KR102001525B1 - 알코올성 간손상 예방 기능성 성분을 포함하는 흑도라지 추출물 및 그 제조방법 - Google Patents

알코올성 간손상 예방 기능성 성분을 포함하는 흑도라지 추출물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알코올성 간손상 예방 기능성 성분을 포함하는 흑도라지 추출물 및 그 제조방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 흑도라지로부터 추출물을 추출함으로서, 도라지 사포닌, 플라티코딘 등의 약리 성분의 함량이 현저하게 증가된 흑도라지 추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

알코올성 간손상 예방 기능성 성분을 포함하는 흑도라지 추출물 및 그 제조방법{The Black platycodon extract including alcoholic liver injury prevention functional ingredients, method for manufacturing thereof}
본 발명은 알코올성 간손상 예방 기능성 성분을 포함하는 흑도라지 추출물 및 그 제조방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 흑도라지로부터 추출물을 추출함으로서, 도라지 사포닌, 플라티코딘 등의 약리 성분의 함량이 현저하게 증가된 흑도라지 추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
사회구조의 변화와 함께 웰빙(well-being) 문화가 정착됨에 따라 건강에 대한 관심이 증가하면서 천연물 유래의 건강기능식품과 의약품에 대한 관심 또한 증가하였다. 그 중에서도 도라지를 이용한 건강기능 식품을 개발하려는 노력이 계속적으로 증가하고 있다.
도라지는 오래전부터 식용 및 약용으로 널리 이용되어 왔으며 초롱꽃과의 여러해살이풀로서 이의 뿌리인 길경은 도랏, 길경채, 백약이라고도 한다.
산야의 자생이 가능하고 재배 생산으로도 공급되고 있어 국내 도라지 재배농가의 활성화를 위한 다양한 제품개발이 요구되고 있다(한국식품과학회, 2004).
도라지는 섬유질이 풍부하고 칼슘과 철이 많이 함유된 알칼리성 식품이며(Chung 등, 1997), 생체 형태로 많은 양이 수입되고 있으며(통계청, 2001), 생채, 전, 나물 등 식용으로 이용되고 있다(Shon 등, 2001).
주요 약리 성분으로는 triterpenoid계 사포닌(saponin)으로 도라지의 아린 맛 성분인 플라티코딘과 함께 거담작용, 진해작용, 해열, 진통 등의 약리작용이 있는 것으로 알려져 있다(한국식품과학회, 2008).
이처럼 도라지는 다양한 기능성과 그와 관련된 여러 가지 생리 활성 성분을 함유하고 있어 건강기능식품 소재로 개발 가능성이 높아지고 있다. 이에 따라 도라지의 이용이 증가하고 있으며, 도라지에 관한 연구가 활발히 진행되어 왔다.
현재까지 알려진 도라지에 관한 연구는 일반성분(Chung 등, 1997), 약리성분(Chung 등, 1997) 연구, 기관지 효능(Lee 등, 2000)과 장생도라지의 화학성분과 생리활성(Shon 등, 2001) 및 건강기능식품 개발(노성환, 2007) 연구 등이 있으며, 도라지에서 추출한 사포닌의 항비만효과(Han 등, 2002)와 HPLC를 이용하여 도라지의 사포닌 분석(Kim 등, 2007) 등이 있다. 최근에는 증숙을 이용한 도라지의 가공품인 홍도라지 추출액의 제조 및 품질 특성연구가 이루어지고 있다.
증숙은 한방에서 쪄서 익히는 것을 말하며 아홉 번 찌고 아홉 번 건조한다는 뜻의 구증구포가 있다. 증숙은 홍삼을 만들 때에 주로 사용하던 방법으로 증숙을 이용한 대표적인 가공품인 홍삼과 흑삼 등이 있으며, 그 영역이 확대 적용되어 흑마늘, 흑더덕 등이 개발 및 시판되고 있다.
도라지와 유사한 인삼 증숙의 경우 증숙과정 중에 형성된 갈색 물질이 풍미, 색상 개선 등의 효과뿐만 아니라 항산화 활성 및 기능성분으로서의 효과가 입증되었다(Lee 등, 1995).
그러나 흑도라지에 대한 품질 특성 및 생리활성 연구는 미비한 실정이며, 그 성분과 약리작용에 관하여 체계적이고 과학적인 연구는 아직 부족한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출한 것으로, 흑도라지로부터 추출물을 추출함으로서, 도라지 사포닌, 플라티코딘 등의 약리 성분의 함량이 현저하게 증가된 흑도라지 추출물 및 그 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 알코올에 의한 간세포의 손상 방지 효과가 우수한 흑도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 흑도라지 추출물의 제조방법은 (1) 도라지를 증숙 및 건조하여 1차 증숙된 흑도라지를 제조하는 단계, (2) 1차 증숙된 흑도라지를 증숙 및 건조하여 2차 증숙된 흑도라지를 제조하는 단계, (3) 2차 증숙된 흑도라지를 증숙 및 건조하여 3차 증숙된 흑도라지를 제조하는 단계 및 (4) 상기 3차 증숙된 흑도라지를 추출용매로 추출하여 흑도라지 추출물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 (1)단계의 증숙은 60 ~ 70℃에서 20 ~ 30분동안 수행한 후, 90 ~ 95℃까지 승온하여 2 ~ 5 시간동안 수행되고, 상기 (2)단계 및 (3)단계의 증숙은 90 ~ 95℃에서 2 ~ 5 시간동안 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 (1)단계 및 (2)단계의 건조는 20 ~ 40℃에서 16 ~ 30시간동안 수행되고, 상기 (3)단계의 건조는 50 ~ 60℃에서 16 ~ 30시간동안 수행한 후, 30 ~ 40℃까지 감온하여 16 ~ 80 시간동안 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 추출용매는 물 및 C1~C4알코올 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 흑도라지 추출물은 프라티코사이드 A(Platycoside A), 프라티코사이드 B(Platycoside B), 프라티코사이드 C(Platycoside C), 프라티코사이드 F(Platycoside F), 프라티코사이드 G1(Platycoside G1), 프라티코사이드 H(Platycoside H), 프라티코사이드 I(Platycoside I), 프라티코사이드 J(Platycoside J), 프라티코사이드 M-1 메틸 에스터(Platycoside M-1 methyl ester), 프라티코딘 A(Platycodin A), 프라티코딘 J(Platycodin J), 프라티코닉 애시드 A(platyconic acid A), 프라티코닉 애시드 A 락톤(platyconic acid A lactone), 프라티코닉 애시드 C(platyconic acid C), 프라티코닉 애시드 D(platyconic acid D), 데아피오플라티코딘 D(Deapioplatycodin D), 데아피오플라티코딘 D3(Deapioplatycodin D3), 데아피오플라티코닉 애시드 A 락톤(Deapioplatyconic acid A lactone), 2’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(2’-O-acetyl polygalacin D2), 3’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(3’-O-acetyl polygalacin D2), 3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈락식 애시드(3-O-b-D-glucopyranosyl polygalacic acid) 및 메틸-3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈라에이트 (Methyl-3-O-b-D-glucopyranosyl polygalaeate) 중 1종 이상의 유효성분을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 앞서 언급한 제조방법으로 제조된 흑도라지 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 3차 증숙된 흑도라지를 추출용매로 