CN103142663B

CN103142663B - 从明日叶中提取香豆素类提取物的方法及产品和应用

Info

Publication number: CN103142663B
Application number: CN201310089721.XA
Authority: CN
Inventors: 刘贤贤; 义祥辉; 覃丽青; 王凯
Original assignee: Guilin Normal College
Current assignee: Guilin Normal College
Priority date: 2013-03-20
Filing date: 2013-03-20
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2033-03-20
Also published as: CN103142663A

Abstract

本发明公开了一种从明日叶中提取香豆素类提取物的方法及产品和应用。所述的方法为：取新鲜或干燥明日叶的叶子或茎，用50～65%体积的甲醇浸泡3～5h，再进行超声提取，过滤，滤渣再加入50～65%体积的甲醇超声提取1～2次，合并滤液，得到提取液，所得提取液浓缩或不浓缩，加入乙酸乙酯进行沉淀，抽滤，滤液浓缩，得到明日叶叶子的香豆素类提取物或明日叶茎的香豆素类提取物。与现有技术相比，本发明所述方法简单易操作，所得的香豆素类提取物具有较好的抗氧化活性，特别是明日叶叶子的香豆素类提取物对DPPH自由基的抗氧化活性明显优于芦丁的抗氧化活性。可见，其在制备天然、无毒的抗氧化药物或保健品中具有良好的应用前景。

Description

从明日叶中提取香豆素类提取物的方法及产品和应用

技术领域

本发明涉及植物中活性成分的提取，具体涉及从明日叶中提取香豆素类提取物的方法及产品和应用。

背景技术

明日叶(Angelica Keiskei Koidzumi)，原产地在日本著名的健康长寿之乡八丈岛，属原生芹科多年生草本植物。因其生命力强，生长快，大有“今日摘叶、明日又长新芽”之势，故称“明日叶”。其嫩茎叶可作蔬菜食用，全草可供药用。明日叶被誉为“21世纪的健康食品”，富含特有成分查耳酮类化合物和香豆素类化合物以及人体需要的多种矿物质、食物纤维、蛋白质、维生素、叶绿素、胡萝卜素和16种氨酸。据研究发现，明日叶含有抗人体衰老、血栓、癌，降血糖、血压、胆和改善肠胃道功能等成分，能治疗和预防26种疾病，其中降血糖、血压效果最明显。

现有对明日叶提取物的研究主要为其中查耳酮类化合物的提取，如公开号为CN102020544A的发明专利公开了一种明日叶中查耳酮类成分的提取工艺，是选取明日叶的干燥茎叶，粉碎，用乙醇进行热浸提取，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味得到流浸膏；用水溶解流浸膏后用乙酸乙酯进行萃取，减压回收乙酸乙酯得萃取物，即得查耳酮粗品，查耳酮粗品采用AB-8大孔吸附树脂柱进行分离纯化，即得。但目前尚未见有从明日叶中提取香豆素类化合物及其应用的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从明日叶中提取香豆素类提取物的方法及产品和应用。该方法简单易操作，所得香豆素类提取物抗氧化活性优良。

本发明所述的从明日叶中提取香豆素类提取物的方法为：取新鲜或干燥明日叶的叶子或茎，用50～65%体积的甲醇浸泡3～5h，再进行超声提取，过滤，滤渣再加入50～65%体积的甲醇超声提取1～2次，合并滤液，得到提取液，所得提取液浓缩或不浓缩，加入乙酸乙酯进行沉淀，抽滤，滤液浓缩，得到明日叶叶子的香豆素类提取物或明日叶茎的香豆素类提取物。当采用新鲜的明日叶作为原料时，所得提取物中香豆素类成分的含量为30～55%(重量)，其中，所得的明日叶叶子的香豆素类提取物中香豆素类成分的含量为50～55%(重量)，明日叶茎的香豆素类提取物中香豆素类成分的含量为30～35%(重量)。

上述提取方法中，超声提取的条件为：温度为40～50℃，频率为60～200Hz，每次超声提取0.5～2h。超声提取的频率优选为80～100Hz。每次超声提取时，甲醇的加入量通常为原料重量的2～3倍。

上述提取方法中，作为原料的明日叶优选采用新鲜的(干燥的明日叶中香豆素的含量较低)，在浸泡时甲醇的用量为原料重量的2～3倍。当所得的提取液要进行浓缩时，通常是浓缩至提取液体积的1/2～1/5，然后用相当于浓缩液体积1.5～5倍的乙酸乙酯进行沉淀；也可以是先浓缩至浸膏，然后再将浸膏用相当于浸膏重量4～5倍的无水甲醇溶解，再用相当于浸膏重量1.5～5倍的乙酸乙酯进行沉淀。溶解可在40～60℃的水浴条件下进行，最好是在40～60℃的水浴中超声溶解，超声的条件与上述相同。

