KR20180082362A - 증숙된 더덕 추출물의 제조방법 및 상기 제조된 더덕 추출물을 포함하는 비알코올성 지방간 치료용 조성물 - Google Patents
증숙된 더덕 추출물의 제조방법 및 상기 제조된 더덕 추출물을 포함하는 비알코올성 지방간 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항산화 활성, 총 폴리페놀, 총 폴라보노이드, 피로갈롤(pyrogallol) 및 델타-트리데칼락톤(Delta-tridecalactone)에서 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 생리활성물질의 함량이 증가되고, 지방간 억제능이 개선된 더덕 추출물의 제조방법 및 상기 제조된 더덕 추출물을 포함하는 항산화용 식품 조성물, 화장료 조성물, 비알코올성 지방간 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 증숙 더덕 추출물은 증숙되지 않은 더덕 추출물에 비해, 항산화 활성이 우수하며, 비알콜성 지방간 형성을 효과적으로 억제하였으며, 중성지방을 정상 수준으로 낮추며, 세포 독성이 없어, 비알코올성 지방간 치료에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 항산화 활성, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 증가되고, 지방간 억제능이 개선된 더덕 추출물의 제조방법 및 상기 제조된 더덕 추출물을 포함하는 비알코올성 지방간 치료용 조성물에 관한 것이다.
활성산소 (reactive oxygen species, ROS)는 미토콘드리아와 같은 세포내 기관의 정상적인 대사 및 세포질 내에서 여러 가지 세포반응들을 조절할 수 있는 신호분자로 작용하지만, 과량의 활성산소는 DNA를 파괴하고 효소를 불활성화 시키며 세포막을 공격하여 생체기능의 저하와 노화를 유발한다. 또한 심장병, 당뇨병, 류마티스성 관절염, 동맥경화, 암과 같은 질환의 원인으로 작용하고 있다.
최근 들어 인체 내 부작용이 없는 약용식물 유래의 추출물들을 활용하여 항산화 방어시스템을 증가시키거나, 기능성 소재 개발을 통하여 직접적으로 활성산소를 제거하고자 하는 연구들이 전 세계적으로 활발하게 추진되고 있으며 국내에서도 중요한 국가정책으로 추진되고 있다.
더덕(Codonopsis lanceolate)은 한국, 중국, 일본의 해발 300m 이상 산간지역에서 주로 자라는 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 다년생 덩굴성 식물로서, 예로부터 변비예방, 항암, 혈압강하, 해소 및 거담 등 호흡기 질환의 치료는 물론 병후회복, 유즙분비 촉진 등 약용으로 사용되어왔다.
특히 한국산 더덕의 뿌리 추출물을 투여한 쥐에서, 심리적 스트레스에 의하여 감소되는 것으로 알려진 남성 호르몬인 testosterone의 감소가 억제되는 것으로 밝혀졌고, 남성 갱년기 증후군 (PADAM-like symptoms)의 주요 원인이 되는 호르몬인 androgen의 부분적인 결핍이 개선됨이 보고되어 있다.
또한 한국산 더덕 뿌리에서 7종류의 3, 28-bidesmosidic triterpenoid 사포닌이 분리되었으며, 더덕의 대표적인 triterpenoid 사포닌 중 주 사포닌으로 알려진 lancemaside A는 대장염을 유도한 쥐에서 염증인자 단백질 (NF-κB)을 억제하여 대장염을 완화시킨다는 보고가 있다.
더덕의 약리작용이 뛰어남에도 불구하고, 더덕을 이용한 가공제품은 현재 생더덕, 깐더덕, 더덕무침 등 단순가공에 치우쳐 있고 부가가치를 높일 수 있는 제품개발도 거의 이루어지고 있지 않은 상황이다.
최근 전 세계적으로 새로운 생물자원으로서 더덕과 같은 약용식물의 가치가 부각됨에 따라 약용성분을 함유한 식물자원의 확보 및 개발에 대한 각국의 경쟁이 가열되고 있으며 인류공동의 자산으로 인식되던 생물유전자원을 각국의 고유자원으로 선언하고 권리를 확보하는 방향으로 세계 각국들이 약용식물에 대한 인식이 변화되고 있는 추세이다.
UN은 2010년을 ‘생물다양성의 해’로 지정하고 일본 나고야에서 열린 제10차 생물다양성 협약에서 2020년까지 ABS 의정서(유전자원 접근 및 이익을 공유하기 위한 협상)를 채택하기로 합의했다.
특히, 글로벌 제약회사들은 부작용이 적은 천연물 신약에 주목하고 있고 동물자원보다 식물자원을 선호하는 경향이 더 뚜렷이 나타나고 있으며, 보완 대체 의약산업으로 불리는 세계 약용식물 시장은 2002년 약 600억 달러에서 2007년 2,124억 달러, 2050년에는 5조 달러 규모로 성장할 것으로 예측하고 있다.
전 세계적으로 웰빙 및 로하스 등의 문화가 확산되고 천연물에 대한 선호도 증가 및 자연치유력을 높이는 대체요법 등의 선호도가 증가하면서 외국의 다국적 기업조차도 기능성 식품 및 한의약 제품에 대한 관심이 고조되고 있는 현실이다.
세계 약용식물 시장이 꾸준히 성장하고 있으며, 외관상의 이유로 판매되지 못하는 생 더덕에 대한 부가적인 처리비용 및 환경문제가 대두되고 있는 현실로 볼 때, 가공을 통한 더덕 고유의 효능을 증가시키거나 소비자의 기호에 맞는 고부가가치 상품으로 전환시킬 수 있는 가공기술 분야에 대한 개발이 필요하다.