추출한 흑도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알코올성 간손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 흑도라지 추출물은 프라티코사이드 A(Platycoside A), 프라티코사이드 B(Platycoside B), 프라티코사이드 C(Platycoside C), 프라티코사이드 F(Platycoside F), 프라티코사이드 G1(Platycoside G1), 프라티코사이드 H(Platycoside H), 프라티코사이드 I(Platycoside I), 프라티코사이드 J(Platycoside J), 프라티코사이드 M-1 메틸 에스터(Platycoside M-1 methyl ester), 프라티코딘 A(Platycodin A), 프라티코딘 J(Platycodin J), 프라티코닉 애시드 A(platyconic acid A), 프라티코닉 애시드 A 락톤(platyconic acid A lactone), 프라티코닉 애시드 C(platyconic acid C), 프라티코닉 애시드 D(platyconic acid D), 데아피오플라티코딘 D(Deapioplatycodin D), 데아피오플라티코딘 D3(Deapioplatycodin D3), 데아피오플라티코닉 애시드 A 락톤(Deapioplatyconic acid A lactone), 2’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(2’-O-acetyl polygalacin D2), 3’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(3’-O-acetyl polygalacin D2), 3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈락식 애시드(3-O-b-D-glucopyranosyl polygalacic acid) 및 메틸-3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈라에이트 (Methyl-3-O-b-D-glucopyranosyl polygalaeate) 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 흑도라지 추출물은 프라티코사이드 A(Platycoside A) 3.0 ~ 3.8 mg/g, 프라티코사이드 B(Platycoside B) 2.4 ~ 3.0 mg/g, 프라티코사이드 C(Platycoside C) 1.9 ~ 2.5 mg/g, 프라티코사이드 F(Platycoside F) 10.5 ~ 13.0 mg/g, 프라티코사이드 G1(Platycoside G1) 3.4 ~ 4.2 mg/g, 프라티코사이드 H(Platycoside H) 0.26 ~ 0.32 mg/g, 프라티코사이드 I(Platycoside I) 0.24 ~ 0.3 mg/g, 프라티코딘 J(Platycodin J) 0.32 ~ 0.4 mg/g, 프라티코닉 애시드 C(platyconic acid C) 1.47 ~ 1.81 mg/g, 프라티코닉 애시드 D(platyconic acid D) 1.17 ~ 1.43 mg/g, 데아피오플라티코딘 D(Deapioplatycodin D) 1.71 ~ 2.09 mg/g, 데아피오플라티코딘 D3(Deapioplatycodin D3) 0.9 ~ 1.1 mg/g, 2’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(2’-O-acetyl polygalacin D2) 0.38 ~ 0.47 mg/g, 3’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(3’-O-acetyl polygalacin D2) 0.31 ~ 0.39 mg/g, 프라티코사이드 J(Platycoside J) 0.8 ~ 1.0 mg/g,을 프라티코사이드 M-1 메틸 에스터(Platycoside M-1 methyl ester) 0.65 ~ 0.8 mg/g, 프라티코딘 A(Platycodin A) 2.6 ~ 3.2 mg/g, 프라티코닉 애시드 A(platyconic acid A) 0.06 ~ 0.08 mg/g, 프라티코닉 애시드 A 락톤(platyconic acid A lactone) 0.07 ~ 0.09 mg/g, 데아피오플라티코닉 애시드 A 락톤(Deapioplatyconic acid A lactone) 0.07 ~ 0.09 mg/g, 3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈락식 애시드(3-O-b-D-glucopyranosyl polygalacic acid) 0.45 ~ 0.57 mg/g 및 메틸-3- O-b-D- 글루코피래노실 폴리갈라에이트 (Methyl-3-O-b-D-glucopyranosyl polygalaeate) 0.13 ~ 0.17 mg/g을 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 3차 증숙된 흑도라지를 추출용매로 추출한 흑도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알코올성 간손상 예방 또는 치료용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 흑도라지 추출물 및 그 제조방법은 도라지 사포닌, 플라티코딘 등의 약리 성분의 함량이 현저하게 증가되고, 알코올에 의한 간세포의 손상 방지 효과가 우수하다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 있어서, 본 발명에서 사용되는 흑도라지를 제조하는 방법을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2은 실시예 1 및 비교예 1의 UPLC-QTOF/MS를 정량화한 비교 데이터이다.
도 3은 실시예 1 및 비교예 2의 UPLC-QTOF/MS의 비교 데이터이다.
도 4는 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물의 투여 또는 전처리 후 에탄올 투여 후 GOT/AST의 혈중 농도를 특정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물의 투여 또는 전처리 후 에탄올 투여 후 GPT/AST의 혈중 농도를 특정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 비교예 1의 흑도라지 추출물의 투여 또는 전처리 후 에탄올 투여 후 GOT/AST의 혈중 농도를 특정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 비교예 1의 흑도라지 추출물의 투여 또는 전처리 후 에탄올 투여 후 GPT/AST의 혈중 농도를 특정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물의 투여 또는 전처리 후 에탄올 투여 후 LDH의 혈중 농도를 특정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물의 투여 또는 전처리 후 에탄올 투여 후 SOD의 혈중 농도를 특정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물의 투여 또는 전처리 후 에탄올 투여 후 간(liver) 및 비장(spleen)의 중량을 계측한 것을 막대 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 부가한다.
도 1을 참조하여 설명하면, 본 발명의 흑도라지 추출물의 제조방법은 (1) 단계 내지 (4) 단계를 포함한다.
먼저, (1) 단계에서, 도라지를 증숙 및 건조하여 1차 증숙된 흑도라지를 제조할 수 있다.
도라지는 흙, 비닐 등 이물질이 완전히 제거된 도라지가 사용될 수 있으며, 최대한 도라지에 상처가 발생하지 않은 도라지를 사용할 수 있다.(S1 : 세척) 또한, 도라지는 30 ~ 50℃에서 3 ~ 15시간 또는 상온에서 1 ~ 3일 정도 건조된 도라지가 사용될 수 있다.(S2 : 예비건조)
(1) 단계의 증숙(S3 : 1차 증숙)은 50 ~ 80℃, 바람직하게는 60 ~ 70℃에서 10 ~ 40분, 바람직하게는 20 ~ 30분 동안 수행한 후, 85 ~ 105℃, 바람직하게는 90 ~ 95℃까지 승온하여 1 ~ 6 시간, 바람직하게는 2 ~ 5 시간동안 수행될 수 있다.