上述提取方法中，抽滤之后所得的滤液，通常是浓缩到提取液体积的0.2～0.3倍，也可以浓缩至干。

本发明还包括由上述方法制得的香豆素类提取物。

本发明进一步还包括由上述方法制得的香豆素类提取物在制备具有抗氧化作用的药物或保健品中的应用。

具体的应用方法可以是：取香豆素类提取物，加入或不加药用辅料，按照常规方法制备成药物制剂；或者是，取香豆素类提取物，加入或不加辅料，按照常规方法制备成保健品。

为了更好的理解本发明，下面通过抗氧化活性实验进一步验证从明日叶中提取的香豆素类提取物的抗氧化活性作用。

一、样品的制备，即明日叶香豆素类提取物的制备

取新鲜明日叶的叶子或茎，捣碎，用2～3倍原料重量的50～65%体积的甲醇常温浸泡3～5h，再进行超声提取0.5～2h，过滤，收集滤液，滤渣再加入2～3倍原料重量的50～65%体积的甲醇超声提取0.5～2h，过滤，收集滤液，滤渣再加入2～3倍原料重量的50～65%体积的甲醇超声提取0.5～2h，合并收集的滤液，得到提取液，所得提取液浓缩至浸膏，之后将浸膏用相当于浸膏重量(g)4～5倍体积(ml)的无水甲醇在40～60℃的水浴中超声溶解，再用相当于浸膏重量(g)1.5～5倍体积(ml)的乙酸乙酯进行沉淀，抽滤，滤液浓缩至提取液体积的0.2～0.3倍，得到明日叶叶子的香豆素类提取物或明日叶茎的香豆素类提取物。

上述超声提取的条件为：温度为40～50℃，频率为60～200Hz，每次超声提取0.5～2h。超声溶解的频率为60～200Hz。

二、香豆素含量测定

对照品溶液的配置：精密称取水合氧化前胡素内酯对照品3.0mg，置10ml量瓶中，加甲醇使其完全溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液2.5ml至25ml容量瓶中，定容。分别吸取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.7ml，用甲醇稀释定容到10ml量瓶中，摇匀，在307nm波长处测定吸光度。以水合氧化前胡素内酯对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

供试品溶液的配置：取提取物适量，加甲醇溶解定容至25ml量瓶中，摇匀。精密吸取1ml，加甲醇定容至10ml量瓶中，摇匀。

测定法：取供试品溶液在307nm波长处测定吸光度，按标准曲线法计算样品中香豆素成分总含量。

经测定(紫外分光光度法)，所得明日叶叶子的香豆素类提取物中香豆素类成分的含量为50%～55%(重量)，明日叶茎的香豆素类提取物中香豆素类成分的含量为30%～35%(重量)。

三、DPPH自由基清除活性测试(以芦丁为对照)：

苯代苦味肼基自由基(DPPH)一种稳定的N-中心自由基(λ_max=517nm)。随着DPPH浓度的下降，溶液的颜色会逐渐变浅，因此可以使用分光光度计对DPPH与抗氧化剂的反应进行监测，以得到溶液中剩余DPPH的百分率(%DPPH_rem)。

待测样品：明日叶叶子的香豆素类提取物(简称：明日叶的叶提取物)、明日叶茎的香豆素类提取物(简称：明日叶的茎提取物)。

对照品：芦丁(生化制剂BR)，上海市国药集团化学试剂有限公司生产，批号：F20110802。

参照文献(Liu,J.K,Hu,L.,Dong,Z.,J Hu,Q.DPPH radical scavengingactivity of ten natural p-terphenyl derivatives obtained from three ediblemushroom indigenous to China.2004,Chemistry&Biodiversity,1,601-605.)，将待测样品(明日叶的叶提取物、明日叶的茎提取物)、对照品(芦丁)分别用蒸馏水配制成不同浓度的乙醇或DMF样品溶液。将0.004%(w/v)DPPH乙醇溶液3.9mL分别加入到不同浓度的乙醇或DMF样品溶液0.1mL中，37℃恒温30min后或待反应平衡（吸光度达到稳定）时，测混合物在517nm下的吸光度，同时测定不含提取物的空白样品。并绘制DPPH自由基清除率对明日叶提取液浓度曲线，通过线形方程计算其对DPPH自由基清除的半抑制浓度（IC₅₀）。

