CN114921351A - 一株具有益生功能的毕赤酵母菌dpuy-f1及在缓解结肠炎症状中的应用 - Google Patents

一株具有益生功能的毕赤酵母菌dpuy-f1及在缓解结肠炎症状中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具益生功能的毕赤酵母菌DPUY‑F1及在制备结肠炎药物中的应用，属于微生物应用技术领域。所述库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)DPUY‑F1，已于2021年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2021829。所述菌株可用于治疗结肠炎，具体可以用于包括抑制体重减轻和结肠缩短情况、缓解DSS诱导引起的结肠组织学病变、改善免疫状态、调节肠道菌群以及增强肠屏障功能。

Description

一株具有益生功能的毕赤酵母菌DPUY-F1及在缓解结肠炎症 状中的应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株具益生功能的毕赤酵母菌DPUY-F1及在缓解结肠炎症状中的应用。
背景技术
益生菌是一类活的微生物，摄取足够的数量后会对食用者的健康产生有益影响，并且能够通过调节宿主肠道微生态平衡来维持肠道的基本稳态。添加对人体有益的外来菌从而调节肠道菌群平衡成为目前发挥机体预防、调节和治疗疾病等功效的可行方法。以前所知的益生菌大都来自于乳酸菌菌株，近年来随着研究的日益深入，酵母作为益生菌的诸多特性已然显现并且被广泛开发和探索。科研人员对不同来源的酵母菌进行了抑制有害菌、免疫调节、缓解炎症功能等方面的研究，发现某些种类的酵母菌具有一定的有益功能，甚至某些方面与乳酸菌相比更具优势，例如能产生多种酶类、具有强抗氧化性、细胞壁含有独特的β-葡聚糖成分以及用于抗生素相关性腹泻治疗等益生特性，这使得其同样满足益生菌定义的主要标准和要求，故益生酵母菌近年来已成为科学家重点关注的领域。
溃疡性结肠炎是炎症性肠病的一种，它在世界范围内的发病率和流行率极高并且具有反复发作以及不可控等特点。炎症性肠病还包括另外一种叫做克罗恩的肠道疾病，它们的发作会引起多种胃肠道损伤，通常表现为反复和持续的腹痛、腹泻以及便血等症状。发病早期肠上皮完整性被破坏，各种有害细菌及其产物渗透肠屏障，导致异常免疫反应和炎症。其发病机制是目前研究的一个热点，虽然还尚不明确，但是已经有证据表明结肠炎的发作与肠道上皮屏障的破坏以及肠道菌群失调有关。已研制出氨基水杨酸类制剂、糖皮质激素以及免疫抑制剂等多种药物来治疗结肠炎，但是药物治疗已被发现具有很多局限性或者副作用，长期使用可能会引发如头痛、腹痛、贫血等身体不适症状。
已有大量证据表明作为生物制剂的益生菌对溃疡性结肠炎具有缓解作用，益生菌通常较为安全，没有明显副作用。双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌最早应用于临床应用，也是目前临床应用最多的菌种，益生菌已在替代传统药物方面显示出巨大的潜力。
发明内容
肠道菌群紊乱和肠屏障完整性损坏是结肠炎发作的重大诱因，而酵母菌的摄入能够通过调节肠道菌群平衡和维持肠屏障功能来缓解结肠炎。本发明通过探究库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1的优良体外特性以及对结肠炎模型小鼠症状的缓解作用证明了库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1在炎症性肠病中的积极作用，为更加深入探究酵母菌的益生功能奠定了基础。
本发明的目的之一是提供一株具有良好体外特性且对人体无害的优良菌株，发明中所涉及菌株经鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1，已于2021年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2021829。
进一步地，上述技术方案中，所述库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)菌株DPUY-F1不具有溶血性、具有抗生素敏感性高、不产或低产生物胺，是一株安全的菌株，在胃肠液中具有耐受性，对肠上皮细胞具有粘附性。
所述低产生物胺为产色胺量低于8.2007±0.02900μg/mL。不产生物胺包括不产腐胺、组胺、尸胺、苯乙胺、酪胺、亚精胺、精胺。
本发明的另一个目的是提供库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1在制备用于治疗或缓解结肠炎药物中的应用。
进一步地，上述技术方案中，所述结肠炎包括溃疡性结肠炎。
进一步地，上述技术方案中，所述治疗或缓解结肠炎包括减缓体重下降、降低DAI指数以及减缓结肠缩短。
进一步地，上述技术方案中，所述治疗或缓解结肠炎包括改善结肠组织学病变以及改善免疫状态。
进一步地，上述技术方案中，所述治疗或缓解结肠炎包括调节肠道菌群多样性和增强肠屏障功能。
附图说明
图1为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1的菌种鉴定结果，a为菌落形态，b为在光学显微镜下的细胞形态(10×100倍)，c为系统发育树。