즉, (1)단계의 증숙(S3)은 50 ~ 80℃, 바람직하게는 60 ~ 70℃에서 10 ~ 40분, 바람직하게는 20 ~ 30분 동안 수행하는 (1-1)단계와, 85 ~ 105℃, 바람직하게는 90 ~ 95℃까지 승온하여 1 ~ 6 시간, 바람직하게는 2 ~ 5 시간동안 수행하는 (1-2)단계를 통해 진행될 수 있다.
만일, (1-1) 단계를 거치지 않고, (1-2) 단계만으로 1차 증숙된 흑도라지를 제조하게 된다면, 최종적으로 제조되는 흑도라지 추출물에 포함되는 도라지 사포닌, 플라티코딘 등의 약리 성분이 현저히 감소되는 문제가 발생할 수 있다.
또한, (1-1)단계의 증숙은 50 ~ 80℃에서 10 ~ 40분 동안 수행되는데, 만일 (1-1)단계의 증숙이 50℃ 미만에서 수행된다면 도라지 내 조직이 물러지며 흑갈색의 색태가 나오지 않을뿐만 아니라, 도라지에 함유된 사포닌이 유효사포닌으로 전환이 되어야 하는데 전환이 되지 않는 문제가 발생할 수 있다. 또한, (1-1)단계의 증숙이 80℃를 초과하여 수행된다면 도라지 내 조직이 급격히 단단해져 내부에 타공이 발생할 수 있을 뿐만 아니라, 고온으로 인하여 조직이 쉽게 부서지며 타면서 성분들이 파괴되는 문제가 발생할 수 있다.
또한, (1-2)단계의 증숙은 85 ~ 105℃에서 1 ~ 6 시간 동안 수행되는데, 만일 (1-2)단계의 증숙이 85℃ 미만에서 수행된다면 본 발명에서 제조된 흑도라지 추출물에 포함되는 유효성분들의 함량이 현저히 줄어드는 문제가 발생할 수 있으며, 105℃를 초과하여 수행된다면 도라지의 조직이 타버려 본 발명의 흑도라지 추출물에 포함되는 유효성분이 파괴되는 문제가 발생할 수 있다.
(1) 단계의 건조(S4 : 1차 건조)는 10 ~ 50℃, 바람직하게는 20 ~ 40℃에서 16 ~ 32시간, 바람직하게는 20 ~ 28시간 동안 수행될 수 있으며, 이를 통해 증숙과정을 거친 도라지 표면의 수분이 제거될 수 있다. 만일, (1) 단계의 건조가 10℃ 미만에서 수행된다면 조직표면의 수분이 완벽하게 제거가 되지 않아 조직에 곰팡이 등이 생기는 문제가 발생할 수 있으며, 50℃를 초과하여 수행된다면 조직의 표면이 거칠어지고 갈라지는 문제가 발생할 수 있다.
다음으로, (2) 단계에서, 1차 증숙된 흑도라지를 증숙 및 건조하여 2차 증숙된 흑도라지를 제조할 수 있다.
(2) 단계의 증숙(S5 : 2차 증숙)은 85 ~ 105℃, 바람직하게는 90 ~ 95℃에서 1 ~ 15시간, 바람직하게는 2 ~ 10시간동안 수행될 수 있으며, 만일 (2)단계의 증숙이 85℃ 미만에서 수행된다면 도라지 내 조직이 물러지며 흑색의 색태가 나오지 않을 뿐만 아니라, 도라지에 함유된 사포닌이 유효사포닌으로 전환이 되어야 하는데 전환이 되지 않는 문제가 발생할 수 있다. 또한, (2)단계의 증숙이 105℃를 초과하여 수행된다면 도라지 내 조직이 급격히 단단해져 내부에 타공이 발생할 수 있을 뿐만 아니라, 고온으로 인하여 조직이 쉽게 부서지며 타면서 성분들이 파괴되는 문제가 발생할 수 있다.
(2) 단계의 건조(S6 : 2차 건조)는 10 ~ 50℃, 바람직하게는 20 ~ 40℃에서 16 ~ 32시간, 바람직하게는 20 ~ 28시간 동안 수행될 수 있으며, 이를 통해 증숙과정을 거친 1차 증숙된 흑도라지 표면의 수분이 제거될 수 있다. 만일, (2) 단계의 건조가 10℃ 미만에서 수행된다면 조직표면의 수분이 완벽하게 제거가 되지 않아 조직에 곰팡이 등이 생기는 문제가 발생할 수 있으며, 50℃를 초과하여 수행된다면 조직의 표면이 거칠어지고 갈라지는 문제가 발생할 수 있다.
다음으로, (3)단계에서, 2차 증숙된 흑도라지를 증숙 및 건조하여 3차 증숙된 흑도라지를 제조할 수 있다.
(3) 단계의 증숙(S7 : 3차 증숙)은 85 ~ 105℃, 바람직하게는 90 ~ 95℃에서 1 ~ 15시간, 바람직하게는 2 ~ 10시간동안 수행될 수 있으며, 만일 (3)단계의 증숙이 85℃ 미만에서 수행된다면 도라지 내 조직이 물러지며 흑색의 색태가 나오지 않을뿐만 아니라, 도라지에 함유된 사포닌이 유효사포닌으로 전환이 되어야 하는데 전환이 되지 않는 문제가 발생할 수 있다. 또한, (3) 단계의 증숙이 105℃를 초과하여 수행된다면 도라지 내 조직이 급격히 단단해져 내부에 타공이 발생할 수 있을 뿐만 아니라, 고온으로 인하여 조직이 쉽게 부서지며 타면서 성분들이 파괴되는 문제가 발생할 수 있다.
(3) 단계의 건조(S8 : 3차 건조)는 40 ~ 70℃, 바람직하게는 50 ~ 60℃에서 16 ~ 32시간, 바람직하게는 20 ~ 28시간 동안 수행한 후, 20 ~ 50℃, 바람직하게는 30 ~ 40℃까지 감온하여 12 ~ 84시간, 바람직하게는 16 ~ 80 시간동안 수행될 수 있다.
즉, (3)단계의 건조(S8 : 3차 건조)는 40 ~ 70℃, 바람직하게는 50 ~ 60℃에서 16 ~ 32시간, 바람직하게는 20 ~ 28시간 동안 수행하는 (3-1)단계와, 20 ~ 50℃, 바람직하게는 30 ~ 40℃까지 감온하여 12 ~ 84시간, 바람직하게는 16 ~ 80 시간동안 수행하는 (3-2)단계를 통해 진행될 수 있다.
(3-1)단계를 통해 증숙된 2차 증숙된 흑도라지의 표면의 수분을 제거할 수 있으며, 표면의 수분이 완전히 제거된 증숙된 2차 증숙된 흑도라지는 (3-2)단계를 통해 3차 증숙된 흑도라지의 전체 수분이 15%이하가 될 수 있다.
