚相抑菌物与硅胶拌样后，按质量比为1:5～50装柱，进行硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯做洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为100:1、80:1、60:1、40:1、20:1，每个梯度收集两个柱体积；收集每个梯度洗脱液，浓缩蒸干，结晶，分别得到化合物A、化合物B、化合物C以及其他大麻素类物质。
7.根据权利要求1-4任一项所述提取抑菌物的方法，其特征在于，该方法还包括，将抑菌物和水混合，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相抑菌物。
8.根据权利要求7所述提取抑菌物的方法，其特征在于，将乙酸乙酯相抑菌物与大孔树脂按质量比为1:5～50装柱，进行柱层析，用乙醇/水做洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为乙醇、80％乙醇、60％乙醇、40％乙醇，每个梯度收集两个柱体积，收集40％-60％乙醇洗脱液，浓缩蒸干，得到浸膏，浸膏依次通过C18中压色谱柱层析、MCI中压色谱柱层析，分别得到化合物D、化合物E以及其他环萜类物质。
9.一种按照权利要求1-4任一项所述的方法提取的抑菌物。
10.根据权利要求9所述的抑菌物，其特征在于，该抑菌物包括大麻二酚、次大麻二酚、大麻酚、齐墩果烯、齐墩果酸的一种或多种。
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