또한, 가공공정을 통한 더덕의 고품질·고부가가치화를 통해 의약품, 화장품, 차(茶)류, 건강 및 기능성 식품 등 관련 제품의 다양화를 추진할 수 있을 것으로 보인다.
본 발명의 목적은 더덕을 100 내지 140℃에서 10 내지 100분 동안 0.05~0.10Mpa 압력에서 증숙하는 단계;
상기 증숙된 더덕을 50 내지 70℃에서 20 내지 30시간 건조하는 단계; 및
상기 건조한 더덕을 분쇄하고 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 가하여 50 내지 70에서 20 내지 30시간 추출하는 단계를 포함하는, 항산화 활성, 생리활성물질의 함량이 증가되고, 지방간 억제능이 개선된 더덕 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 항산화 활성, 총 폴리페놀, 총 폴라보노이드, 피로갈롤(pyrogallol) 및 델타-트리데칼락톤(Delta-tridecalactone)에서 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 생리활성물질의 함량이 증가되고, 지방간 억제능이 개선된 더덕 추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 더덕 추출물을 포함하는, 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 더덕 추출물을 포함하는, 비알코올성 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 더덕 추출물을 포함하는, 항산화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 더덕 추출물을 포함하는, 항산화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자는 더덕의 다양한 생리활성을 극대화 할 수 있는 방법을 연구하였으며, 그 결과 본 발명에 따른 증숙 공정을 반복하여 제조된 더덕 추출물이 증숙 공정을 거치지 않은 더덕 추출물보다 항산화 활성, 총 폴리페놀, 총 폴라보노이드, 피로갈롤(pyrogallol) 및 델타-트리데칼락톤(Delta-tridecalactone) 등의 생리활성물질의 함량이 증가되고, 지방간 억제능이 개선된 것을 확인하였다. 또한, 상기 증숙 공정에 의해 제조된 더덕을 이용하여 지방간 치료 또는 항산화용 조성물에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 더덕을 100 내지 140℃에서 10 내지 100분 동안 0.05~0.10Mpa 압력에서 증숙하는 단계; 상기 증숙된 더덕을 50 내지 70℃에서 20 내지 30시간 건조하는 단계; 및 상기 건조한 더덕을 분쇄하고 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 가하여 50 내지 70℃에서 20 내지 30시간 추출하는 단계를 포함하는, 항산화 활성, 생리활성물질의 함량이 증가되고, 지방간 억제능이 개선된 더덕 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은 더덕을 100 내지 140℃에서 10 내지 100분 동안 0.05~0.10Mpa 압력에서 증숙하는 단계(1)를 포함한다.
"더덕(Codonopsis lanceolate)은 한국, 중국, 일본의 해발 300m 이상 산간지역에서 주로 자라는 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 다년생 덩굴성 식물로서, 예로부터 변비예방, 항암, 혈압강하, 해소 및 거담 등 호흡기 질환의 치료는 물론 병후회복, 유즙분비 촉진 등 약용으로 사용되어왔다.
본 발명에서 더덕은 야생에서 채취한 산더덕과 인공에서 재배한 밭더덕을 모두 사용할 수 있고, 시장에서 용이하게 구입하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 제주시 더덕 농가에서 구매한 생 더덕을 흐르는 물로 깨끗하게 세척한 후 열풍건조시켜 건조 더덕을 사용할 수 있다.
세척이 끝나고 건조된 더덕은 100 내지 140℃에서 10 내지 100분 동안 0.05~0.10Mpa 압력에서 증숙한다. 본 증숙은 4~9회 반복되어야 하므로, 상기 증숙 온도 및 시간 조건이 본 발명의 목적에 가장 적합하다. 본 증숙은 초고압멸균기 또는 증숙기를 이용하여 실시할 수 있으며, 본 발명에서는 더덕의 증숙은 본 발명자에 의해 개발된 증숙기와 초고압멸균기를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 초고압멸균기는 도 1에 도시되어 있으며, 상기 증숙기는 도 2에 도시되어 있다. 상기 초고압멸균기는 대한과학의 WAC-60 제품을 사용하였다. 본 발명자에 의해 개발된 증숙기는 128℃에서 20분간 0.06Mpa 압력으로 증숙 후 130℃에서 60분간 0.01Mpa 이내의 압력으로 진공을 걸어주는 장치를 구성으로 하고 있다.
본 발명의 제조방법은 상기 증숙된 더덕을 50 내지 70℃에서 20 내지 30시간 건조하는 단계(2)를 포함한다.
상기 제1단계의 증숙 단계를 통해 증숙된 더덕은 건조하는 단계를 거치는데, 더덕의 건조는 양건건조, 음건건조, 열풍건조, 항온건조(항온건조기 이용) 또는 자연 건조의 방법을 통해 시행될 수 있으나, 구체적으로 항온건조나 열풍건조를 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 더덕의 건조는 증숙된 더덕을 50 내지 70℃에서 20 내지 30시간 건조를 통해 이뤄진다.
또한, 상기 제1단계의 증숙과 제2단계의 건조 처리 공정은 4~9회 반복 수행하는 것이 가장 바람직하다. 4~9회 정도 더덕이 연속적으로 증숙 및 건조되어야 생리활성 물질의 함량이 가장 극대화 되기 때문이다.