이와 같이 3차 증숙된 흑도라지는 전체 수분이 15%이하가 될 수 있는데, 만일 전체 수분이 15%를 초과하는 3차 증숙된 흑도라지를 사용하여 최종적으로 흑도라지 추출물을 제조한다면, 흑도라지 추출물의 엑기스를 제조시 흑도라지 추출물에 포함되는 유효성분들의 추출이 감소되는 문제가 발생할 뿐만 아니라, 저장기간이 짧으며, 저장기간 동안 곰팡이 등 위생상 문제가 발생할 수 있다.
또한, (3-1)단계의 건조는 40 ~ 70℃에서 16 ~ 32시간 동안 수행되는데, 만일 (3-1)단계의 건조가 40℃ 미만에서 수행된다면 흑도라지에 함유된 사포닌이 유효 사포닌으로 전환이되는 양이 늘어나야 하는데 전환되는 수율이 현저히 떨어지는 문제가 발생할 수 있고, 70℃를 초과하여 수행된다면 흑도라지의 중간산물이 형성되지 않고 비극성의 물질만 증가할 수 있는 문제가 발생할 수 있다.
또한, (3-2)단계의 건조는 20 ~ 50℃에서 12 ~ 84 시간 동안 수행되는데, 만일 (3-2)단계의 건조가 20℃ 미만에서 수행된다면 흑도라지의 표면에 주름이 다소 많이 생길 수 있는 문제가 발생할 수 있고, 흑도라지 내면의 건조가 덜 되어 수분함량이 15%를 초과하여 혹도라지 추출물을 제조시 흑도라지 추출물에 포함되는 유효성분들의 추출이 감소되는 문제가 발생할 뿐만 아니라, 저장기간이 짧으며, 저장기간 동안 곰팡이 등 위생상 문제가 발생할 수 있다. 또한, 50℃를 초과하여 수행된다면 흑도라지의 표면이 파괴됨과 동시에 잔주름이 생길 수 있으며, 이로 인해 흑도라지의 품질이 떨어질 수 있다. 이 뿐만 아니라, 급격한 온도의 변화로 벤조피렌(benzopyrene)의 등을 유행성 물질이 생성될 수 있다.
마지막으로, (4)단계에서, 3차 증숙된 흑도라지를 추출용매로 추출하여 흑도라지 추출물을 수득할 수 있다.
추출용매는 물 및 C1 ~ C4 알코올 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 물을 포함할 수 있다. 알코올 용매에 물을 혼합 용매로 사용하는 경우 30 ~ 100 중량%의 농도를 갖는 알코올 수용액을 사용하는 것이 추출효율을 극대화하는데 매우 유리하다. 달리 말하면, 30 중량% 미만의 C1 ~ C4 알코올 수용액을 사용한다면 알코올 추출물에 포함되는 사포닌, 플라티코딘 등의 약리 성분이 현저히 감소될 수 있다.
구체적으로, (4)단계는 3차 증숙된 흑도라지를 추출용매로 18 ~ 30시간, 바람직하게는 21 ~ 27시간동안 60 ~ 100℃, 바람직하게는 70 ~ 90℃에서 환류 추출을 1 ~ 5회, 바람직하게는 2 ~ 4회 반복추출하고, 얻어진 여액을 합쳐 감압 농축하여 흑도라지 추출물을 수득할 수 있다.
흑도라지 추출물에는 일반적으로 제조된 도라지 추출물보다 사포닌, 플라티코딘 등의 약리 성분이 현저히 증가되어 포함된다. 이 때, 도라지 추출물은 도라지를 물 또는 C1~C4 알코올을 추출용매로 하여 추출한 추출물이다.
구체적으로, 흑도라지 추출물은 프라티코사이드 A(Platycoside A), 프라티코사이드 B(Platycoside B), 프라티코사이드 C(Platycoside C), 프라티코사이드 F(Platycoside F), 프라티코사이드 G1(Platycoside G1), 프라티코사이드 H(Platycoside H), 프라티코사이드 I(Platycoside I), 프라티코사이드 J(Platycoside J), 프라티코사이드 M-1 메틸 에스터(Platycoside M-1 methyl ester), 프라티코딘 A(Platycodin A), 프라티코딘 J(Platycodin J), 프라티코닉 애시드 A(platyconic acid A), 프라티코닉 애시드 A 락톤(platyconic acid A lactone), 프라티코닉 애시드 C(platyconic acid C), 프라티코닉 애시드 D(platyconic acid D), 데아피오플라티코딘 D(Deapioplatycodin D), 데아피오플라티코딘 D3(Deapioplatycodin D3), 데아피오플라티코닉 애시드 A 락톤(Deapioplatyconic acid A lactone), 2’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(2’-O-acetyl polygalacin D2), 3’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(3’-O-acetyl polygalacin D2), 3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈락식 애시드(3-O-b-D-glucopyranosyl polygalacic acid) 및 메틸-3- O-b-D- 글루코피래노실 폴리갈라에이트 (Methyl-3-O-b-D-glucopyranosyl polygalaeate) 중 1종 이상의 유효성분이 포함될 수 있다.
더욱 구체적으로, 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 A(Platycoside A) 3.0 ~ 3.8 mg/g을 포함하며, 이는 프라티코사이드 A을 대략 1.3 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 2.3배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 B(Platycoside B) 2.4 ~ 3.0 mg/g을 포함하며, 이는 프라티코사이드 B를 대략 1.72 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 1.3배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 C(Platycoside C) 1.9 ~ 2.5 mg/g을 포함하며, 이는 프라티코사이드 C를 대략 1.6 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 1.1배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 F(Platycoside F) 10.5 ~ 13.0 mg/g을 포함하며, 이는 프라티코사이드 F를 대략 0.15 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 70배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 G1(Platycoside G1) 3.4 ~ 4.2 mg/g을 포함하며, 이는 프라티코사이드 G1을 대략 2.2 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 1.5배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 H(Platycoside H) 0.26 ~ 0.32 mg/g을 포함하며, 이는 프라티코사이드 H를 대략 0.16 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 1.6배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 I(Platycoside I) 0.24 ~ 0.3 mg/g을 포함하며, 이는 프라티코사이드 I를 대략 0.14 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 1.7배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 프라티코딘 J(Platycodin J) 0.32 ~ 0.4 mg/g을 포함하며, 이는 프라티코딘 J를 대략 0.08 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 4배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 프라티코닉 애시드 C(platyconic acid C) 1.47 ~ 1.81 mg/g을 포함하며, 이는 프라티코닉 애시드 C를 대략 0.07 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 21배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 프라티코닉 애시드 D(platyconic acid D) 1.17 ~ 1.43 mg/g을 포함하며, 이는 프라티코닉 애시드 D를 대략 0.2 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 5배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 데아피오플라티코딘 D(Deapioplatycodin D) 1.71 ~ 2.09 mg/g을 포함하며, 이는 데아피오플라티코딘 D를 대략 0.8 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 2배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 데아피오플라티코딘 D3(Deapioplatycodin D3) 0.9 ~ 1.1 mg/g을 포함하며, 이는 데아피오플라티코딘 D3를 대략 0.5 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 1.8배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 2’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(2’-O-acetyl polygalacin D2) 0.38 ~ 0.47 mg/g을 포함하며, 이는 2’-O-아세틸 폴리갈락신 D2를 대략 0.07 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 5배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 흑도라지 추출물에는 3’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(3’-O-acetyl polygalacin D2) 0.31 ~ 0.39 mg/g을 포함하며, 이는 3’-O-아세틸 폴리갈락신 D2를 대략 0.09 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 3배 이상 증가되어 포함될 수 있다.
