JP7253765B2 - 特定の波長域を有する光を照射して栽培したアシタバの抽出物を含有する皮膚外用剤や内用剤 - Google Patents
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Description
本発明は、抗酸化効果、フィラグリン産生促進効果等に優れた新規な皮膚外用剤又は内用剤に関する。
皮膚は生体の最外層に位置し、紫外線等の影響により活性酸素が発生しやすい臓器であり、絶えずその酸素ストレスに曝されている。一方、皮膚細胞内には活性酸素消去酵素が存在しており、その能力を超える活性酸素が発生しないかぎり活性酸素の傷害から皮膚細胞を防衛している。ところが、皮膚細胞内の活性酸素消去酵素の活性は加齢とともに低下することが知られており、活性酸素による傷害がその防御反応を凌駕したとき、皮膚は酸化され、細胞機能が劣化して老化してゆくと考えられる。また、皮膚以外の臓器においても、その活性酸素消去能を越える活性酸素に曝されたとき、機能低下が起こり老化したり、ガンや心筋梗塞等様々な生活習慣病が発症したりすると考えられる。そこで、活性酸素による傷害からの防御を目的として活性酸素消去剤や抗酸化剤が検討され、ＳＯＤやカタラーゼ等の活性酸素消去酵素、ＳＯＤ様活性物質等の活性酸素消去剤や抗酸化剤を含有した食品、化粧品、医薬部外品及び医薬品等が開発されている（特許文献１，２参照）。
角質層の保湿性に重要な役割を果たしているのがＮＭＦであることは古くから知られており、これまでＮＭＦ成分は保湿剤の開発に応用されてきた。角質層におけるＮＭＦの減少は、その保湿性を低下させ乾燥を招く。その結果として乾燥性のカユミが引き起こされる。近年、ＮＭＦの主体をなすアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒の主成分であるフィラグリンというタンパク質の分解により産生されることが明らかとなった（非特許文献１）。すなわち、表皮顆粒層において合成されたプロフィラグリンはケラトヒアリン顆粒に蓄積された後、顆粒層上層から角質層に至る過程で脱リン酸化、加水分解を経てフィラグリンに分解される。さらにフィラグリンは角質層上層に至る過程でアミノ酸に分解されＮＭＦの主体となる。一方、乾燥肌を呈する病態とフィラグリンに関する研究が進められ、老人性乾皮症やアトピー性皮膚炎等の角質層中ではアミノ酸が減少していることが知られているが、それらの皮膚ではフィラグリンの発現が低下していることが明らかにされている（非特許文献２）。したがって、角質層の保湿性維持の目的でＮＭＦの産生を高めるためにはケラチノサイトにおけるフィラグリンあるいはプロフィラグリンの生成促進が重要であると考えられるようになり、特許文献３、４等の植物成分を用いたフィラグリンあるいはプロフィラグリンの生成促進剤が報告されている。
アシタバの公知文献としては、根抽出物のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）遺伝子発現促進作用（特許文献５）が知られているが、フィラグリン産生促進作用については知られていない。
一方で、植物の栽培方法によって植物の薬効を高める方法として、植物体内のビタミンやポリフェノール、ルチン等の機能性物質を特徴的に増加させる方法は、すでに特許文献で報告されている。特許文献６には、大豆もやしに近紫外～青色領域波長の光を照射することにより、含有ビタミンＡ、ビタミンＥを増量させる方法が開示されており、特許文献７には、小松菜に対して、人工紫外線照射を１日５分間行うことで、機能性物質であるα－トコフェロールやビタミンＣを増加させる栽培方法が開示され、特許文献８には、人工光源の青色光、赤色光及び遠赤色光の強度を調整することにより、小松菜、レタスのビタミンＣやビタミンＡを増加させる方法が開示されている。
Ｓｃｏｔｔ Ｉ．Ｒ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， Ｖｏｌ．７１９， ｐｐ１１０－１１７， １９８２
Ｓｅｇｕｃｈｉ Ｔ．， Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ， Ｖｏｌ．２８８， ｐｐ４４２－４４６， １９９６
本発明は、抗酸化効果、フィラグリン産生促進効果等に優れた新規な皮膚外用剤又は内用剤を提供することを課題とする。
本発明者らは、この問題点を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、アシタバの抽出物は、フィラグリン産生促進効果が優れており、さらに特定の波長域を有する２種の光をどちらか一種、又は同時に照射して栽培したアシタバの抽出物は、抗酸化効果、フィラグリン産生促進効果が優れていることを発見し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）～（８）からなる。
（１）波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が４:１～１：１の光を照射して栽培したアシタバ、又は、そのアシタバの水、低級アルコール及び液状多価アルコールから選ばれる一種又は二種以上の溶媒による抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
（２）波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が、２:１～１:１であることを特徴とする請求項１記載の皮膚外用剤。