每份样品平行操作3次。其中明日叶的叶提取物、明日叶的茎提取物、芦丁配置的浓度及对应浓度的清除率分别如下述表1所示；

表1：

明日叶叶子浓度(10^-4g/ml)	清除率%
		2.5	16.2
0.5	24.08
		0.75	37.85
1	51.73
		1.25	61.88
1.5	70.3
		明日叶茎浓度(g/ml)(10^-4g/ml)	清除率%
2.5	14.78

5	39.41
		7.5	64.03
10	72.91
		12.5	85.71
芦丁浓度(g/ml)	清除率%
		1	75.68
0.5	6.84
		0.1	11.66
0.05	79.8
		0.001	35.1
0.005	31.9

绘制的曲线图中，图1为明日叶的叶提取物的DPPH自由基清除率对明日叶的叶提取物的浓度曲线(空白=0.926)，图2为明日叶的茎提取物的DPPH自由基清除率对对明日叶的叶提取物的浓度曲线(空白=1.015)，图3为芦丁的DPPH自由基清除率对对明日叶的叶提取物的浓度曲线(空白=1.879)。

DPPH·自由基清除率(%)=(A₀-A_样)/A₀×100%

A₀与A_样分别代表自由基在517nm时空白与样品对DPPH自由基作用后的吸光度，然后作图求出线形方程，通过线形方程计算它们对DPPH自由基清除的半抑制浓度(IC₅₀值)。结果如下述表2所示：

表2：芦丁、明日叶的叶提取物、明日叶的茎提取物DPPH抗氧化的IC₅₀(g/ml)

样品	芦丁	明日叶的叶提取物	明日叶的茎提取物
				IC₅₀(g/ml)	5.83×10^-5	1.02×10^-5	7.09×10^-3

由表2中数据可知，明日叶的叶提取物的DPPH抗氧化活性比芦丁更好，明日叶的茎提取物的DPPH抗氧化活性比芦丁稍差，它们活性的顺序是：明日叶的叶提取物＞芦丁＞明日叶的茎提取物。

四、羟基自由基清除活性测试(以芦丁为对照品)：

1)参照文献(Jin M,Cai Y.X,Li J.R,et al.10-Phennanth ro line-Fe²⁺ox^-idative assay of hydroxyl radical produced by H₂O₂/Fe²⁺.Prog Biochem Biophys(生物化学与生物物理进展),1996,23(6):553-556)。精密量取150mmol/L pH=7.4PBS2.0mL、7.5mmol/L邻二氮菲0.2mL、7.5mmol/L FeSO₄0.2mL、不同浓度药物0.4mL、蒸馏水0.8mL和1%H₂O₂0.4mL于试管中，混匀作样品组,将各试管同时置于37℃恒温水浴中60min，于波长536nm处测吸光度(A)值,记为A_样品；另以蒸馏水代替药物，其余步骤同上，作为损伤组，测得的A值记为A_损伤。另以蒸馏水代替药物和H₂O₂，其余步骤同上,作为空白对照组，测得的A值记为A_空白。

·OH自由基清除率(%)=[(A_样品-A_损伤)/(A_空白-A_损伤)]×100%

其中明日叶的叶提取物、明日叶的茎提取物、芦丁配置的浓度及对应浓度的清除率分别如下述表3所示。

表3：

明日叶叶子浓度(10^-4g/ml)	清除率%
		4	35.35
2	14.04
		1	6.34
0.4	2.42
		0.2	2.11
明日叶茎浓度(10^-3g/ml)	清除率%
		9	28.3
7	22.76
		5	18
3	16.9
		1	5.8
芦丁浓度	清除率
		0.000067	95.03
0.0000335	39.16
		0.00001675	12.2
0.000067	4.37
		0.0000335	0.602

2)计算清除率。将清除率(Y)对药物浓度的对数(X)作图,求其线性方程。根据该线性方程求出清除率为50%时药物的浓度，其中，图4为明日叶的叶提取物的羟基自由基清除率与药物浓度的对数的曲线图(损伤=0.155，空白=0.817)，图5为明日叶的茎提取物的羟基自由基清除率与药物浓度的对数的曲线图(损伤=0.168，空白=0.818)，图6为芦丁的羟基自由基清除率与药物浓度的对数的曲线图(损伤=0.148，空白=0.812)。结果如下述表4所示：