또한, 도라지 추출물은 프라티코사이드 J(Platycoside J), 프라티코사이드 M-1 메틸 에스터(Platycoside M-1 methyl ester), 프라티코딘 A(Platycodin A), 프라티코닉 애시드 A(platyconic acid A), 프라티코닉 애시드 A 락톤(platyconic acid A lactone), 데아피오플라티코닉 애시드 A 락톤(Deapioplatyconic acid A lactone), 3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈락식 애시드(3-O-b-D-glucopyranosyl polygalacic acid) 및 메틸-3- O-b-D- 글루코피래노실 폴리갈라에이트 (Methyl-3-O-b-D-glucopyranosyl polygalaeate)를 극미량으로 포함하고 있지만, 본 발명의 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 J(Platycoside J) 0.8 ~ 1.0 mg/g, 프라티코사이드 M-1 메틸 에스터(Platycoside M-1 methyl ester) 0.65 ~ 0.8 mg/g, 프라티코딘 A(Platycodin A) 2.6 ~ 3.2 mg/g, 프라티코닉 애시드 A(platyconic acid A) 0.06 ~ 0.08 mg/g, 프라티코닉 애시드 A 락톤(platyconic acid A lactone) 0.07 ~ 0.09 mg/g, 데아피오플라티코닉 애시드 A 락톤(Deapioplatyconic acid A lactone) 0.07 ~ 0.09 mg/g, 3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈락식 애시드(3-O-b-D-glucopyranosyl polygalacic acid) 0.45 ~ 0.57 mg/g 및 메틸-3- O-b-D- 글루코피래노실 폴리갈라에이트 (Methyl-3-O-b-D-glucopyranosyl polygalaeate) 0.13 ~ 0.17 mg/g을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 앞서 언급한 제조방법으로 제조된 흑도라지 추출물을 포함한다.
또한, 본 발명의 제조방법으로 제조된 흑도라지 추출물에는 알코올성 간손상 예방 기능성 성분을 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 3차 증숙된 흑도라지를 추출용매로 추출한 흑도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함한다.
이 때, 알코올성 간손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함된 흑도라지 추출물은 프라티코사이드 A(Platycoside A), 프라티코사이드 B(Platycoside B), 프라티코사이드 C(Platycoside C), 프라티코사이드 F(Platycoside F), 프라티코사이드 G1(Platycoside G1), 프라티코사이드 H(Platycoside H), 프라티코사이드 I(Platycoside I), 프라티코사이드 J(Platycoside J), 프라티코사이드 M-1 메틸 에스터(Platycoside M-1 methyl ester), 프라티코딘 A(Platycodin A), 프라티코딘 J(Platycodin J), 프라티코닉 애시드 A(platyconic acid A), 프라티코닉 애시드 A 락톤(platyconic acid A lactone), 프라티코닉 애시드 C(platyconic acid C), 프라티코닉 애시드 D(platyconic acid D), 데아피오플라티코딘 D(Deapioplatycodin D), 데아피오플라티코딘 D3(Deapioplatycodin D3), 데아피오플라티코닉 애시드 A 락톤(Deapioplatyconic acid A lactone), 2’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(2’-O-acetyl polygalacin D2), 3’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(3’-O-acetyl polygalacin D2), 3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈락식 애시드(3-O-b-D-glucopyranosyl polygalacic acid) 및 메틸-3- O-b-D- 글루코피래노실 폴리갈라에이트 (Methyl-3-O-b-D-glucopyranosyl polygalaeate) 중 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 프라티코사이드 A(Platycoside A) 3.0 ~ 3.8 mg/g, 프라티코사이드 B(Platycoside B) 2.4 ~ 3.0 mg/g, 프라티코사이드 C(Platycoside C) 1.9 ~ 2.5 mg/g, 프라티코사이드 F(Platycoside F) 10.5 ~ 13.0 mg/g, 프라티코사이드 G1(Platycoside G1) 3.4 ~ 4.2 mg/g, 프라티코사이드 H(Platycoside H) 0.26 ~ 0.32 mg/g, 프라티코사이드 I(Platycoside I) 0.24 ~ 0.3 mg/g, 프라티코딘 J(Platycodin J) 0.32 ~ 0.4 mg/g, 프라티코닉 애시드 C(platyconic acid C) 1.47 ~ 1.81 mg/g, 프라티코닉 애시드 D(platyconic acid D) 1.17 ~ 1.43 mg/g, 데아피오플라티코딘 D(Deapioplatycodin D) 1.71 ~ 2.09 mg/g, 데아피오플라티코딘 D3(Deapioplatycodin D3) 0.9 ~ 1.1 mg/g, 2’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(2’-O-acetyl polygalacin D2) 0.38 ~ 0.47 mg/g, 3’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(3’-O-acetyl polygalacin D2) 0.31 ~ 0.39 mg/g, 프라티코사이드 J(Platycoside J) 0.8 ~ 1.0 mg/g, 프라티코사이드 M-1 메틸 에스터(Platycoside M-1 methyl ester) 0.65 ~ 0.8 mg/g, 프라티코딘 A(Platycodin A) 2.6 ~ 3.2 mg/g, 프라티코닉 애시드 A(platyconic acid A) 0.06 ~ 0.08 mg/g, 프라티코닉 애시드 A 락톤(platyconic acid A lactone) 0.07 ~ 0.09 mg/g, 데아피오플라티코닉 애시드 A 락톤(Deapioplatyconic acid A lactone) 0.07 ~ 0.09 mg/g, 3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈락식 애시드(3-O-b-D-glucopyranosyl polygalacic acid) 0.45 ~ 0.57 mg/g 및 메틸-3- O-b-D- 글루코피래노실 폴리갈라에이트 (Methyl-3-O-b-D-glucopyranosyl polygalaeate) 0.13 ~ 0.17 mg/g을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 알코올성 간손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 3차 증숙된 흑도라지를 추출용매로 추출한 흑도라지 추출물을 0.5 ~ 3mg, 바람직하게는 1 ~ 2.6mg, 더욱 바람직하게는 1.5 ~ 2.4mg을 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 3차 증숙된 흑도라지를 추출용매로 추출한 흑도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간손상 예방 또는 치료용 건강기능성 식품을 포함한다.