（３）波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が４:１～１：１の光を照射して栽培することによって、蛍光灯又は太陽光で栽培したアシタバと比較して、抗酸化効果及び／又はフィラグリン産生促進効果を高めることを特徴とするアシタバ。
（４）波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が４:１～１：１の光を照射して栽培することによって、蛍光灯又は太陽光で栽培したアシタバと比較して、抗酸化効果及び／又はフィラグリン産生促進効果を高めたアシタバ、又は、そのアシタバの水、低級アルコール及び液状多価アルコールから選ばれる一種又は二種以上の溶媒によって抽出される抽出物を含有することを特徴とする医薬品。
（５）波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が４:１～１：１の光を照射して栽培することによって、蛍光灯又は太陽光で栽培したアシタバと比較して、抗酸化効果及び／又はフィラグリン産生促進効果を高めたアシタバ、又は、そのアシタバの水、低級アルコール及び液状多価アルコールから選ばれる一種又は二種以上の溶媒によって抽出される抽出物を含有することを特徴とする食品。
（６）波長域５７０～７３０ｎｍ及び／又は４００～５１５ｎｍの光を照射して栽培したアシタバの水、低級アルコール及び液状多価アルコールから選ばれる一種又は二種以上の溶媒によって抽出される抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
（７）波長域５７０～７３０ｎｍ及び／又は４００～５１５ｎｍの光を照射して栽培したアシタバ、又は、そのアシタバの水、低級アルコール及び液状多価アルコールから選ばれる一種又は二種以上の溶媒によって抽出される抽出物。
（８）アシタバの抽出物を含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤。
（２）波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が、２:１～１:１であることを特徴とする請求項１記載の皮膚外用剤。
（３）波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が４:１～１：１の光を照射して栽培することによって、蛍光灯又は太陽光で栽培したアシタバと比較して、抗酸化効果及び／又はフィラグリン産生促進効果を高めることを特徴とするアシタバ。
（４）波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が４:１～１：１の光を照射して栽培することによって、蛍光灯又は太陽光で栽培したアシタバと比較して、抗酸化効果及び／又はフィラグリン産生促進効果を高めたアシタバ、又は、そのアシタバの水、低級アルコール及び液状多価アルコールから選ばれる一種又は二種以上の溶媒によって抽出される抽出物を含有することを特徴とする医薬品。
（５）波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が４:１～１：１の光を照射して栽培することによって、蛍光灯又は太陽光で栽培したアシタバと比較して、抗酸化効果及び／又はフィラグリン産生促進効果を高めたアシタバ、又は、そのアシタバの水、低級アルコール及び液状多価アルコールから選ばれる一種又は二種以上の溶媒によって抽出される抽出物を含有することを特徴とする食品。
（６）波長域５７０～７３０ｎｍ及び／又は４００～５１５ｎｍの光を照射して栽培したアシタバの水、低級アルコール及び液状多価アルコールから選ばれる一種又は二種以上の溶媒によって抽出される抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
（７）波長域５７０～７３０ｎｍ及び／又は４００～５１５ｎｍの光を照射して栽培したアシタバ、又は、そのアシタバの水、低級アルコール及び液状多価アルコールから選ばれる一種又は二種以上の溶媒によって抽出される抽出物。
（８）アシタバの抽出物を含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤。
本発明のアシタバ又はその抽出物は、優れた抗酸化効果、フィラグリン産生促進効果を有しており、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品の分野において貢献できるものである。
以下に、本発明について詳細に述べる。
本発明に用いるアシタバの抽出物とは、セリ科シシウド属のアシタバ（学名：Ａｎｇｅｌｉｃａ ｋｅｉｓｋｅｉ）の花、実、種子、茎、葉、根等の植物体の一部又は全草から抽出したものである。その抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出したものであっても良いし、常温抽出や低温抽出したものであっても良い。また、本発明においては、抽出物の代わりに、植物体のまま使用することもでき、生のままでも、乾燥して用いることもでき、目的によって使い分けることができる。さらには、抽出物と植物体を併用することもできる。
栽培方法としては、土を用いた栽培や水耕栽培で行うことができる。水耕栽培で行う場合には、種子を播種後、出根した状態で、水耕栽培に供することができ、市販苗を用いることもできる。栽培は、温度、光、二酸化炭素濃度が制御された施設で栽培することが好ましい。栽培温度は、１５～３０℃、好ましくは２０～２５℃である。栽培期間は、照射する条件によって異なるが、概ね１０～３０日で収穫できる。これ以下や、これ以上の期間栽培することも可能である。