图2为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1的溶血性，a为Listeria monocytogenes，b为LGG，c为DPUY-F1。
图3为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1对结肠炎小鼠体重(a)、DAI指数的影响(b)。
图4为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1对结肠炎小鼠结肠长度的影响，a为外观，b为定量。
图5为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1对结肠炎小鼠结肠组织学病变的影响，a为CT组，b为DSS组，c为DPUY-F1组。
图6为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1对结肠炎小鼠脏器指数的影响，a为胸腺指数，b为脾脏指数。
图7为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1对结肠炎小鼠肠道菌群多样性和丰富度的影响，a为Shannon指数，b为Simpson指数，c为Chao1指数，d为ACE指数。
图8为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1对结肠炎小鼠黏蛋白含量的影响，a为CT组，b为DSS组，c为DPUY-F1组。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1菌株的筛选及鉴定
本发明所涉及菌株是从新疆伊犁、塔城、巴州、喀什等不同地区传统发酵乳制品中筛选出的酵母菌，基于28S rDNA基因的分子生物学鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)DPUY-F1(图1)，所述菌株在模拟人胃肠液中具有较高的存活率，并且在人肠上皮细胞上具有较高粘附性。其筛选指标如下：
(1)胃肠液耐受实验：
2％(v/v)的酵母接种于无菌YPD液体培养基中，37℃培养24h，传代三次。将酵母发酵液离心(4℃、3500r/min、10min)取菌体沉淀，用0.1mol/L PBS(pH＝7.3)洗涤3次后再加入新的5ml PBS制成原菌液。梯度稀释后采用倾注平板法计数，作为0h的初始活菌数(CFU/mL)。从原菌液里取出500μL至含有4.5mL由胃蛋白酶制成的模拟人工胃液中，37℃水浴培养3h，然后取此人工胃液培养后的菌液500μL至含有4.5mL由牛胆盐和胰蛋白酶制成的模拟人工肠液中，37℃水浴培养8h，采用倾注平板计数法测定酵母菌在模拟胃肠液中的存活率(CFU/mL)，菌株存活率按下式计算。
菌株存活率(％)＝(Log Nt/Log N0)×100
式中：Nt：表示经过模拟胃液或肠液处理过后的活菌数(CFU/mL)；
N0：表示菌株初始活菌数(CFU/mL)。
益生菌必须要穿过胃肠道环境内大量胃酸、胆盐以及各种酶类物质所组成的天然屏障才能进入肠道内对宿主发挥作用，所以首先要探究的便是益生菌对胃肠液的耐受性。结果如表1，库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1表现出较强的胃肠液耐受性，在胃肠液中的存活率分别达到88.0％和74.6％。
(2)黏附实验：
HT-29细胞(人结肠癌细胞，ATCC HTB-38)用含有10％胎牛血清和1％双抗的RPMI-1640培养基培养，当细胞长到培养瓶的80-90％时以2.5×105个/mL接种于24孔板，置于37℃,5％CO2的培养箱中培养后用于黏附实验。准备两管传代三次后的酵母发酵液将其离心取菌体沉淀，分别用0.1mol/L PBS(pH＝7.3)洗涤3次，其中一管用PBS重悬后进行菌落计数，另一管则重悬于不含胎牛血清和双抗的RPMI-1640培养基中，调整浓度为1×107CFU/mL。培养后的24孔板弃去废液，用上述PBS洗涤三次后加入1mL制备好的菌悬液，2小时后吸出废液，用PBS洗去未黏附的菌，加入500μL 0.5％的Triton×100，吹打均匀，使细胞完全裂解，冰浴10分钟后采用倾注平板法计数。黏附率按照下式计算：
菌株黏附率＝(Log N1/Log N0)×100
其中：N1表示酵母菌粘附HT-29细胞的菌落数；
N0表示酵母菌单纯计数的菌落数；
对菌株DPUY-F1进行了黏附实验，以测定其对HT-29细胞的黏附性，因为益生菌在抵抗住各种消化液后需要与肠上皮细胞结合，才能在宿主肠道中定殖存活。黏附后的菌株在定殖后可增强其对宿主健康的影响，进一步改善局部微生物群或调节免疫应答。结果如表1所示，黏附率达到80％以上，表明它对HT-29的黏附性较强。
表1菌株DPUY-F1在模拟胃肠液中的存活率和对HT-29细胞的黏附率
Figure BDA0003630423900000051
所述库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1分离于新疆传统发酵乳制品，所述库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1的16SrDNA如附页SEQ ID NO.1所示。所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)。库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)DPUY-F1的菌种保藏号为CCTCC NO:M2021829，保藏日期为2021年7月8日，分类命名为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，菌株名称为DPUY-F1。