건강기능성 식품은 액상의 음료 제형으로 제공될 수 있고, 건강기능성 식품의 일례로 흑도라지의 추출물을 분무 건조와 같은 방법을 이용하여 분말화하고, 이러한 분말을 정제, 환, 산제, 타브렛, 캡슐제 중에서 선택된 어느 하나 이상의 고상 제형으로 제공될 수 있다.
이상에서 본 발명에 대하여 구현예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명의 구현예를 한정하는 것이 아니며, 본 발명의 실시예가 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 구현예에 구체적으로 나타난 각 구성 요소는 변형하여 실시할 수 있는 것이다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
실시예 1 : 흑도라지 추출물의 제조
(1) 도라지를 원통형 세척기에 넣고 흙, 비닐 등 이물질을 완전히 제거하고, 열풍건조기에서 40℃로 7시간동안 예비건조하였다.
(2) 예비건조된 도라지를 증숙기에 넣고 실온에서 65℃까지 빠르게 승온하여 25분간 유지하고, 93℃까지 승온하여 4시간동안 1차 증숙하였다.
(3) 1차 증숙된 흑도라지를 30℃에서 1일간 1차 건조하였다.
(4) 1차 건조된 흑도라지를 93℃에서 4시간동안 2차 증숙하였다.
(5) 2차 증숙된 흑도라지를 30℃에서 1일간 2차 건조하였다.
(6) 2차 건조된 흑도라지를 93℃에서 4시간동안 3차 증숙하였다.
(7) 3차 증숙된 흑도라지를 40℃에서 1일간 건조하여 표면의 수분을 제거하고, 흑도라지 전체의 수분이 10%가 되도록 양건장에서 건조하였다.
(8) 흑도라지 전체의 수분이 10%인 3차 증숙된 흑도라지를 수용액에 24시간 담가서 80℃에서 환류 추출을 3번 반복 추출하고, 얻어진 여액을 각각 합쳐 감압 농축하여 흑도라지 추출물을 제조하였다.
비교예 1 : 도라지 추출물의 제조
(1) 도라지를 원통형 세척기에 넣고 흙, 비닐 등 이물질을 완전히 제거하고, 열풍건조기에서 40℃로 7시간동안 예비건조하였다.
(2) 예비건조된 도라지를 수용액에 24시간 담가서 80℃에서 환류 추출을 3번 반복 추출하고, 얻어진 여액을 각각 합쳐 감압 농축하여 도라지 추출물을 제조하였다.
비교예 2 : 9증 9포의 흑도라지의 추출물
9증 9포의 흑도라지는 일반적으로 제조된 9증 9포의 흑도라지(더약초)를 구입하여 대조군으로 사용하였다.
실험예 1 : 성분 분석
실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 추출물을 각각 UPLC-QTOF/MS를 이용하여 성분 분석을 하였다. 도 1은 UPLC-QTOF/MS를 한 결과를 정량화한 그래프이다.
1) UPLC 분석 조건 확립
Waters ACQUITY UPLCTM system (Waters Corp., MA, USA)을 이용해 수행하였다. Thermo Hypersil Gold(2.1 X 100 mm 1.9 um) 컬럼 (column)을 사용하고 이동상으로는 0.1% 포름산 (formic acid)이 첨가된 물 (A)과 0.1% 포름산 (formic acid)이 첨가된 아세토니트릴 (acetonitrile; B)을 사용하였다. 컬럼 오븐을 40℃로 유지시켰고, 이동상을 용매 A(물 중 0.1% 포름산, v/v) 및 용매 B(아세토니트릴 중 0.1% 포름산, v/v)로 구성하였다. 최적 LC 용리 조건을 하기와 같이 적용하였다: 0-0.5 분, 15-15% B; 0.5-1 분, 15-20% B; 1-6 분, 20-20% B; 6-13 분, 20-30% B; 13-23 분, 30-35% B; 23-24 분, 35-38% B; 24-27 분, 38-60% B, 및 27-31 분, 60-90% B. 유동률은 0.5 mL/분이었다. 2 μ분액을 자동-샘플러를 사용하여 컬럼에 주입시켰다.
2) Q-TOF/MS 조건 확립
Q-TOF Micro mass detector (Waters, Manchester, UK)를 사용해 네거티브 (negative) 와 포지티브 모드(positive mode)에서 각각 흑도라지 추출물의 대사체 분석을 위한 최적의 조건을 확립하였다. 비교 결과, 음이온 전자분무 방식 (Negative mode)에서 다양한 대사체가 효과적으로 분석됐으며, 분석조건은 다음과 같다; capillary voltage 3000, cone voltage 40, collision energy 6, desolvation temperature 550℃, source temperature 120℃, cone gas flow 30 L/h, desolvation gas flow 800 L/h. 전구체 이온 정보는 100 및 2,000 m/z 사이에서 데이터를 수집하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물은 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 사포닌, 플라티코딘 등의 약리 성분이 현저히 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 A(Platycoside A)를 대략 3.4 mg/g 포함했으며, 이는 프라티코사이드 A을 대략 1.3 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 2.6배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 B(Platycoside B)를 대략 2.7 mg/g 포함했으며, 이는 프라티코사이드 B를 대략 1.72 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 1.5배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 C(Platycoside C)를 대략 2.2 mg/g 포함했으며, 이는 프라티코사이드 C를 대략 1.6 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 1.3배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 F(Platycoside F)를 대략 11.77 mg/g 포함했으며, 이는 프라티코사이드 F를 대략 0.15 mg/g을 포함하는 도라지 추출물보다 78배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 G1(Platycoside G1)을 대략 3.8 mg/g 포함했으며, 이는 프라티코사이드 G1을 대략 2.2 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 1.7배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 H(Platycoside H)를 대략 0.29 mg/g 포함했으며, 이는 프라티코사이드 H를 대략 0.16 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 1.8배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 프라티코사이드 I(Platycoside I)을 대략 0.27 mg/g 포함했으며, 이는 프라티코사이드 I를 대략 0.14 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 1.9배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 프라티코딘 J(Platycodin J)를 대략 0.36 mg/g 포함하며, 이는 프라티코딘 J를 대략 0.08 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 2.5배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 프라티코닉 애시드 C(platyconic acid C)를 1.64 mg/g 포함하며, 이는 프라티코닉 애시드 C를 대략 0.07 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 23배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 프라티코닉 애시드 D(platyconic acid D)을 대략 1.3 mg/g 포함했으며, 이는 프라티코닉 애시드 D를 대략 0.2 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 6.5배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 데아피오플라티코딘 D(Deapioplatycodin