光源は、植物の栽培施設で用いる光源等を使用することができ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザーダイオード等の光半導体素子が挙げられるが、特定の範囲の波長域が選択的に照射できる光源であればＬＥＤに限らない。
アシタバの栽培において、照射する波長としては、波長域４００～５１５ｎｍの青色光、５７０～７３０ｎｍの赤色光であることが好ましく、波長域４３０～４６０ｎｍ、６３０～６８０ｎｍの光がさらに好ましい。これらの光は、同時に照射することが最も好ましい。このときの波長は、照射スペクトルの極大波長（ピーク波長）のことをいう。このような波長のピークを有する光源であれば、独自に作成したものや市販のものを使用することもできる。また、上記波長を選択的に照射できるように、光学フィルタを用いても良い。上記の２種の範囲の光に加え、太陽光や蛍光灯等の光源を使用することもできる。
照射する光量としては、光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）として表される。発光体を２種組み合わせて照射する場合には、その合計の光量を意味する。その光量は、発芽後は１０～３００μｍｏｌ・ｍ－２ｓ－１が好ましく、５０～２００μｍｏｌ・ｍ－２ｓ－１がさらに好ましい。この範囲外の光強度の場合は、生育障害、生育不良になる場合がある。照射は、アシタバの上部１０～５０ｃｍの位置から照射することが好ましい。照射時間は、植物の特性や目的に応じて適宜変更できるが、６時間以上が好ましく、１２～２４時間がより好ましい。
赤色と青色の光量比においては、それぞれのＰＰＦＤの比を意味しており、収量や有効性等目的に応じて選択が可能である。
中でも、植物体の収量を高めるには、赤色と青色の光量比が４：１～１：１が優れていた。
活性酸素消去作用（フリーラジカル捕捉除去作用）においては、赤色と青色の光量比が１：０～０：１のいずれの組み合わせでも好ましく、３：１～０：１がより好ましい。その中でも特に、赤色と青色の光量比が２：１～１：１が最も好ましい。
フィラグリン産生促進作用においては、赤色と青色の光量比が４：１～０：１が効果の面で好ましく、２：１～１：１がより好ましい。その中でも特に、赤色と青色の光量比が２：１が最も好ましい。
以上のことを総じていえば、赤色と青色の光量比が４：１～１：１が好ましく、２：１～１：１がより好ましい。
以上のことを総じていえば、赤色と青色の光量比が４：１～１：１が好ましく、２：１～１：１がより好ましい。
抽出溶媒としては、例えば、水、低級アルコール（メタノール、エタノール、１‐プロパノール、２‐プロパノール、１‐ブタノール、２‐ブタノール）、液状多価アルコール（１，３‐ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコール等の極性溶媒が良く、特に好ましくは、水、エタノール、１，３‐ブチレングリコール及びプロピレングリコールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。
上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈及び濾過処理、活性炭等による脱色、脱臭処理等をして用いても良い。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。また、サラダ等、生で食することもできる。
本発明の外用剤又は内用剤には、食品も含むものとし、これには、上記植物体及び／又は抽出物をそのまま使用しても良く、これらの効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分を含有することもできる。
本発明は、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品に用いることができ、その剤型としては、例えば、化粧水、クリーム、マッサージクリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、坐剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤等を含む）、錠菓、飲料、ティーバッグ、スパイス等が挙げられる。
本発明に用いる上記抽出物の含有量は、外用の場合、全量に対し、固形物に換算して０．０００１重量％以上が好ましく、０．００１～１０重量％がより好ましい。さらに、０．０１～５重量％が最も好ましい。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を越えて含有した場合、効果の増強は認められにくく不経済である。一方、内用の場合、投与量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人１人当たりの１日の量としては、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ～５ｇがより好ましい。さらに、１００ｍｇ～１ｇが最も好ましい。
次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いるアシタバの栽培例、アシタバ抽出物の製造例、実験例及び処方例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す％とは重量％を示す。また、処方例に示す混合抽出物とは、各抽出物を等量混合したものである。
（１）実験材料及び生育条件