본 발명에서, 상기 증숙과 건조사이에, 120 내지 140℃에서 50 내지 70분 동안 0.005 내지 0.02Mpa 압력으로 진공을 걸어주는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 1단계의 증숙 후 그리고 2단계의 건조 전에 증숙기를 이용하여, 진공을 걸어주어 증숙을 실시할 수 있다. 진공을 걸어줌에 따라, 진공상태에서 이루어지기 때문에 빠른 시간 안에 더덕의 내부까지 고르게 증숙되게 된다.
본 발명의 제조방법은 상기 건조한 더덕을 분쇄하고 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 가하여 50 내지 70℃에서 20 내지 30시간 추출하는 단계(3)를 포함한다.
상기 1 및 2단계를 거친 증숙 및 건조된 더덕은 분쇄하는 단계를 거치며, 분쇄된 더덕에 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 가하여 50 내지 70℃에서 20 내지 30시간 추출하여 추출물을 얻을 수 있다.
상기 더덕 추출물은 증숙 및 건조된 더덕을 분쇄한 후, 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있다. 구체적으로, 증숙 및 건조된 더덕의 분쇄물을 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 8 내지 12배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 50 내지 70℃에서 20 내지 30시간 추출할 수 있다. 상기 증숙된 더덕 추출물은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있으나, 항산화 활성, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 증가되고, 지방간 억제능이 개선된 더덕을 추출하는 방법이라면 제한없이 이용될 수 있다.
또한 상기 추출물은 이후, 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다.
구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다. 또한, 상기 수득한 더덕 추출물은 사용 시까지 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관할 수 있고, 농축 및 동결건조를 통하여 수분을 완전히 제거시킬 수 있으며, 상기 수분을 완전히 제거시킨 더덕 추출물은 분말형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.
또한, 상기 제조된 더덕 추출물을 현탁한 후, 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 염화 메틸렌, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획함으로써 분획물을 수득할 수 있다.
본 발명에서, 상기 생리활성물질은 총 폴리페놀, 총 폴라보노이드, 피로갈롤(pyrogallol) 및 델타-트리데칼락톤(Delta-tridecalactone)에서 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에 따라 제조된 증숙된 더덕 추출물이 실제로 항산화력이 있는지 여부를 조사하였는데, 즉, 증숙된 추출물은 증숙되지 않은 추출물에 비해 항산화 활성이 현저히 증가하였으며, 더덕 추출물의 총 페놀함량, 총 플라보노이드 함량을 조사한 결과, 본 발명에 따른 증숙 공정을 거친 더덕 추출물이 총 페놀함량, 총 플라보노이드 함량이 탁월하게 높음을 알 수 있었다(표 1 내지 표 3 참조).
구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는, DPPH 소거율을 이용하여 본 발명에 따른 더덕의 추출물의 항산화 효과를 측정하였는 데, 그 결과 증숙 과정을 거치지 않은 것과 비교해 본 발명에 따른 더덕의 추출물이 DPPH 소거율이 뛰어나 유의적으로 항산화 효과가 증가됨을 알 수 있었다(표 1 참조).
구체적으로, 본 발명의 다른 일실시예에서는, 더덕의 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였는 데, 그 결과 증숙 과정을 거치지 않은 것과 비교해 본 발명에 따른 더덕의 추출물이 총 폴리페놀 함량이 현저히 증가됨을 알 수 있었다(표 2 참조).
구체적으로, 본 발명의 다른 일실시예에서는, 더덕의 추출물의 총 폴리보노이드 함량을 효과를 측정하였는 데, 그 결과 증숙 과정을 거치지 않은 것과 비교해 본 발명에 따른 더덕의 추출물이 총 폴리보노이드 함량이 현저히 증가됨을 알 수 있었다(표 3 참조).
또한, 본 발명에서는 더덕의 추출물의 제브라피쉬에 대한 독성 실험을 실시한 결과, 제브라피쉬 발생에 이상이 없어 독성이 없는 것을 알 수 있었다(도 2 참조).
본 발명의 일실시예에서는, 더덕의 추출물의 중성 지방 억제 효과를 측정하였는 데, 그 결과 증숙 과정을 거치지 않은 것과 비교해 본 발명에 따른 더덕의 추출물이 중성 지방 함량이 현저히 감소됨을 알 수 있었다(도 2 참조).
또한, 본 발명의 일실시예에서는, 더덕의 추출물의 지방간 억제 효과를 측정하였는 데, 그 결과 증숙 과정을 거치지 않은 것과 비교해 본 발명에 따른 더덕의 추출물이 지방간 억제능이 현저히 우수함을 알 수 있었다(도 3 참조).
또한, 본 발명의 일실시예에서는, 증숙된 더덕의 추출물에서 증가하는 생리활성물질을 HPLC 및 LC-MS/MS로 분석하였는 데, 그 결과 피로갈롤(pyrogallol)과 델타-트리데칼락톤(Delta-tridecalactone)의 함량이 증가하는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 상기의 결과를 통해, 본 발명에 따른 증숙 공정을 통한 더덕 추출물은 항산화 활성, 총 폴리페놀, 총 폴라보노이드, 피로갈롤(pyrogallol) 및 델타-트리데칼락톤(Delta-tridecalactone)에서 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 생리활성물질의 함량이 증가되고, 지방간 억제능이 개선되어, 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학조성물과 식품 조성물 그리고 항산화용 식품 조성물과 화장료 조성물로 이용될 수 있다.
