CN101468949B

CN101468949B - 北青龙衣中的抗肿瘤化合物及其含量测定方法和应用

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Publication number: CN101468949B
Application number: CN200710144962A
Authority: CN
Inventors: 刘丽娟; 李巍
Original assignee: Heilongjiang University
Current assignee: Heilongjiang University
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2027-12-28
Also published as: CN101468949A

Abstract

北青龙衣中的抗肿瘤新化合物及其含量测定方法和应用。现有的方法中没有北青龙衣抗肿瘤有效成分的含量测定方法，因此不能更有效地控制药材和制剂的质量，不具有专属性、准确性和可靠性。本发明利用高效液相色谱法建立了以北青龙衣中的抗肿瘤新化合物为指标的含量测定方法。所述的新化合物的结构式为：采用HPLC法进行测定，本发明应用于医学领域。

Description

北青龙衣中的抗肿瘤化合物及其含量测定方法和应用

技术领域：

本发明涉及一种北青龙衣中的抗肿瘤新化合物及其含量测定方法。

背景技术：

癌症是威胁人类生命的严重疾病，因此，抗癌药物的研究一直是世界关注的热点。中药抗肿瘤在提高免疫力和降低致突变毒性方面比之化学药物具有独到之处，因此，从祖国医药宝库中寻找疗效确切的抗肿瘤中药，明确其药效物质基础，进而开发出高效低毒的新药，成为中医药领域多年研究的焦点。

北青龙衣为胡桃科植物核桃楸(Juglans Mandshurica MAXIM.)的未成熟果实，盛产于东北城郊各县，在民间常用作治疗各种癌症和皮肤病以及各种疼痛的止痛药。2001年北青龙衣被收载于黑龙江省药材标准而成为一种中药应用于临床和生产。北青龙衣的粗提物制剂治疗胃癌、食管癌等消化道癌症，有二十多年治疗观察的病例证明(李中原.青龙衣治疗食管贲门癌120例临床观察.中医药信息，1988，(3)：3)，其抗肿瘤作用是无庸置疑的。然而其药效物质基础研究并没有深入展开，文献报道多停留在其粗提物的药理作用而缺乏其有效成分的抗肿瘤作用研究上(季宇彬，马宏图，杨波，汲晨锋.北青龙衣不同提取部位的抗肿瘤作用研究.中草药，2004，35(10)：1145-1147)，因而导致北青龙衣这一药用资源开发的严重滞后。

现有的方法中没有北青龙衣抗肿瘤有效成分的含量测定方法，因此不能更有效地控制药材和制剂的质量，不具有专属性、准确性和可靠性。本发明利用高效液相色谱法建立了以北青龙衣中的抗肿瘤新化合物为指标的含量测定方法，为北青龙衣在抗肿瘤应用上提供了科学的保障。

发明内容：

本发明的目的是提供一种北青龙衣中的抗肿瘤新化合物及其含量测定方法和应用。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

北青龙衣中的抗肿瘤新化合物，命名为青龙衣素A，所述的新化合物的结构式为：

所述的北青龙衣中抗肿瘤新化合物的含量测定方法，采用HPLC法测定，取青龙衣素A对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液，取过三号筛的北青龙衣粉末1g，精密称定，加50％甲醇超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

所述的一种北青龙衣中的抗肿瘤新化合物的含量测定方法，采用HPLC法测定，是指色谱条件为采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，流动相为0.25％冰醋酸(V/V)与甲醇的体积比为25∶75，检测波长为350nm，柱温为30℃，理论板数按青龙衣素A峰计算不低于3000。

所述的北青龙衣中的抗肿瘤新化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

这个技术方案有以下有益效果：

1.我们在针对北青龙衣抗肿瘤有效成分的研究中，经过提取、分离纯化与细胞活性检测相结合的方法，最终获得了具有抗肿瘤活性的一个新的化合物，命名为青龙衣素A(qinglongyitin A)，并采用质谱与高分辨核磁共振技术，确定了该化合物的结构。

本发明提供了一种未报道过的具有抗肿瘤作用的化合物，通过对癌细胞抑制试验和药效学试验，证明了该化合物具有优良的抗癌活性，可与药物赋形剂制成适合于临床使用的抗肿瘤药物。该化合物对人HL-60白血病细胞，人Kato-III胃癌细胞和人A₅₄₉肺癌细胞具有显著的抑制作用，裸鼠移植瘤模型研究也证明了该化合物对肝癌细胞H22生长有明显的抑制作用，并可明显延长小鼠生存时间，具有良好的抗肿瘤作用。