表4：芦丁、明日叶的叶提取物、明日叶的茎提取物清除羟自由基的IC₅₀(g/ml)

样品	芦丁	明日叶的叶提取物	明日叶茎提取物
				IC₅₀(g/ml)	3.98×10^-6	5.80×10^-4	1.74×10^-2

由表4中数据可知，明日叶的叶提取物清除羟自由基活性稍差于芦丁，明日叶的茎提取物清除羟自由基活性则比明日叶的叶提取物稍差，它们活性的顺序是：芦丁＞明日叶的叶提取物＞明日叶的茎提取物。

与现有技术相比，本发明所述方法简单易操作，所得的香豆素类提取物具有较好的抗氧化活性，特别是明日叶叶子的香豆素类提取物对DPPH自由基的抗氧化活性明显优于芦丁的抗氧化活性。可见，其在制备天然、无毒的抗氧化药物或保健品中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为明日叶的叶提取物的DPPH自由基清除率对明日叶的叶提取物的浓度曲线(空白=0.926)；

图2为明日叶的茎提取物的DPPH自由基清除率对明日叶的叶提取物的浓度曲线(空白=1.015)；

图3为芦丁的DPPH自由基清除率对明日叶的叶提取物的浓度曲线(空白=1.879)；

图4为明日叶的叶提取物的羟基自由基清除率与药物浓度的对数的曲线图(损伤=0.155，空白=0.817)；

图5为明日叶的茎提取物的羟基自由基清除率与药物浓度的对数的曲线图(损伤=0.168，空白=0.818)；

图6为芦丁的羟基自由基清除率与药物浓度的对数的曲线图(损伤=0.148，空白=0.812)。

具体实施方式

以下实施例中，甲醇的浓度均为体积浓度。

实施例1

1)称取新鲜明日叶的叶子100g，捣碎，用280ml、52%甲醇浸泡4h，然后置于超声容器中提取(超声频率为95Hz，温度为45℃，时间为40min)，真空抽滤，收集滤液；滤渣再用280ml、52%甲醇超声提取(超声频率为95Hz，温度为45℃，时间为40min)，真空抽滤，收集滤液；滤渣再用280ml、52%甲醇超声提取(超声频率为95Hz，温度为45℃，时间为40min)，真空抽滤，合并滤液，浓缩至浸膏，得浸膏14.50g；

2)称取浸膏5.3g，加入22ml无水甲醇，在45～50℃水浴中超声条件下回流溶解(超声波频率为85～90Hz)，得到墨绿色的溶液，将溶液冷却后抽滤，向滤液中加入15ml乙酸乙酯，有大量沉淀产生，减压抽滤，收集滤液，浓缩得到3.0g浸膏(体积为5ml)，该浸膏即为明日叶叶子的香豆素类成分提取物。

按前述方法对所得的明日叶叶子的香豆素类提取物中香豆素类成分总含量进行测定，其中香豆素类成分总含量为50%。

实施例2

1)称取新鲜明日叶的叶子100g，捣碎，用275ml、55%甲醇浸泡3h，然后置于超声容器中提取(超声频率为90Hz，温度为45～50℃，时间为40min)，真空抽滤，收集滤液；滤渣再用200ml、52%甲醇超声提取(超声频率为90Hz，温度为45～50℃，时间为40min)，真空抽滤，收集滤液；滤渣再用200ml、52%甲醇超声提取(超声频率为90Hz，温度为45～50℃，时间为40min)，真空抽滤，合并滤液，浓缩至浸膏，得浸膏15.00g；

2)将所得的15.00g浸膏，加入70ml无水甲醇，在50～55℃水浴中超声条件下回流溶解(超声波频率为85～90Hz)，得到墨绿色的溶液，向其中加入75ml乙酸乙酯，有大量沉淀产生，减压抽滤，收集滤液，蒸馏浓缩得到8.5g浸膏(体积22ml)，该浸膏即为明日叶叶子的香豆素类提取物。

经测定，上述所得的明日叶叶子的香豆素类提取物中香豆素类成分总含量为55%(重量)。

实施例3

1)称取新鲜明日叶的叶子50g，捣碎，用130ml、60%甲醇浸泡4h，然后置于超声容器中提取(超声频率为120Hz，温度为40℃，时间为30min)，真空抽滤，收集滤液；滤渣再用150ml、60%甲醇超声提取(超声频率为90Hz，温度为45℃，时间为120min)，真空抽滤，收集滤液；滤渣再用130ml、55%甲醇超声提取(超声频率为80Hz，温度为45℃，时间为40min)，真空抽滤，合并滤液，浓缩至浸膏，得浸膏7.50g；