또한, 상기 Delta-tridecalactone은 암세포의 invasion 저해효과(Tanaka et al., 2007) 및 향신료로써의 기능이 있다고 알려져 있으며, pyrogallol은 인간 폐암세포(HAN et al., 2008) 및 박테리아 성장을 저해(Tinh et al., 2016)하는 것으로 보고되어 있는 바, 상기 더덕 추출물을 이용하여, 항균용 조성물, 항암용 약학, 식품조성물로도 이용이 가능하다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 항산화 활성, 총 폴리페놀, 총 폴라보노이드, 피로갈롤(pyrogallol) 및 델타-트리데칼락톤(Delta-tridecalactone)에서 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 생리활성물질의 함량이 증가되고, 지방간 억제능이 개선된 더덕 추출물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 용어 "항산화 활성", "총 폴리페놀", "총 플라보노이드", "지방간 억제능"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 더덕 추출물을 포함하는, 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서의 용어, '지방간'은 정상세포내에는 존재하지 않는 중성지방이 간 세포 내에 비정상적으로 침착되어 보이는 현상이(Lombardi, 1966) 나타난 것을 말한다. 정상 간은 약 5%가 지방조직으로 구성되어 있으며 중성지방, 지방산, 인지질, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스터가 지방의 주성분이나, 일단 지방간이 발생되면 대부분의 성분이 중성지방으로 대체되며, 중성지방의 양이 간 중량의 5 %이상이면 지방간으로 진단된다(Alpers et al.,1993).
지방간은 간세포 내의 지방대사 장애나 과잉지방을 운반하는 과정에서의 결함 등에 의하여 초래되는 것으로서, 주로 간에서의 지방대사 장애로 인하여 발생한다. 상기 지방간에서 축적된 지방의 대부분은 중성지방(triglyceride)이며, 지방간은 크게 비만, 당뇨병, 고지혈증, 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간과 과음으로 인한 알코올성 지방간으로 나눌 수 있다.
상기 '비알코올성 지방간'은, 알코올 섭취 과거력이 없으면서 지방간을 동반하는 경우를 말하며, 비만, 당뇨, 고지혈증 등 대사성 질환과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 비알코올성 지방간에는 단순히 간 내에 지방이 축적된 것 뿐만 아니라, 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis) 및 말기 섬유화 간질환등이 여기에 속한다.
'알코올성 지방간'은 알코올을 많이 섭취하게 되어 간에서 지방 합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않아 발생하게 되는 것을 말한다. 알코올은 체내에 저장되지 못하고 간에서 산화작용에 의하여 완전히 없어지게 되는데, 구체적으로 보면, 간에서 알코올은 크게 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase : ADH) 경로, 미소체 알코올 산화체계(microsomal ethanol oxidizing system : MEOS) 경로 및 카탈라제(catalase) 경로의 세가지 경로에 의해 대사되어 아세트알데히드로 변환되고, 이는 다시 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase : ALDH)에 의하여 아세트염으로 대사된다. 이때, 아세트알데히드는 독성이 있어 간세포에 손상을 줄 수 있고, 또한 이러한 알코올의 대사 결과 지방산이 많이 만들어져 간에 지방이 축적되게 되는데, 상기와 같은 원인으로 간에 축적된 지방간을 알코올성 지방간이라고 한다.
지방간은 대부분 비만과 관련이 있는 것으로 알려져 있으나, 이외에도 마르거나 정상인 사람에게서도 나타날 수 있는 질환이다(Gastroenterology., 107, 1103 ∼ 1109 (1994)). 이와 같은 사실은 지방간이 있는 환자의 40%(32/81)가 정상 체질량 지수를 보였다는 보고에 의해서도 뒷받침 될 수 있다(Nucl Med Mol Imaging., 40, 243 ∼ 248 (2006)). 특히 비만이 아닌 군에서 중성지방이 주요 요소로 작용하는 것으로 보고 (J.Clin.Gastroenterol., 40, 745 ∼ 752 (2006))되었으며, 지방간이 있는 환자의 경우 정상군보다 콜레스테롤, 중성지방의 수치가 통계적으로 유의하게 높게 나타나 비만이 아닌 경우에 있어서, 지방간과 중성지방 간의 연관성이 높다는 사실을 보여주고 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 비알코올성 지방간 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 비알코올성 지방간 질환의 발병 의심 개체에 투여하여 비알코올성 지방간 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
또한 본 발명의 일실시예에서는 상기 증숙된 더덕의 추출물이 독성이 없음을 확인하였으며, 증숙된 추출물은 증숙되지 않은 추출물에 비해 항산화 활성이 현저히 증가하였으며, 총 페놀함량, 총 플라보노이드 함량이 탁월하게 높음을 알 수 있었다. 또한, 증숙 과정을 거치지 않은 것과 비교해 본 발명에 따른 더덕의 추출물이 중성 지방 함량이 현저히 감소되었으며, 지방간 억제능이 현저히 우수함을 확인하여, 지방간 치료용 약학 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 더덕 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 더덕 추출물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비알코올성 지방간 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 더덕 추출물을 포함하는, 비알코올성 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 더덕 추출물, 및 비알코올성 지방간에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서의 용어, "개선"은 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 비알코올성 지방간 같은 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
구체적으로, 본 발명의 더덕 추출물을 비알코올성 지방간의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 더덕 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 더덕 추출물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 더덕 추출물은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 더덕 추출물을 포함하는, 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
상기 더덕 추출물, 항산화, 식품 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 더덕 추출물을 포함하는, 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 더덕 추출물, 항산화에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 항산화용 화장료 조성물은 전체 조성물 중량에 대하여 0.001 내지 100 중량％의 상기 더덕 추출물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량％의 더덕 추출물을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이 등의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 증숙된 더덕 추출물은 증숙되지 않은 더덕 추출물에 비해, 비알콜성 지방간 형성을 효과적으로 억제하였으며, 중성지방을 정상 수준으로 낮추며, 세포 독성이 없어, 비알코올성 지방간 치료에 이용될 수 있다.