2.中药及其制剂质量的稳定和可控一直是中药现代化的瓶颈，该化合物为中药北青龙衣的有效成分之一，可以作为北青龙衣药材及其制剂质量控制的指标，在此基础上建立以该成分为指标的鉴别和含量测定项目的质量控制标准，实现北青龙衣药材及其制剂质量的稳定和可控，该化合物将作为中药对照品广泛使用。

3.本发明建立的以该化合物为指标的含量测定方法能有效地控制北青龙衣药材的质量，比现有的质量标准更具专属性、准确性和可靠性。该化合物具有优良的抗癌活性，以该新化合物为指标，采用高效液相色谱法建立的含量测定方法，简便易行，重现性好，能更有效地控制药材和制剂的质量，具有专属性、准确性和可靠性。

附图说明：

附图1是本发明化合物(I)的¹H-¹H COSY谱中观察到的结构图。

附图2是本发明化合物(I)的HMBC谱中观察到的结构图。

附图3是青龙衣素A含量测定的标准曲线。

本发明的具体实施方式：

实施例1：

实施例2：

北青龙衣中的抗肿瘤新化合物的含量测定方法，采用HPLC法测定，色谱条件为采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，流动相为0.25％冰醋酸(V/V)与甲醇的体积比为25∶75，检测波长为350nm，柱温为30℃，理论板数按青龙衣素A峰计算不低于3000，取青龙衣素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液，取过三号筛的北青龙衣粉末1g，精密称定，加50％甲醇超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例3：

北青龙衣中的抗肿瘤新化合物的制备

材料来源北青龙衣为胡桃科植物核桃楸(Juglans MandshuricaMAXIM.)的未成熟果实，于7月中旬采于黑龙江省五常县，植物标本样本收藏于黑龙江省药品检验所中药标本馆。

提取和分离将新鲜的北青龙衣用75％乙醇浸泡一周，共提取三次，合并提取液，减压浓缩，浓缩至相对密度1.10-1.14(50℃)的浓缩液，浓缩液加10倍量水分散，离心，取上清液，注入已处理好的Diaion HP-20大孔吸附树脂中(浓缩液与树脂的比例为1∶50)，流速10ml/min，分别以3倍柱床体积的水洗、5倍柱床体积的30％乙醇洗，收集30％乙醇洗脱液，洗脱液减压蒸干得到残渣，残渣用少量甲醇溶解，滤过，滤液注入葡聚糖凝胶LH-20柱上(色谱柱直径2cm，柱长2m，上样量为1g残渣/每次)，以甲醇洗脱，流速1.0ml/min，洗脱液在硅胶板上进行薄层层析，展开剂为氯仿-甲醇(84∶16)，合并Rf值为0.3的单一组分，用甲醇重结晶得该化合物，纯度为98％以上。

青龙衣素A的理化性质：

青龙衣素A为无定形粉末。IR(KBr)ν_max：3414，2924，2857，2372，1618，1456，1391，1263，1116，618。UV(MeOH)λ_max(logε)：209nm(3.52)，263nm(3.92)，344nm(4.41)。[α]_D ²⁵-21°(c＝0.1，MeOH)。 ¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)和¹³C-NMR(125MHz，CD₃0D)谱数据见表1。ESI-MS(positive)m/z 379.1[M+Na]；HR-FAB-MS(positive)m/z379.1002[M+Na](计算值C₁₉H₁₆O₇Na 379.1005)。