水分を含んだメッシュにアシタバの種子を播種し、温度２２～２４℃・暗所で発芽させ、これをスポンジに包み、２２～２４℃で、２４時間白色蛍光灯下で栽培し、育苗した。その後、水耕栽培装置を用いて、室温２１～２３℃で２４時間、植物の真上３０ｃｍの位置から、青色ＬＥＤ（ピーク波長４５０ｎｍ）及び赤色ＬＥＤ（ピーク波長６６０ｎｍ）をどちらか一種、又は同時に照射し、赤色と青色ＬＥＤの合計光合成光量子束密度１００μｍｏｌ・ｍ－２ｓ－１となるように、赤色と青色の光量比を１：０～０：１にして、栽培を行った。また、比較栽培例１として光合成光量子束密度１００μｍｏｌ・ｍ－２ｓ－１となるように白色蛍光灯下で栽培を行い、比較栽培例２として太陽光下で栽培を行った。なお、栽培中は光量比を変えなかった。４週間栽培した後、収穫し、生アシタバを得た。これを約６０℃で温風乾燥させることで、アシタバの乾燥物を得た（表１）。
水分を含んだメッシュにアシタバの種子を播種し、温度２２～２４℃・暗所で発芽させ、これをスポンジに包み、２２～２４℃で、２４時間白色蛍光灯下で栽培し、育苗した。その後、水耕栽培装置を用いて、室温２１～２３℃で２４時間、植物の真上３０ｃｍの位置から、青色ＬＥＤ（ピーク波長４５０ｎｍ）及び赤色ＬＥＤ（ピーク波長６６０ｎｍ）をどちらか一種、又は同時に照射し、赤色と青色ＬＥＤの合計光合成光量子束密度１００μｍｏｌ・ｍ－２ｓ－１となるように、赤色と青色の光量比を１：０～０：１にして、栽培を行った。また、比較栽培例１として光合成光量子束密度１００μｍｏｌ・ｍ－２ｓ－１となるように白色蛍光灯下で栽培を行い、比較栽培例２として太陽光下で栽培を行った。なお、栽培中は光量比を変えなかった。４週間栽培した後、収穫し、生アシタバを得た。これを約６０℃で温風乾燥させることで、アシタバの乾燥物を得た（表１）。
（２）抽出
製造例１Ａ 熱水抽出物
栽培例１の乾燥物１０ｇに精製水２００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して熱水抽出物を得た（表２）。
製造例１Ａ 熱水抽出物
栽培例１の乾燥物１０ｇに精製水２００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して熱水抽出物を得た（表２）。
製造例１Ｂ ５０％エタノール抽出物
栽培例１の乾燥物５ｇに５０％エタノール１００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、５０％エタノール抽出物を得た（表２）。
栽培例１の乾燥物５ｇに５０％エタノール１００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、５０％エタノール抽出物を得た（表２）。
製造例１Ｃ エタノール抽出物
栽培例１の乾燥物５ｇにエタノール１００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、エタノール抽出物を得た（表２）。
栽培例１の乾燥物５ｇにエタノール１００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、エタノール抽出物を得た（表２）。
栽培例２～６、比較栽培例１及び２のアシタバを用いて、上記の製造例１Ａ～１Ｃと同様に抽出し、製造例２Ａ～６Ｃ、比較製造例１Ａ～２Ｃとした（表２）。
実験例１ 活性酸素消去作用
各種光照射条件で栽培したアシタバの各試料について、フリーラジカルの一種であるα，α－ジフェニル－β－ピクリルヒドラジル（以下ＤＰＰＨとする）を用い、ＤＰＰＨラジカルの消去作用を測定した。
各試料を、最終濃度４０μｇ／ｍＬとなるように加えた０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）０．４ｍＬに無水エタノール０．４ｍＬ及び０．５ｍＭ ＤＰＰＨ無水エタノール溶液０．２ｍＬを加えて反応液とした。また、油溶性の試料の場合は無水エタノール０．４ｍＬに試料を加えて反応液とした。その後、３７℃で３０分間反応させ、水を対照として波長５１７ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。また、ブランクとして試料の代わりに精製水を用いて吸光度（Ｂ）を測定した。ＤＰＰＨラジカル消去率は、以下に示す式より算出した。
ＤＰＰＨラジカル消去率（％）＝（１－Ａ／Ｂ）×１００
各種光照射条件で栽培したアシタバの各試料について、フリーラジカルの一種であるα，α－ジフェニル－β－ピクリルヒドラジル（以下ＤＰＰＨとする）を用い、ＤＰＰＨラジカルの消去作用を測定した。
各試料を、最終濃度４０μｇ／ｍＬとなるように加えた０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）０．４ｍＬに無水エタノール０．４ｍＬ及び０．５ｍＭ ＤＰＰＨ無水エタノール溶液０．２ｍＬを加えて反応液とした。また、油溶性の試料の場合は無水エタノール０．４ｍＬに試料を加えて反応液とした。その後、３７℃で３０分間反応させ、水を対照として波長５１７ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。また、ブランクとして試料の代わりに精製水を用いて吸光度（Ｂ）を測定した。ＤＰＰＨラジカル消去率は、以下に示す式より算出した。
ＤＰＰＨラジカル消去率（％）＝（１－Ａ／Ｂ）×１００
これらの試験結果を表３に示した。本発明の抽出物は、いずれの赤色と青色の光量比においても安定で優れたＤＰＰＨラジカル消去作用を有していることが認められた。特に、赤色と青色の光量比が２：１～１：１に高い効果が認められた。
実験例２ フィラグリン産生促進試験