도 1은 초고압멸균기(LAB)를 나타낸다.
도 2는 자체 개발한 증숙기(GEO)를 나타낸다.
도 3은 증숙된 더덕 추출물 투여량에 따른 제브라피쉬의 배아 발생을 나타낸 것이다.
도 4는 무처리구(control), 대조구(Tamoxifen), 초고압멸균기 (LAB) 0차, 6차, 8차, 증숙기 (GEO) 5차의 처리를 통한 증숙 더덕 추출물의 Triglyceride 함량을 비교한 것이다.
도 5는 무처리구(control), 대조구(Tamoxifen), 초고압멸균기 (LAB) 0차, 6차, 8차, 증숙기 (GEO) 5차의 처리를 통한 증숙된 더덕 추출물의 지방간 억제 효능을 비교한 세포절단면 염색 도를 나타낸 것이다. 노란색 화살표가 지방간을 나타내는 lipid droplet을 나타낸다.
도 6은 자체 개발한 증숙기(GEO)를 이용한 증숙 더덕 추출물의 HPLC 분석결과를 나타낸 것이다.
도 7은 DDP9 피크 1의 MS-MS 크로마토그램을 나타낸다. (A) 총 이온 크로마토 그래피, (B) 단일 질량 분석을 위한 DD9 피크의 분열 패턴(fragmentation pattern), (C) 이중 질량 분석을 위한 DD9 피크의 분열 패턴, (D) MS/MS 분석에 근거한 화합물의 구조를 나타낸다.
도 8은 DDP9 피크 2의 LC-MS-MS 크로마토그램을 나타낸다. (A) 총 이온 크로마토 그래피, (B) 단일 질량 분석을 위한 DD9 피크의 분열 패턴, (C) 이중 질량 분석을 위한 DD9 피크의 분열 패턴, (D) MS/MS 분석에 근거한 화합물의 구조를 나타낸다.
도 2는 자체 개발한 증숙기(GEO)를 나타낸다.
도 3은 증숙된 더덕 추출물 투여량에 따른 제브라피쉬의 배아 발생을 나타낸 것이다.
도 4는 무처리구(control), 대조구(Tamoxifen), 초고압멸균기 (LAB) 0차, 6차, 8차, 증숙기 (GEO) 5차의 처리를 통한 증숙 더덕 추출물의 Triglyceride 함량을 비교한 것이다.
도 5는 무처리구(control), 대조구(Tamoxifen), 초고압멸균기 (LAB) 0차, 6차, 8차, 증숙기 (GEO) 5차의 처리를 통한 증숙된 더덕 추출물의 지방간 억제 효능을 비교한 세포절단면 염색 도를 나타낸 것이다. 노란색 화살표가 지방간을 나타내는 lipid droplet을 나타낸다.
도 6은 자체 개발한 증숙기(GEO)를 이용한 증숙 더덕 추출물의 HPLC 분석결과를 나타낸 것이다.
도 7은 DDP9 피크 1의 MS-MS 크로마토그램을 나타낸다. (A) 총 이온 크로마토 그래피, (B) 단일 질량 분석을 위한 DD9 피크의 분열 패턴(fragmentation pattern), (C) 이중 질량 분석을 위한 DD9 피크의 분열 패턴, (D) MS/MS 분석에 근거한 화합물의 구조를 나타낸다.
도 8은 DDP9 피크 2의 LC-MS-MS 크로마토그램을 나타낸다. (A) 총 이온 크로마토 그래피, (B) 단일 질량 분석을 위한 DD9 피크의 분열 패턴, (C) 이중 질량 분석을 위한 DD9 피크의 분열 패턴, (D) MS/MS 분석에 근거한 화합물의 구조를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 최적의 더덕
증숙
공정 확립
제주시 더덕 농가에서 구매한 생더덕을 흐르는 물로 깨끗하게 세척한 후 열풍건조시켜 건조 더덕을 제조하였다. 상기 건조된 더덕을 초고압 멸균기와 증숙기를 이용하여 증숙을 실시하였다. 더덕의 증숙 방법으로는 자체 제작한 증숙기와 초고압 멸균기를 이용하여 다음과 같은 조건으로 증숙 더덕을 확보하였다.
1) 초고압멸균기를 이용한 증숙
초고압멸균기(LAB)를 이용한 증숙 방법은 108℃에서 90min 동안 0.06~0.08Mpa 압력으로 증숙을 실시한 후, 증숙된 더덕을 항온건조기를 사용하여 60℃에서 24시간 건조시켰다. 상기 증숙과 건조 과정은 1회에서 9회까지 실시하였으며, 증숙과 건조 가공 횟수에 따라 1회에서 9회로 분류하여 이후의 실험에 사용하였다.
2) 증숙기를 이용한 증숙
자체 개발한 증숙기(GEO)를 활용한 증숙 방법은 128℃에서 20min간 0.06Mpa 압력으로 증숙 후 130℃에서 60min간 0.01Mpa 압력으로 진공을 걸어주는 방법으로 증숙을 실시하였으며, 증숙 후, 증숙된 더덕을 열풍기에서 24시간 건조시켰다.