青龙衣素A的¹H-NMR谱中显示有五个芳香质子，在δ6.67(1H，dd， J＝8.2，1.1)，δ7.42(1H，dd，J＝8.2，7.8)，δ7.29(1H，dd，J＝7.8，1.1)为一套ABC偶合系统，δ6.53(1H，s)，δ7.06(1H，s)为一套对位氢取代的芳香系统，在高场区δ2.50(1H，dd，J＝12.4，4.2)，δ2.57(1H，dd，J＝12.4，1.8)为一个亚甲基和一个次甲基在δ3.15(1H，d，J＝4.2，1.8)邻位偶合，其余三个质子分别在δ3.31(1H，m)和δ2.68(2H，m)邻位偶合，这些在¹H-¹H COSY谱中得到确证(见附图1)。¹³C-NMR谱结合HMQC谱可知δ208.7为羰基碳，在δ48.9和δ36.7分别为一个亚甲基和一个次甲基，δ70.9为连有羟基的叔碳。HMBC谱中δ2.50(H-3)，δ2.57(H-3)的亚甲基与δ208.7(C-1)羰基相关，δ3.15(H-2)的次甲基与δ70.9(C-4)相关，可以推断分子中含有四氢萘酮结构。HMBC谱中δ6.67(H-5)与δ70.9(C-4)相关也证明了这一点，且表明四氢萘酮中的苯环为ABC偶合系统。另外一套芳香系统是连接在δ70.9(C-4)上，这在HMBC谱中可以观察到δ7.06(H-5’)与δ70.9(C-4)的相关峰。在HMBC谱中δ3.31(H-7’)与δ116.1(C-2’)相关，δ6.53(H-2’)与δ40.3(C-7’)相关，表明δ40.3(C-7’)和δ45.6(C-8’)连接在另一个苯环上。其中δ2.68(H-8’)和48.9(C-2)远程相关，δ3.31(H-7’)和δ208.7(C-1)远程相关，表明C-7’连接在C-2上，这可以通过δ3.31(H-7’)与δ36.7(C-3)，δ2.50(H-3)，δ2.57(H-3)与δ40.3(C-7’)的远程相关得到确证。从苯环上的取代基看，四氢萘酮上有两个羟基，分别位于C-4和C-8，另一个苯环上有两个邻位羟基，分子式中尚有两个氧原子，结合¹³C-NMR谱(δ176.9)数据，表明有一个羧基存在，它只能连接在C-8’上。因此，青龙衣素A的¹H-NMR和¹³C-NMR数据排布如表1。从HMBC谱(附图2)中，该化合物的结构得到了确证。

表1青龙衣素A的¹H-NMR和¹³C-NMR数据

No.	δ_H	δ_c
			1		208.7

[0038]

2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 7′ 8′ 9′

3.15 dd(4.2，1.8) 2.50 dd(12.4，4.2) 2.57 dd(12.4，1.8) 6.67 dd(8.2，1.1) 7.42 dd(8.2，7.8) 7.29 dd(7.8，1.1) 6.53s 7.06s 3.31m 2.68(2H，m)

48.9 36.7 70.9 116.5 138.3 114.0 163.8 115.3 155.7 128.2 116.1 146.2 145.7 113.1 135.7 40.3 45.6 176.9

实施例4：

所述的北青龙衣中的抗肿瘤新化合物在抗肿瘤药物中的用途。

青龙衣素A抑制人HL-60白血病细胞，人Kato-III胃癌细胞和人A₅₄₉肺癌细胞的活性实验：

细胞培养：人HL-60白血病细胞，人Kato-III胃癌细胞和人A₅₄₉ 肺癌细胞培养于RPMI 1640培养基，补加10％FBS、L-glutamine、100U/ml青霉素以及100μg/ml链霉素。取对数生长期的细胞计数，以3×10⁴个/ml的浓度接种于96孔板，每孔180μl，在37℃、5％CO₂的孵箱中培养24小时。

细胞毒测定：不同浓度(1-100μM)的药物以EtOH-H₂O(1∶9)为溶剂溶解至20μl，空白组加入20μl的EtOH-H₂O(1∶9)溶液，细胞继续培养72小时，然后采用MTT法进行测定，即培养后的细胞，加入10μl MTT(5mg/ml)磷酸盐缓冲液，37℃、5％CO₂培养箱中培养4小时，离心，取上清液150μl弃去，加入175μl DMSO，振摇10 分钟后，用酶标仪在550nm测定吸光值。根据下面的公式计算，绘图得IC₅₀。

对照孔：仅加细胞不加药物

空白孔：仅加溶剂不加细胞和药物

实验孔：加细胞再加药物

试验结果

见表2。结果表明，青龙衣素A对三种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用。

表2.青龙衣素A抑制三种肿瘤细胞的IC₅₀(μM)值

样品	HL-60	KATO III	A₅₄₉
				CDDP 青龙衣素A	0.3±0.06 18.0±8.4	3.3±0.81 12.8±9.3	2.7±0.71 32.5±16.4

注：每个数值为三次独立实验的平均值±标准偏差

实施例5：

本发明建立的含量测定方法通过以下实验确定：

1.仪器与设备

Agilent 1100型高效液相色谱仪，四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器；YMC-Pack C18(4.6×150mm)色谱柱。

试剂：甲醇(色谱纯、Dikma公司)，冰醋酸(分析纯)，甲醇(分析纯)。

药材：青龙衣采于黑龙江省五常县，经加工制成。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：0.25％冰醋酸(V/V)∶甲醇(25∶75)；检测波长为350nm；柱温30℃。