2)将所得的7.50g浸膏，加入32ml无水甲醇，在50～55℃水浴中超声条件下回流溶解(超声波频率为100Hz)，得到墨绿色的溶液，将溶液冷却后抽滤，向滤液中加入30ml乙酸乙酯，有大量沉淀产生，减压抽滤，收集滤液，蒸馏浓缩得到4.5g浸膏(体积12ml)，该浸膏即为明日叶叶子的香豆素类成分提取物。

经测定，上述所得的明日叶叶子的香豆素类成分提取物中香豆素类成分总含量为51%(重量)。

实施例4

1)称取新鲜明日叶的茎50g，捣碎，用130ml、50%甲醇浸泡5h，然后置于超声容器中提取(超声频率为200Hz，温度为45℃，时间为60min)，真空抽滤，收集滤液；滤渣再用100ml、50%甲醇超声提取(超声频率为200Hz，温度为45℃，时间为90min)，真空抽滤，收集滤液；合并滤液，浓缩至浸膏，得浸膏5.5g；

2)将所得的5.5g浸膏，加入28ml无水甲醇，在60℃水浴中超声条件下回流溶解(超声波频率为180Hz)，得到墨绿色的溶液，将溶液冷却后抽滤，向滤液中加入25ml乙酸乙酯，有大量沉淀产生，减压抽滤，收集滤液，蒸馏浓缩得到2.2g浸膏(体积6ml)，该浸膏即为明日叶茎的香豆素类提取物。

经测定，上述所得的明日叶茎的香豆素类提取物中香豆素类成分总含量为30%(重量)。

实施例5

1)称取新鲜明日叶的茎100g，捣碎，用250ml、50%甲醇浸泡6h，然后置于超声容器中提取(超声频率为200Hz，温度为45℃，时间为60min)，真空抽滤，收集滤液；滤渣再用200ml、50%甲醇超声提取(超声频率为200Hz，温度为45℃，时间为90min)，真空抽滤，收集滤液；合并滤液，浓缩，得到90ml浓缩液；

2)向所得的90ml浓缩液中加入150ml乙酸乙酯，有大量沉淀产生，减压抽滤，收集滤液，蒸馏浓缩得到4.5g浸膏(体积12ml)，该浸膏即为明日叶茎的香豆素类提取物。

经测定，上述所得的明日叶茎的香豆素类提取物中香豆素类成分总含量为35%(重量)。

Claims

1.从明日叶中提取的香豆素类提取物在制备具有抗氧化作用的药物或保健品中的应用，其中，从明日叶中提取香豆素类提取物的方法为：取新鲜或干燥明日叶的叶子或茎，用50～65％体积的甲醇浸泡3～5h，再进行超声提取，过滤，滤渣再加入50～65％体积的甲醇超声提取1～2次，合并滤液，得到提取液，所得提取液浓缩或不浓缩，加入乙酸乙酯进行沉淀，抽滤，滤液浓缩，得到明日叶叶子的香豆素类提取物或明日叶茎的香豆素类提取物。

2.根据权利要求1所述的从明日叶中提取的香豆素类提取物在制备具有抗氧化作用的药物或保健品中的应用，其特征在于：超声提取的条件为：温度为40～50℃，频率为60～200Hz，每次超声提取0.5～2h。

3.根据权利要求2所述的从明日叶中提取的香豆素类提取物在制备具有抗氧化作用的药物或保健品中的应用，其特征在于：超声频率为80～100Hz。

4.根据权利要求1、2或3所述的从明日叶中提取的香豆素类提取物在制备具有抗氧化作用的药物或保健品中的应用，其特征在于：每次超声提取时，甲醇的加入量为原料重量的2～3倍。

5.根据权利要求1、2或3所述的从明日叶中提取的香豆素类提取物在制备具有抗氧化作用的药物或保健品中的应用，其特征在于：浸泡时，甲醇的用量为原料重量的2～3倍。

6.根据权利要求1所述的从明日叶中提取的香豆素类提取物在制备具有抗氧化作用的药物或保健品中的应用，其特征在于：取香豆素类提取物，加入或不加药用辅料，按照常规方法制备成药物制剂。

7.根据权利要求1所述的从明日叶中提取的香豆素类提取物在制备具有抗氧化作用的药物或保健品中的应用，其特征在于：取香豆素类提取物，加入或不加辅料，按照常规方法制备成保健品。