상기 증숙과 건조 과정은 1회에서 9회까지 실시하였으며, 증숙과 건조 가공 횟수에 따라 1회에서 9회로 분류하여 이후의 실험에 사용하였다.
실시예
2.
증숙
더덕 추출물 및 동결건조 분말의 제조
증숙 공정을 거친 후, 건조된 증숙 더덕을 분쇄기로 곱게 갈아 분쇄된 시료 10g에 10 배수(v/w)의 80% EtOH (100mL)을 가하여 60℃ 수욕상에서 24시간 동안 추출하였다. 용매 추출 완료 후 0.22um 필터를 사용하여 불순물이 제거된 더덕 추출물을 확보한 후 회전식 진공 농축기를 사용하여 농축하였다. 상기 농축 추출물은 동결건조기를 사용하여 -54℃에서 24시간 동안 동결건조를 실시하여 분말상태의 증숙더덕 추출물을 실험에 사용하였다.
실시예
3.
증숙
단계별
증숙
더덕의
DPPH
자유라디칼 소거 활성
증숙 단계별 자유라디칼 소거 활성을 알아보기 위해 일정농도로 희석된 증숙 더덕 시료 80ul와 100% EtOH를 이용하여 제조한 0.1mM DPPH 용액 200ul를 혼합하여 25℃에서 20분 동안 암실에서 반응 한 후 525nm에서 흡광도 측정을 하였다. 결과 값은 증숙 더덕 추출물 첨가구와 무첨가구를 비교하여 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였으며, 실험은 3회 반복 수행하여 평균값을 나타내었다.
증숙 단계별 더덕의 자유라디칼 소거능은 초고압멸균기와 증숙기를 이용하여 제작한 증숙 더덕 모두에서 증숙이 진행될수록 항산화 활성이 크게 증가하는 것을 확인하였다. 초고압멸균기(LAB)를 이용한 증숙 더덕의 경우 6차와 8차의 EC50값은 1.38과 1.37mg/ml로 낮은 농도를 보였다. 이러한 수치를 통해, 증숙 전의 더덕에 비해 증숙을 거친 더덕이 약 2.4배 항산화 활성이 증가된 것을 확인하였다.
또한, 증숙기(GEO)를 이용한 증숙 더덕의 경우 7차와 9차의 EC50값이 0.70mg/ml로 증숙 전의 더덕에 비해 5배 이상 높은 항산화 활성을 나타내었다(표 1). 하기 표 1은 증숙 횟수에 따른 증숙 더덕의 항산화 활성 비교(EC50)한 것이다.
실시예
4.
증숙
단계별
증숙
더덕의 총 폴리페놀 함량
총 페놀 함량은 Folin-Denis 방법을 변형하여 측정하였다. 각각의 증숙 단계별 증숙 더덕 추출물을 1 mg/mL의 농도로 용해한 시료 125 ul에 3차 증류수 1.375ml을 첨가한 후, Folin- Ciocalteu's phenol reagent(2 N) 500 ul를 추가한 다음 실온에서 3-5분간 암반응 시킨 후 10% Na2CO3(sodium carbonate) 1ml을 추가한 다음 실온에서 30분간 암반응 시킨 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid를 사용하여 얻은 검량선으로 총 폴리페놀의 함량을 산출하였으며, 실험은 3회 반복 수행하여 평균값을 나타내었다.
증숙 더덕의 총 폴리페놀성 화합물의 함량은 증숙 횟수가 증가할수록 증가하는 경향을 보였으며, 초고압멸균기와 증숙기를 이용한 증숙 더덕 모두에서 증가하였다(표 2). 특히 초고압멸균기(LAB)를 활용한 증숙 더덕의 경우, 6차와 8차에서 69.85와 74.07mg/g의 높은 폴리페놀 함량을 보였다. 증숙기(GEO)를 활용한 증숙 더덕의 경우 9차에서 53.44mg/g의 폴리페놀 함량을 나타냈다. 위의 결과로 볼 때, 초고압멸균기를 활용하여 8차례 증숙을 진행한 증숙 더덕의 폴리페놀 함량이 가장 높았다. 하기 표 2는 증숙 횟수에 따른 증숙 더덕의 총 폴리페놀 함량(mg/g)을 나타낸 것이다.
실시예
5.
증숙
단계별
증숙
더덕의 총 플라보노이드 함량
총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등과 Singleton 등의 방법을 응용하여 측정하였다. 10 mg/mL의 농도로 용해한 시료 40 μL를 5% sodium nitrite solution 6 μL와 3차 증류수 80 μL를 혼합하여 5분간 반응시키고 10% aluminum chloride solution 12 μL를 첨가하여 다시 6분간 반응시킨 후 1 M NaOH 40 μL와 3차 증류수 42 μL를 섞어 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 검량선을 작성한 후 총 플라보노이드 함량을 산출하였으며, 실험은 3회 반복 수행하여 평균값을 나타내었다.
증숙 더덕의 총 플라보노이드 함량은 증숙 횟수가 증가할수록 증가하는 경향을 보였으며, 초고압멸균기와 증숙기를 이용한 증숙 더덕 모두에서 증가하였다(표 3). 초고압멸균기(LAB)를 활용한 증숙 더덕의 경우 총 폴리페놀과 동일하게 6차와 8차에서 0.74와 0.79mg/g으로 가장 높게 나타났다.