3.线性范围的考察

精密量取浓度为1.20144mg/ml的对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，配制成浓度分别为0.060072mg/ml、0.120144mg/ml、0.180216mg/ml、0.240288mg/ml、0.360432mg/ml、0.480576mg/ml的对照品溶液。精密量取上述6种溶液各10μl进样，记录色谱图，测定其峰面积，结果见表3。并以峰面积值(A)对进样量(C)进行回归得标准曲线方程。并以峰面积值(A)对进样量(C)作图，得一直线。

表3青龙衣素A对照品测定结果

进样量(mg)	0.00060072	0.00120144	0.00180216	0.00240288	0.00360432	0.00480576
							峰面积值	380.90	722.95	1094.00	1441.05	2252.00	2939.60

A＝615917.8C-8.22647，r＝0.9997

附图3的结果表明，在0.60072～4.80576μg范围内，对照品峰面积值与进样量有良好的线性关系。

4.供试品溶液的制备：采用了30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇和甲醇等不同溶剂提取的方法。结果50％甲醇提取的青龙衣素A含量最多且杂质较少，故采用50％甲醇为样品供试液的提取溶剂。

表4不同提取溶剂的考察

提取溶剂	30％甲醇	50％甲醇	70％甲醇	甲醇
					青龙衣素A含量(％)	0.421	1.093	1.089	0.662

5.精密度试验：精密吸取对照品溶液(0.20024mg/ml)10μl，重复进样5次，青龙衣素A峰面积值的RSD＜3％，结果见表5，表明精密度良好。

表5精密度试验结果

试验次数	对照品峰面积	X	RSD(％)
				1 2 3 4	1206.2 1203.4 1201.6 1196.4	1200.8	0.4

[0072]

5

1196.4

6.稳定性试验：取样品供试液分别于0小时、2小时、4小时、8小时、16小时进样10μl，测得样品中青龙衣素A峰面积值的RSD小于3％，结果见表6，表明样品供试液在16小时内稳定性良好。

表6稳定性试验结果

测定时间(小时)	峰面积值	X	RSD(％)
				0 2 4 8 16	1643.8 1604.3 1623.7 1592.5 1575.1	1607.9	1.7

7.重现性试验：按含量测定方法，取同一次采集的样品分别制备5份样品供试液，测得峰面积值并计算含量，RSD小于3％，结果见表7，表明重现性良好。

表7重现性试验结果(n＝2)

试验号	峰面积值	含量(％)	X(％)	RSD(％)
					1 2 3 4 5	1608 1644 1634 1607 1659	1.22192 1.24926 1.24166 1.22116 1.26066	1.246	1.43

8.回收率试验：取6份已知含量的样品各约0.5g，分别加入浓度为0.20024mg/ml的对照品溶液3.4ml(100％)、4.1ml(120％)，按发明中样品制备方法和色谱条件，制备加样回收供试品溶液并注入高效液相色谱仪，以下列公式计算回收率，结果见表8。

表8回收率试验结果

试验号	供试品取样量 (g)	供试品含量 (mg)	对照品加入量(mg)	实际测得量(mg)	回收率 (％)	平均回收率(％)	RSD (％)
								1 2 3 4	0.5 0.5 0.5 0.5	0.683 0.683 0.683 0.683	0.6808(100％)0.6808(100％)0.6808(100％)0.8210(120％)	1.3223711.3890731.3098641.472451	93.91467 103.7123 92.07762 96.15725	96.3	4.1

[0083]

5 6

0.50.5

0.683 0.683

0.8210(120％) 0.8210(120％)

1.459944 1.481623

94.63391 97.27437

试验结果表明：回收率在95％～105％之间，加样回收良好。

Claims

1.一种北青龙衣中的抗肿瘤化合物，命名为青龙衣素A，其特征是：所述的化合物的结构式为：

。

2.一种北青龙衣中权利要求1所述的抗肿瘤化合物的含量测定方法，其特征是：采用HPLC法测定，取青龙衣素A对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液，取过三号筛的北青龙衣粉末1g，精密称定，加50％甲醇超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液,分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得; 采用HPLC法测定，是指色谱条件为采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，流动相为0.25%（V/V）冰醋酸与甲醇的体积比为25：75，检测波长为350nm，柱温为摄氏30度，理论板数按青龙衣素A峰计算不低于3000。

3.一种权利要求1所述的北青龙衣中的抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。