D)을 대략 1.9 mg/g 포함했으며, 이는 데아피오플라티코딘 D를 대략 0.8 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 2.3배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 데아피오플라티코딘 D3(Deapioplatycodin D3)을 대략 1.0 mg/g을 포함했으며, 이는 데아피오플라티코딘 D3를 대략 0.5 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 2배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 2’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(2’-O-acetyl polygalacin D2)을 대략 0.42 mg/g 포함했으며, 이는 2’-O-아세틸 폴리갈락신 D2를 대략 0.07 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 6배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물에는 3’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(3’-O-acetyl polygalacin D2)를 대략 0.35 mg/g 포함하며, 이는 3’-O-아세틸 폴리갈락신 D2를 대략 0.09 mg/g을 포함하는 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물보다 3.8배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 비교예 1에서 제조된 도라지 추출물은 프라티코사이드 J(Platycoside J), 프라티코사이드 M-1 메틸 에스터(Platycoside M-1 methyl ester), 프라티코딘 A(Platycodin A), 프라티코닉 애시드 A(platyconic acid A), 프라티코닉 애시드 A 락톤(platyconic acid A lactone), 데아피오플라티코닉 애시드 A 락톤(Deapioplatyconic acid A lactone), 3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈락식 애시드(3-O-b-D-glucopyranosyl polygalacic acid) 및 메틸-3- O-b-D- 글루코피래노실 폴리갈라에이트 (Methyl-3-O-b-D-glucopyranosyl polygalaeate)를 극미량으로 포함하고 있지만, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물은 프라티코사이드 J(Platycoside J)을 대략 0.9 mg/g, 프라티코사이드 M-1 메틸 에스터(Platycoside M-1 methyl ester)을 대략 0.7 mg/g, 프라티코딘 A(Platycodin A)을 대략 2.89 mg/g, 프라티코닉 애시드 A(platyconic acid A)을 대략 0.07 mg/g, 프라티코닉 애시드 A 락톤(platyconic acid A lactone)을 대략 0.08 mg/g, 데아피오플라티코닉 애시드 A 락톤(Deapioplatyconic acid A lactone)을 대략 0.08 mg/g, 3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈락식 애시드(3-O-b-D-glucopyranosyl polygalacic acid)을 대략 0.51 mg/g 및 메틸-3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈라에이트 (Methyl-3-O-b-D-glucopyranosyl polygalaeate)을 대략 0.15 mg/g 포함하는 것을 확인할 수 있었다
실험예 2 : 성분 분석
실시예 1 및 비교예 2의 흑도라지 추출물을 각각 UPLC-QTOF/MS를 이용하여 성분 분석을 하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
1) UPLC 분석 조건 확립
Waters ACQUITY UPLCTM system (Waters Corp., MA, USA)을 이용해 수행하였다. Thermo Hypersil Gold(2.1 X 100 mm 1.9 um) 컬럼 (column)을 사용하고 이동상으로는 0.1% 포름산 (formic acid)이 첨가된 물 (A)과 0.1% 포름산 (formic acid)이 첨가된 아세토니트릴 (acetonitrile; B)을 사용하였다. 컬럼 오븐을 40℃로 유지시켰고, 이동상을 용매 A(물 중 0.1% 포름산, v/v) 및 용매 B(아세토니트릴 중 0.1% 포름산, v/v)로 구성하였다. 최적 LC 용리 조건을 하기와 같이 적용하였다: 0-0.5 분, 15-15% B; 0.5-1 분, 15-20% B; 1-6 분, 20-20% B; 6-13 분, 20-30% B; 13-23 분, 30-35% B; 23-24 분, 35-38% B; 24-27 분, 38-60% B, 및 27-31 분, 60-90% B. 유동률은 0.5 mL/분이었다. 2 μ분액을 자동-샘플러를 사용하여 컬럼에 주입시켰다.
2) Q-TOF/MS 조건 확립
Q-TOF Micro mass detector (Waters, Manchester, UK)를 사용해 네거티브 (negative) 와 포지티브 모드(positive mode)에서 각각 흑도라지 추출물의 대사체 분석을 위한 최적의 조건을 확립하였다. 비교 결과, 음이온 전자분무 방식 (Negative mode)에서 다양한 대사체가 효과적으로 분석됐으며, 분석조건은 다음과 같다; capillary voltage 3000, cone voltage 40, collision energy 6, desolvation temperature 550℃, source temperature 120℃, cone gas flow 30 L/h, desolvation gas flow 800 L/h. 전구체 이온 정보는 100 및 2,000 m/z 사이에서 데이터를 수집하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물은 비교예 2의 추출물보다 사포닌, 플라티코딘 등의 약리 성분이 현저히 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3 : 알코올에 의한 간세포의 손상 방지 효과 실험
(1) 에탄올 투여에 의한 간 독성 유도 실험 - 실시예 1
5주령의 수컷 Balb/c 마우스에 25% 에탄올을 5g/kg의 투여량으로 1일 1회 총 7일간 경구 투여하여 알콜성 간질환을 유발하였다. 도 4 ~ 도 6은 에탄올 투여에 의한 간 독성 유도 결과를 간 독성의 지표인 GOT/AST, GPT/ALT 및 LDH의 혈중 농도를 특정하여 그래프로 나타낸 것이다. 도 4는 GOT/AST(U/I)의 혈중 농도를 나타낸 그래프이며, 도 5는 GPT/ALT(U/I)의 혈중 농도를 뜻하는 그래프이고, 도 6은 LDH(U/I)의 혈중 농도를 뜻하는 그래프이다. 도 4 ~ 6에 나타난 그래프를 통해, 25% 에탄올을 5g/kg의 투여하지 않은 대조군(NONE)보다 25% 에탄올을 투여한 실험군(EtOH only)에서 GOT/AST, GPT/ALT 및 LDH의 혈중 농도가 모두 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 25% 에탄올을 투여함으로써 간세포가 손상되고, 독성이 발현되는 것을 확인할 수 있다. 에탄올 투여 3일 전부터 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물을 0.5mg/mouse 및 2mg/mouse의 양으로 1일 1회 총 10회 경구 투여한 마우스의 혈청 에서 GOT/AST, GPT/ALT 및 LDH를 정량하여 시료의 간질환 억제 활성을 확인하였다. 이 때, 에탄올 투여를 종료한 후 1일째의 혈청 시료를 이용하여 혈중 GPT/ALT, GOT/AST 및 LDH를 정량화하였다. 그 결과, 에탄올 투여에 의해 상승한 혈중 AST/ALT가 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물의 2mg/mouse 투여량에서 억제효과를 나타내었다 (도 4 및 도 5).
또한, 에탄올 투여에 의한 LDH 혈중농도 상승은 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물의 투여에 의해 유의한 억제효과가 관찰되었다 (도 6).