증숙기(GEO)를 이용한 증숙 더덕의 경우 9차 증숙 더덕에서 1.16mg/g으로 증숙하지 않은 더덕(GEO O)에 비해 2배이상 총 플라보노이드 함량이 증가되는 것을 알 수 있었다.
이러한 결과로 볼 때 총 폴리페놀 함량과는 반대로 증숙 더덕 추출물의 플라보노이드 함량은 증숙기(GEO)를 활용한 증숙 더덕이 초고압멸균기(LAB)를 활용한 증숙 더덕보다 높게 나타나는 것을 알 수 있었다. 하기 표 3은 증숙 횟수에 따른 증숙 더덕의 총 플라보노이드 함량 (mg/g)을 나타낸 것이다.
이상과 같이 항산화 활성, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 결과를 비교 분석하여, 이들 활성과 함량이 우수하였던, 초고압멸균기(LAB)를 활용한 6차와 8차 증숙 더덕 그리고 증숙기(GEO)를 활용한 5차 증숙더덕을 이용하여, 비알콜성 지방간 억제 실험을 진행하였다.
실시예
6.
증숙
더덕의 지방간 억제 시험
1) 독성 시험
인간의 유전자 정보와 organ system이 유사한 척추동물로서 Zebrafish는 최근 인간 질병 정복을 위한 디딤돌로서 높이 평가되고 있다. RNA와 단백질 수준에서의 유전자 조절연구를 손쉽게 할 수 있는 기관 등을 외부에서 관찰할 수 있는 이 있으며, 개체발생 및 기관형성 과정이 매우 빠르게 진행되기 때문이다. 이러한 장점들로 인해 Zebrafish의 대량의 배아를 이용하여 지금까지 많은 제한이 있었던 약물개발과 인간질병분야에서도 whole-organism에 대한 생물학적 가치를 분석할 수 있게 되었다.
이에, 증숙 더덕 추출물의 비알콜성 지방간 억제 효능을 평가하기 위하여, 제브라피쉬를 대상으로 증숙 더덕 추출물의 독성실험과 지방간 억제효능 분석을 진행하였다.
제브라피쉬를 대상으로 한 증숙 더덕 추출물의 독성 테스트 결과 100ug/ml의 고농도 증숙 더덕 추출물 투여에도 불구하고, 배아발생 24시간까지 모든 제브라피쉬 발생에 이상이 없는 것으로 나타났다(표 4, 및 도 1). 이러한 결과는 증숙 더덕 추출물의 세포내 안정성을 보여주는 결과이다. 이하에서는 제브라피쉬 성체를 이용한 지방간 억제 효능 분석을 상기 독성 테스트 결과를 바탕으로 증숙 더덕 추출물 5ug/ml과 10ug/ml의 농도를 이용하여 진행하였다. 하기 표 4는 증숙 더덕 추출물 투여량에 따른 제브라피쉬의 배아 발생 정도를 나타낸 것이다.
2) 지방간 억제시험
지방간 억제효능에 대한 분석은 무처리구(control), 지방간 유도물질 (Tamoxifen) 투여구, 증숙 더덕 투여구로 나누어 진행하였으며, 이 결과를 도 2에 나타내었다. 지방간 유도물질인 tamoxifen을 처리한 결과 대조군(control)에 비하여 혈액 내에 중성지방(Triacylglyceride, TG)의 양이 2배 증가하였다. 증숙하지 않은 더덕 추출물의 경우 (LAB 0) 10 μg까지 처리하여도 중성지방 억제에 효과가 없었다.
이에 반하여, 초고압멸균기(LAB)를 이용하여 6번 증숙한 더덕에서 얻은 추출물을 tamoxifen 처리한 제브라피쉬에 5μg 투여하였을 경우(LAB 6), 무처리 수준으로 중성지방(Triacylglyceride, TG)의 양이 감소하였다.
초고압 멸균기(LAB)를 이용하여 8번 증숙한 더덕에서 얻은 추출물 (LAB 8)는 10 μg에서 중성지방의 감소를 확인할 수 있어서, 6번 증숙한 더덕 추출물(LAB 6)의 효과가 더 높았다.
LAB 6의 경우 LAB 8에 비하여 항산화 효능이나, 폴리페놀 함량, 플라보이드 함량 등에 있어서 다소 작거나 비슷하므로, 혈액내의 중성지방 감소효과는 항산화효능, 폴리페놀함량, 플라보노이드에 의한 효과라기 보다는 증숙 과정에 생성된 새로운 물질에 의한 것으로 추정된다.
- 항산화 효능: LAB 6 (EC50: 1.38), LAB 8 (EC50: 1.37)
- 폴리페놀: LAB 6 (69.85 mg/g), LAB 8 (74.07mg/g)
- 플라보노이드: LAB 6 (0.74 mg/g), LAB 8 (0.79mg/g)
증숙기(GEO)를 이용한 5번 증숙한 더덕에서 얻은 추출물의 경우(GEO 5)의 경우 초고압멸균기(LAB)를 이용하여 얻은 LAB 6과 비슷한 정도의 지방생성억제 효능을 보이는 것으로 확인되었다. GEO 5의 경우에는 항산화 효과는 EC50이 0.90으로 효과적이나, 폴리페놀 (37.70 mg/g), 플라보노이드 (0.76 mg/g)으로 LAB에 비하여 폴리페놀 함량은 낮고, 플라보노이드 양은 비슷하므로, LAB 6 및 LAB 8과 마찬가지로 항산화 물질, 폴리페놀, 플라보노이드 이외에 다른 물질이 작용하는 것으로 보인다.