实施例2菌株的安全性鉴定
(1)生物胺含量测定：
将活化好的菌株DPUY-F1以2％(v/v)的接种量接种到含有7种0.1％(v/v)前体氨基酸、0.005％(v/v)磷酸吡哆醛的YPD培养基中，37℃培养48h，将培养好的菌株培养液离心(7000g，10min)，取上清液萃取并加入盐酸溶解后制成样品溶液。取处理好的样品溶液0.75ml于2mlDP管中，依次加入0.15ml饱和碳酸氢钠溶液、0.75ml丹磺酰氯衍生溶液，震荡混匀，于45℃培养箱中反应30min，中间震荡两次，取出，加入0.15ml氨水，在45℃培养箱中反应15min，将上述反应液离心(8000r/min，5min)后，过0.22微米滤膜，然后加入到上样瓶中用反向高效液相色谱仪测定含量。结果如表2，可以看出这株菌除了色胺外不产其他生物胺，且色胺也只是微量产生，远远低于文献中建议的毒性界限(100mg/kg)，对人体不产生危害，表明此菌株在产生物胺方面为安全性菌株。
表2为菌株DPUY-F1产生物胺含量
Figure BDA0003630423900000052
(2)抗生素敏感性测定：
酵母菌DPUY-F1接种于YPD液体培养基中，活化三代离心后重悬于0.1mol/L PBS，吸取1mL于无菌平板中后倒入YPD固体培养基，待凝固后将相应的抗生素纸片放在培养基表面，于37℃培养24h后测量抑菌圈直径。结果如表3，共采用了克霉唑、氟康唑、两性霉素B、伊曲康唑、咪康唑、酮康唑、益康唑等7种真菌类药敏片，发现库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)DPUY-F1几乎对所有种类的抗生素敏感性均较强。
表3为菌株DPUY-F1的抗生素敏感性
Figure BDA0003630423900000061
注：S:敏感(≥20mm)；I：中度敏感(12-19mm)；R：抗性(≤11mm)，其中所述mm为抑菌圈直径大小，ND为未检出
(3)溶血性测定：
以单核细胞增生李斯特菌Listeria.monocytogenes作为阳性对照。将阳性对照菌、鼠李糖乳杆菌LGG及酵母菌DPUY-F1划线接种在Columbia琼脂培养基(含5％羊血)表面，37℃厌氧培养48h，若菌落周围产生透明的溶血圈，表示β-溶血，对人体致病力强，若在菌落周围未观察到透明圈，说明菌株为γ-溶血性菌株，对人致病能力低，是安全性菌株。结果如图2，划线培养后酵母菌DPUY-F1菌落周围无透明溶血圈出现，为γ-溶血，是安全性菌株对人体无害。
实施例3库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1对结肠炎小鼠症状的缓解。
(1)动物分组：
实验所使用的小鼠为6-8周龄SPF级Balb/c雌鼠，所有小鼠适应性饲养一周(条件：房间内湿度为50±10％，温度为22±1℃，12h日夜交替)，可自由饮水、摄食。
30只小鼠适应性饲养一周后，随机分为3组，每组10只。包括空白对照组、DSS(葡聚糖硫酸钠)模型组和毕赤酵母DPUL-F1组。正式实验共持续14天，空白组小鼠每天自由饮用纯净水，同时灌胃0.9％无菌生理盐水；DSS模型组小鼠前7天自由饮用纯净水后7天饮用3％(m/v)的DSS溶液建立溃疡性结肠炎小鼠模型，同时每天灌胃0.9％无菌生理盐水；酵母菌实验组饮用纯净水7天，后7天饮用3％(m/v)DSS溶液，同时每天灌胃0.20mL的1×107CFU/mL酵母菌液，各组小鼠饮用水每2天更换一次。
(2)库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1对结肠炎小鼠体重、DAI活性指数和结肠长度的影响。
每天记录各组小鼠的体重、大便稠度和大便隐血情况来分析体重变化并求三项指标平均值计算疾病活性指数(DAI)，DAI指数能够从一定程度反映结肠炎小鼠的临床严重程度。结果如图3所示，灌胃酵母菌DPUY-F1后可以缓解结肠炎引起的体重下降并降低DAI指数。小鼠处死后取出其结肠组织并测量其结肠长度，DSS诱导后的结肠炎小鼠表现为结肠长度缩短，这是评估结肠炎严重程度的指标之一，服用DPUY-F1后可以明显缓解DSS引起的结肠缩短情况(图4)。
(3)库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1改善结肠炎小鼠结肠组织病变。
小鼠处死后，用无菌生理盐水溶液将结肠冲洗干净，分别剪取1cm长的结肠组织，于4％多聚甲醛中浸泡固定，然后用分级酒精溶液(75％-100％)脱水，最后石蜡包埋、切片，进行苏木精伊红染色和阿尔新蓝染色。如图5，正常Balb/c小鼠有规则的隐窝结构，粘膜层结构完整，杯状细胞分布均匀且腺体排列整齐。饮用DSS水后模型组能明显看出隐窝结构被破坏或消失，存在水肿现象，杯状细胞明显减少且有大量炎性细胞浸润现象。灌胃酵母菌DPUY-F1之后，隐窝及肠壁结构有所修复，杯状细胞增多且炎性细胞浸润减少，改善了结肠炎引起的组织学病变。
(4)库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1对结肠炎小鼠脏器指数的影响。