(2) 에탄올 투여에 의한 간 독성 유도 실험 - 비교예 2
5주령의 수컷 Balb/c 마우스에 25% 에탄올을 5g/kg의 투여량으로 1일 1회 총 7일간 경구 투여하여 알콜성 간질환을 유발하였다. 도 7 ~ 도 8은 에탄올 투여에 의한 간 독성 유도 결과를 간 독성의 지표인 GOT/AST 및 GPT/ALT의 혈중 농도를 특정하여 그래프로 나타낸 것이다. 도 7은 GOT/AST(U/I)의 혈중 농도를 나타낸 그래프이며, 도 8은 GPT/ALT(U/I)의 혈중 농도를 뜻하는 그래프이다. 도 7 ~ 8에 나타난 그래프를 통해, 25% 에탄올을 5g/kg의 투여하지 않은 대조군(NONE)보다 25% 에탄올을 투여한 실험군(EtOH only)에서 GOT/AST 및 GPT/ALT의 혈중 농도가 모두 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 25% 에탄올을 투여함으로써 간세포가 손상되고, 독성이 발현되는 것을 확인할 수 있다. 에탄올 투여 3일 전부터 비교예 2의 9증 9포의 흑도라지 추출물을 2mg/mouse 및 5mg/mouse의 양으로 1일 1회 총 10회 경구 투여한 마우스의 혈청 에서 GOT/AST 및 GPT/ALT를 정량하여 시료의 간질환 억제 활성을 확인하였다. 이 때, 에탄올 투여를 종료한 후 1일째의 혈청 시료를 이용하여 혈중 GPT/ALT 및 GOT/AST를 정량화하였다. 그 결과, 에탄올 투여에 의해 상승한 혈중 AST/ALT가 비교예 2의 9증 9포의 흑도라지 추출물의 2mg/mouse 투여량에서 나타난 억제효과(도 7 및 도 8)는 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물의 2mg/mouse 투여량에서 나타난 억제효과(도 4 및 도 5)보다 현저히 떨어짐을 확인할 수 있었다.
(3) 간 조직 내 항산화 활성 분석
간에 존재하는 항산화 활성 관련 효소인 SOD(Superoxide dismutase)의 발현에 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물이 어떠한 영향을 미치는가를 조사하기 위해, 간 조직 중에 이들 발현량을 정량하였다. 실험의 조건은 상기 실험예 2와 동일하다. SOD의 측정은 에탄올의 투여를 종료한 후 1일째의 간 조직을 용해(lysis)시켜 간 조직 중의 SOD를 정량화하여 분석하였다. 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물의 0.5 mg/mouse 투여량부터 SOD의 발현량이 증가하여, 2 mg/mouse 투여량까지 유의한 증가가 관찰되었다 (도 9). 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물이 항산화에 효과가 있음을 알 수 있었다.
(4) 비장 및 간 무게 측정
실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물의 안전성을 확인하기 위하여 실시예 1의 투여에 따른 실험동물의 비장 및 간 무게변화를 측정하였다.(도 10) 그 결과 실시예 1에서 제조된 흑도라지 추출물 투여에 의한 장기중량 감소는 물론, 에탄올 처리에 있어서도 장기의 중량에는 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 또한 시험기간 중 체중 증가율에 있어서도 별다른 변화는 관찰되지 않았다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형 및 개량 실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형 및 개량 실시들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어져서는 안될 것이다.

Claims (10)

  1. (1) 도라지를 증숙 및 건조하여 1차 증숙된 흑도라지를 제조하는 단계;
    (2) 1차 증숙된 흑도라지를 증숙 및 건조하여 2차 증숙된 흑도라지를 제조하는 단계;
    (3) 2차 증숙된 흑도라지를 증숙 및 건조하여 3차 증숙된 흑도라지를 제조하는 단계; 및
    (4) 상기 3차 증숙된 흑도라지를 수용액으로 추출하여 흑도라지 추출물을 수득하는 단계; 를 포함하고,
    상기 (1)단계의 증숙은 60 ~ 70℃에서 20 ~ 30분동안 수행한 후, 90 ~ 95℃까지 승온하여 2 ~ 5 시간동안 수행하고, 상기 (1)단계의 건조는 20 ~ 40℃에서 16 ~ 30시간동안 수행하며,
    상기 (2)단계의 증숙은 90 ~ 95℃에서 2 ~ 5 시간동안 수행하고, 상기 (2)단계의 건조는 20 ~ 40℃에서 16 ~ 30시간동안 수행하며,
    상기 (3)단계의 증숙은 90 ~ 95℃에서 2 ~ 5 시간동안 수행하고, 상기 (3)단계의 건조는 50 ~ 60℃에서 16 ~ 30시간동안 수행한 후, 30 ~ 40℃까지 감온하여 16 ~ 80 시간동안 수행하며,
    상기 흑도라지 추출물은 프라티코사이드 A(Platycoside A) 3.0 ~ 3.8 mg/g, 프라티코사이드 B(Platycoside B) 2.4 ~ 3.0 mg/g, 프라티코사이드 C(Platycoside C) 1.9 ~ 2.5 mg/g, 프라티코사이드 F(Platycoside F) 10.5 ~ 13.0 mg/g, 프라티코사이드 G1(Platycoside G1) 3.4 ~ 4.2 mg/g, 프라티코사이드 H(Platycoside H) 0.26 ~ 0.32 mg/g, 프라티코사이드 I(Platycoside I) 0.24 ~ 0.3 mg/g, 프라티코딘 J(Platycodin J) 0.32 ~ 0.4 mg/g, 프라티코닉 애시드 C(platyconic acid C) 1.47 ~ 1.81 mg/g, 프라티코닉 애시드 D(platyconic acid D) 1.17 ~ 1.43 mg/g, 데아피오플라티코딘 D(Deapioplatycodin D) 1.71 ~ 2.09 mg/g, 데아피오플라티코딘 D3(Deapioplatycodin D3) 0.9 ~ 1.1 mg/g, 2’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(2’-O-acetyl polygalacin D2) 0.38 ~ 0.47 mg/g, 3’-O-아세틸 폴리갈락신 D2(3’-O-acetyl polygalacin D2) 0.31 ~ 0.39 mg/g, 프라티코사이드 J(Platycoside J) 0.8 ~ 1.0 mg/g, 프라티코사이드 M-1 메틸 에스터(Platycoside M-1 methyl ester) 0.65 ~ 0.8 mg/g, 프라티코딘 A(Platycodin A) 2.6 ~ 3.2 mg/g, 프라티코닉 애시드 A(platyconic acid A) 0.06 ~ 0.08 mg/g, 프라티코닉 애시드 A 락톤(platyconic acid A lactone) 0.07 ~ 0.09 mg/g, 데아피오플라티코닉 애시드 A 락톤(Deapioplatyconic acid A lactone) 0.07 ~ 0.09 mg/g, 3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈락식 애시드(3-O-b-D-glucopyranosyl polygalacic acid) 0.45 ~ 0.57 mg/g 및 메틸-3-O-b-D-글루코피래노실 폴리갈라에이트(Methyl-3-O-b-D-glucopyranosyl polygalaeate) 0.13 ~ 0.17 mg/g을 포함하는 것을 특징으로 하는 알코올성 간손상 예방 기능성 성분을 포함하는 흑도라지 추출물의 제조방법.

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