한편, 제브라피쉬의 간을 분리하여, 현미경을 통하여 지방간의 진행 정도를 파악한 결과(도 3 참조), 혈액내 중성지방량 분석에서와 비슷한 결과를 얻을 수 있었다. Tamoxifen의 경우 간에 지방 축적을 유도하였고 (화살표), 이러한 지방축적은 LAB 6을 처리함으로써, 정상에 가깝게 회복되었다. 마찬가지로 GEO 5에서도 비슷한 효과가 관찰되었다.
따라서, 상기와 같은 결과를 통해 본 발명에서 초고압 멸균기(LAB)를 이용하여 6회 증숙한 더덕 추출물과 증숙기(GEO)를 활용하여, 5회 증숙한 더덕의 추출물이 지방간을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 본 발명의 증숙 조건에서 얻은 더덕 추출물이 증숙하지 않은 더덕 추출물에 비해 우수한 지방간 억제효과를 보여주었으므로, 더덕을 이용한 지방간 억제 기능성 식품 등을 개발할 경우 증숙방법은 필수적임을 확인하였다.
실시예
7.
증숙더덕의
HPLC
및 LC-MS/MS 분석
앞서 초고압 멸균기(LAB)과 증숙기(GEO)를 이용하여 증숙한 더덕을 비교하였을 때 증숙기(GEO)를 이용한 증숙 더덕에서 항산화 효과가 우수하였으며, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높았으며, 지방간 억제 효능이 좋다는 것을 알 수가 있었다. 이에, 증숙하지 않은 더덕(CE)와 증숙기(GEO)를 이용한 증숙 더덕(GEO 1,3,5,7,9) 총 6가지에 대한 성분 변화를 확인하기 위하여 HPLC 및 LC-MS/MS 분석을 실시하였다. 분석한 결과, peak의 변화량을 보았을 때 빨간 화살표로 표시한 부분에서 증숙단계가 증가할수록 함량이 증가하는 것을 확인할 수가 있었다(도 6).
증가하는 peak를 LC-MS/MS 분석을 통해서 분석한 결과, 2개의 피크로 분리되었고, 1번 피크는 피로갈롤(pyrogallol)이라는 물질이라는 것을 확인할 수 있었다(도 7). 그리고, 2번 피크해 해당하는 화합물은 델타-트리데칼락톤(Delta-tridecalactone)이라는 것을 확인하였다(도 8).
상기 Delta-tridecalactone은 암세포의 invasion 저해효과(Tanaka et al., 2007) 및 향신료로써의 기능이 있다고 알려져 있으며, pyrogallol은 인간 폐암세포(HAN et al., 2008) 및 박테리아 성장을 저해(Tinh et al., 2016)하는 것으로 보고되어 있다. 결과적으로 증숙 공정이 진행됨에 따라서 이러한 기능성 물질들이 증가되고, 증숙 더덕의 생리활성에 영향을 미치고 있음을 알 수 있었다.
이러한 화합물이 증숙더덕에서 증가한다는 것은 본 발명에서 처음으로 밝혀낸 것으로, 이들 화합물이 증숙 더덕의 기능성에 크게 기여할 것으로 사료된다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (9)
- 더덕을 100 내지 140℃에서 10 내지 100분 동안 0.05~0.10Mpa 압력에서 증숙하는 단계;
상기 증숙된 더덕을 50 내지 70℃에서 20 내지 30시간 건조하는 단계; 및
상기 건조한 더덕을 분쇄하고 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 가하여 50 내지 70℃에서 20 내지 30시간 추출하는 단계를 포함하는, 항산화 활성, 생리활성물질의 함량이 증가되고, 지방간 억제능이 개선된 더덕 추출물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생리활성물질은 총 폴리페놀, 총 폴라보노이드, 피로갈롤(pyrogallol) 및 델타-트리데칼락톤(Delta-tridecalactone)에서 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 더덕 추출물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 증숙과 건조사이에, 120 내지 140℃에서 50 내지 70분 동안 0.005 내지 0.02Mpa 압력으로 진공을 걸어주는 단계를 더 포함하는 것인 더덕 추출물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
더덕을 증숙하고 건조하는 단계는 4~9회 반복 수행하는 것을 특징으로 하는 더덕 추출물의 제조방법.
- 제1항의 방법으로 제조된, 항산화 활성, 총 폴리페놀, 총 폴라보노이드, 피로갈롤(pyrogallol) 및 델타-트리데칼락톤(Delta-tridecalactone)에서 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 생리활성물질의 함량이 증가되고, 지방간 억제능이 개선된 더덕 추출물.
- 제5항의 더덕 추출물을 포함하는, 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제5항의 더덕 추출물을 포함하는, 비알코올성 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제5항의 더덕 추출물을 포함하는, 항산화용 식품 조성물.
- 제5항의 더덕 추출물을 포함하는, 항산화용 화장료 조성물.
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| US20200017997A1 (en) * | 2018-07-10 | 2020-01-16 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Graphene-Based Fiber and Graphene-Based Carbon Fiber and Method of Manufacturing the Same |
| KR20200114061A (ko) | 2019-03-27 | 2020-10-07 | 고려대학교 산학협력단 | 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는, 고혈압 전단계 대상자의 고감도 c반응성 단백질 수준 감소용 조성물 |
-
2018
- 2018-01-10 KR KR1020180003496A patent/KR20180082362A/ko not_active Application Discontinuation
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