ＮＭＦ（天然保湿因子）の前駆物質であるフィラグリン産生への影響をフィラグリン遺伝子（ＦＬＧ）のｍＲＮＡ発現量を指標として評価した。すなわち、ケラチノサイト由来ＨａＣａＴ細胞を１２ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり２×１０４個播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。次に、各試料（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ培養液にて、２４時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ）及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ライフテクノロジー）を用いた。すなわち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：３０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ＦＬＧ ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＦＬＧ発現量は、コントロールのＦＬＧ ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のＦＬＧ ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。なお、ＦＬＧ用のプライマーは、以下に示したものを使用した。
ＮＭＦ（天然保湿因子）の前駆物質であるフィラグリン産生への影響をフィラグリン遺伝子（ＦＬＧ）のｍＲＮＡ発現量を指標として評価した。すなわち、ケラチノサイト由来ＨａＣａＴ細胞を１２ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり２×１０４個播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。次に、各試料（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ培養液にて、２４時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ）及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ライフテクノロジー）を用いた。すなわち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：３０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ＦＬＧ ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＦＬＧ発現量は、コントロールのＦＬＧ ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のＦＬＧ ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。なお、ＦＬＧ用のプライマーは、以下に示したものを使用した。
ＦＬＧ用のプライマーセット
ＧＧＣＡＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＧＧ（配列番号１）
ＡＡＡＣＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＡＡＴＣＡ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号３）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号４）
ＧＧＣＡＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＧＧ（配列番号１）
ＡＡＡＣＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＡＡＴＣＡ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号３）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号４）
これらの試験結果を表４に示した。その結果、本発明の抽出物にはフィラグリン産生促進効果が認められた。
処方例１ 化粧水
処方 含有量（％）
１．製造例４Ｂの抽出物 １．０
２．１，３‐ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６及び１１と、成分７～１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
処方 含有量（％）
１．製造例４Ｂの抽出物 １．０
２．１，３‐ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６及び１１と、成分７～１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
処方例２ クリーム
処方 含有量（％）
１．製造例１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂの混合抽出物 ０．５
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２５
１２．１，３‐ブチレングリコール ８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。
処方 含有量（％）
１．製造例１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂの混合抽出物 ０．５