免疫调节失衡引起的免疫反应异常被认为是UC发病机制的重要组成部分。传统的免疫指标可以反映小鼠免疫功能的强弱和稳定性。胸腺和脾脏是重要的免疫器官，是宿主发生免疫应答的关键场所，所以器官指数能在一定程度上反映机体的非特异性免疫功能。如图6所示，DSS模型组相比空白组胸腺指数降低而脾脏指数增加，而灌胃酵母菌之后可以改善DSS引起的胸腺萎缩及脾肿大，在一定程度上调节了结肠炎小鼠的免疫功能。
(5)库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1对结肠炎小鼠肠道菌群的影响。
Shannon和Simpson指数用来反映微生物区系的多样性。Shannon指数越高，表示群落物种多样性越丰富；Simpson指数越大，表示群落物种多样性越低。从图7可以看出，与空白组相比，模型组小鼠Shannon指数降低而Simpson指数升高，表示肠道菌群多样性降低。灌胃酵母菌DPUY-F1之后，微生物多样性有所回升。Chao1和ACE指数表示菌群丰富度，是对物种总数的评估，灌胃酵母DPUY-F1能更好的缓解结肠炎引起的微生物丰富度降低，表明酵母菌能调节结肠炎小鼠肠道微生态平衡。
(6)库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1对结肠炎小鼠结肠组织黏蛋白含量的影响。
大量临床研究证实炎症细胞浸润和肠屏障损伤是导致结肠炎的关键因素，肠屏障功能受损、连接紧密和黏液蛋白数量显著减少是结肠炎患者的重要病理特征。通过观察结肠组织中黏蛋白含量变化进一步探究酵母菌对结肠炎小鼠肠屏障功能的影响。如图8所示，正常对照组小鼠隐窝结构规则，肠壁结构完整，杯状细胞中可见大量被染成蓝色的黏蛋白。而模型组小鼠隐窝结构明显被破坏或消失并且几乎看不到蓝色，表明杯状细胞及黏蛋白大量减少。灌胃酵母菌DPUY-F1之后，结肠组织结构较模型组有所恢复，杯状细胞及黏蛋白明显增多，在增强肠屏障功能方面具有积极影响。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连工业大学
<120> 一株具有益生功能的毕赤酵母菌DPUY-F1及在缓解结肠炎症状中的应用
<130> 2022
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 485
<212> DNA
<213> 库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii ）
<400> 1
ctgcggaagg atcattactg tgatttagta ctacactgcg tgagcggaac gaaaacaaca 60
acacctaaaa tgtggaatat agcatatagt cgacaagaga aatctacgaa aaacaaacaa 120
aactttcaac aacggatctc ttggttctcg catcgatgaa gagcgcagcg aaatgcgata 180
cctagtgtga attgcagcca tcgtgaatca tcgagttctt gaacgcacat tgcgcccctc 240
ggcattccgg ggggcatgcc tgtttgagcg tcgtttccat cttgcgcgtg cgcagagttg 300
ggggagcgga gcggacgacg tgtaaagagc gtcggagctg cgactcgcct gaaagggagc 360
gaagctggcc gagcgaacta gacttttttt cagggacgct tggcggccga gagcgagtgt 420
tgcgagacaa caaaaagctc gacctcaaat caggtaggaa tacccgctga acttaagcat 480
atcaa 485

Claims (7)

1.一株酵母菌，库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1，已于2021年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2021829。
2.根据权利要求1所述的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1，其特征在于，所述库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1不具有溶血性、具有抗生素敏感性高、不产或低产生物胺，是一株安全的菌株，在胃肠液中具有耐受性，对肠上皮细胞具有粘附性。
3.权利要求1或2所述的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)DPUY-F1在治疗或缓解结肠炎中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述结肠炎包括溃疡性结肠炎。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述治疗或缓解结肠炎包括减缓体重下降、降低DAI指数以及减缓结肠缩短。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述治疗或缓解结肠炎包括改善结肠组织学病变以及改善免疫状态。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述治疗或缓解结肠炎包括调节肠道菌群多样性和增强肠屏障功能。
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