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２５
１２．１，３‐ブチレングリコール ８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。
処方例２において、製造例１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂの混合抽出物を製造例１Ａの抽出物、製造例６Ａの抽出物及び製造例４Ｂの抽出物に置き換えたものを処方例３、４及び５とした。
処方例６ 乳液
処方 含有量（％）
１．製造例１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａの混合抽出物 １．０
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。
処方 含有量（％）
１．製造例１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａの混合抽出物 １．０
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。
処方例７ ゲル剤
処方 含有量（％）
１．製造例１Ｃ、２Ｃ、３Ｃ、４Ｃ、５Ｃ、６Ｃの混合抽出物 ０．０１
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．香料 適量
６．１，３‐ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～５と、成分６～１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
処方 含有量（％）
１．製造例１Ｃ、２Ｃ、３Ｃ、４Ｃ、５Ｃ、６Ｃの混合抽出物 ０．０１
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．香料 適量
６．１，３‐ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～５と、成分６～１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
処方例８ パック
処方 含有量（％）
１．製造例４Ｂの抽出物 ０．１
２．製造例５Ｂの抽出物 ０．１
３．ポリビニルアルコール １２．０
４．エタノール ５．０
５．１，３‐ブチレングリコール ８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
８．クエン酸 ０．１
９．クエン酸ナトリウム ０．３
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～１１を均一に溶解し製品とする。
処方 含有量（％）
１．製造例４Ｂの抽出物 ０．１
２．製造例５Ｂの抽出物 ０．１
３．ポリビニルアルコール １２．０
４．エタノール ５．０
５．１，３‐ブチレングリコール ８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
８．クエン酸 ０．１
９．クエン酸ナトリウム ０．３
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～１１を均一に溶解し製品とする。
処方例９ ファンデーション
処方 含有量（％）
１．製造例４Ａの抽出物 １．０
２．ステアリン酸 ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．） １．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
５．セタノール １．０
６．液状ラノリン ２．０
７．流動パラフィン ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル ６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
１０．ベントナイト ０．５
１１．プロピレングリコール ４．０
１２．トリエタノールアミン １．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．二酸化チタン ８．０
１５．タルク ４．０
１６．ベンガラ １．０
１７．黄酸化鉄 ２．０
１８．香料 適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０～１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４～１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
処方 含有量（％）
１．製造例４Ａの抽出物 １．０
２．ステアリン酸 ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．） １．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
５．セタノール １．０
６．液状ラノリン ２．０
７．流動パラフィン ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル ６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
１０．ベントナイト ０．５
１１．プロピレングリコール ４．０
１２．トリエタノールアミン １．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．二酸化チタン ８．０
１５．タルク ４．０
１６．ベンガラ １．０
１７．黄酸化鉄 ２．０
１８．香料 適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０～１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４～１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
処方例１０ 浴用剤
処方 含有量（％）
１．製造例４Ａの抽出物 ５．０
２．製造例４Ｂの抽出物 １．０
３．炭酸水素ナトリウム ５０．０
４．黄色２０２号（１） 適量
５．香料 適量
６．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６を均一に混合し製品とする。
処方 含有量（％）
１．製造例４Ａの抽出物 ５．０
２．製造例４Ｂの抽出物 １．０
３．炭酸水素ナトリウム ５０．０
４．黄色２０２号（１） 適量
５．香料 適量
６．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６を均一に混合し製品とする。
処方例１１ 軟膏
処方 含有量（％）
１．製造例４Ｂ、５Ｂの混合抽出物 ０．５
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン １０．０
４．流動パラフィン ５．０
５．セタノール ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
７．プロピレングリコール １０．０
８．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び６～８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
処方 含有量（％）
１．製造例４Ｂ、５Ｂの混合抽出物 ０．５
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン １０．０
４．流動パラフィン ５．０
５．セタノール ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
７．プロピレングリコール １０．０
８．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び６～８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
処方例１２ 散剤
処方 含有量（％）
１．製造例４Ａ、５Ａの混合抽出物 ２０．０
２．乾燥コーンスターチ ３０．０
３．微結晶セルロース ５０．０
［製造方法］成分１～３を混合し、散剤とする。
処方 含有量（％）
１．製造例４Ａ、５Ａの混合抽出物 ２０．０
２．乾燥コーンスターチ ３０．０
３．微結晶セルロース ５０．０
［製造方法］成分１～３を混合し、散剤とする。
処方例１３ 錠剤
処方 含有量（％）
１．製造例４Ａの抽出物 ３．０
２．乾燥コーンスターチ ２７．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０．０
４．微結晶セルロース ４０．０
５．ポリビニルピロリドン ７．０
６．タルク ３．０
［製造方法］成分１～４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成形する。成形した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。
処方 含有量（％）
１．製造例４Ａの抽出物 ３．０
２．乾燥コーンスターチ ２７．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０．０
４．微結晶セルロース ４０．０
５．ポリビニルピロリドン ７．０
６．タルク ３．０
［製造方法］成分１～４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成形する。成形した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。
処方例１４ 錠菓
処方 含有量（％）
１．製造例２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａの混合抽出物 ０．５
２．乾燥コーンスターチ ５０．０
３．エリスリトール ４０．０
４．クエン酸 ５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル ３．０
６．香料 適量
７．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～４及び７を混合し、顆粒成形する。成形した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。
処方 含有量（％）
１．製造例２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａの混合抽出物 ０．５
２．乾燥コーンスターチ ５０．０
３．エリスリトール ４０．０
４．クエン酸 ５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル ３．０
６．香料 適量
７．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～４及び７を混合し、顆粒成形する。成形した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。
処方例１５ 飲料
処方 含有量（％）
１．製造例５Ａの抽出物 ２．０
２．果糖ブドウ糖液糖 １２．５
３．クエン酸 ０．1
４．香料 ０．０５
５．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～５を混合し、飲料とする。
処方 含有量（％）
１．製造例５Ａの抽出物 ２．０
２．果糖ブドウ糖液糖 １２．５
３．クエン酸 ０．1
４．香料 ０．０５
５．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～５を混合し、飲料とする。
処方例１６ 粉末飲料
処方 含有量（％）
１．製造例４Ａ、５Ａの混合抽出物 １０．０
２．粉糖 ６５．０
３．粉末ピーチ果汁 １５．０
４．Ｌ－アスコルビン酸 ８．０
５．結晶クエン酸 １．２
６．クエン酸ナトリウム ０．７５
７．アスパルテーム ０．０２
８．粉末ピーチ香料 ０．０３
［製造方法］成分１～８を混合し、粉末飲料とする。
処方 含有量（％）
１．製造例４Ａ、５Ａの混合抽出物 １０．０
２．粉糖 ６５．０
３．粉末ピーチ果汁 １５．０
４．Ｌ－アスコルビン酸 ８．０
５．結晶クエン酸 １．２
６．クエン酸ナトリウム ０．７５
７．アスパルテーム ０．０２
８．粉末ピーチ香料 ０．０３
［製造方法］成分１～８を混合し、粉末飲料とする。
処方例１７ ハーブティー
処方 含有量（％）
１．栽培例４、５の混合乾燥物 ５０．０
２．ペパーミント ２５．０
３．ローズヒップ ２５．０
［製造方法］成分１～３を混合し、ティーバッグに２ｇを封入してハーブティーとする。
処方 含有量（％）
１．栽培例４、５の混合乾燥物 ５０．０
２．ペパーミント ２５．０
３．ローズヒップ ２５．０
［製造方法］成分１～３を混合し、ティーバッグに２ｇを封入してハーブティーとする。
処方例１８ 浴用剤
処方 含有量（％）
１．栽培例４の乾燥粉砕物の４２メッシュ篩過品 １．０
２．栽培例５の乾燥粉砕物の４２メッシュ篩過品 １．０
３．炭酸水素ナトリウム ５０．０
４．黄色２０２号（１） 適量
５．香料 適量
６．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６を均一に混合し製品とする。
処方 含有量（％）
１．栽培例４の乾燥粉砕物の４２メッシュ篩過品 １．０
２．栽培例５の乾燥粉砕物の４２メッシュ篩過品 １．０
３．炭酸水素ナトリウム ５０．０
４．黄色２０２号（１） 適量
５．香料 適量
６．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６を均一に混合し製品とする。
以上のことから、アシタバの抽出物は、フィラグリン産生促進効果が優れており、さらに特定の波長域を有する光を照射して栽培したアシタバやその抽出物は、優れた抗酸化効果、フィラグリン産生促進効果を示し、これらを含有する皮膚外用剤又は内用剤は特に有効である。
Claims (1)
- 発芽後のアシタバに、波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍの光のみを、光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が２：１～１：１、ＰＰＦＤが合計で１０～３００μｍｏｌ・ｍ －２ ｓ －１ になるように同時に照射し、栽培温度２０～２５℃で１０～３０日間、栽培中は光量比を変えずに水耕栽培したアシタバの水、低級アルコール及び液状多価アルコールから選ばれる一種又は二種以上の溶媒による抽出物を固形物に換算して０．００１～１０重量％含有することを特徴とする抗酸化用皮膚外用剤。（ただし、前記のアシタバ抽出物は、次の抗酸化効果を有する。すなわち、アシタバ抽出物（固形物）について、最終濃度４０μｇ／ｍＬとなるように加えた０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）０．４ｍＬに無水エタノール０．４ｍＬ及び０．５ｍＭ ＤＰＰＨ無水エタノール溶液０．２ｍＬを加えて反応液とし、その後、３７℃で３０分間反応させ、水を対照として波長５１７ｎｍの吸光度（Ａ）を測定し、ブランクとして前記抽出物の代わりに精製水を用いて吸光度（Ｂ）を測定し、ＤＰＰＨラジカル消去率（％）＝（１－Ａ／Ｂ）×１００を計算することによってＤＰＰＨラジカル消去率を算出するとき、ＤＰＰＨラジカル消去率が４９％以上である。）
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| なんとびっくり！光の色で栄養素が変わる？，グリーンカフェwebページ，2017年02月，http://greencafe-shinkoiwa.com/led-light-color-362.html |
| 健康野菜サプリメント「明日葉１００％」，渡辺商事株式会社webページ（wayback machine archive），2015年，https://web.archive.org/web/20150219211628/http://www.watanabesyouji.com/ashitaba.html |
| 光合成と光の波長，還暦からの出発webページ，http://blog.livedoor.jp/pac747/archives/4419200.html |
| 明日葉の効能が凄い！伊豆大島特産の野菜を徹底紹介！，まっしろなブログ，2016年，https://tom-w.hatenablog.com/entry/2016/06/08/171650 |
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