CN110346462A - 辣木叶uplc指纹图谱建立方法及其uplc指纹图谱 - Google Patents

辣木叶uplc指纹图谱建立方法及其uplc指纹图谱 Download PDF

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Abstract

本发明公开了辣木叶UPLC指纹图谱的建立方法及其UPLC指纹图谱，所建立的方法包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备；(2)供试样品溶液的制备；(3)超高效液相色谱法测定条件的建立及测定。上述辣木叶UPLC指纹图谱的建立方法专属性强、操作简便、方法学考察试验证明其具有良好的稳定性、重复性和精密度，可较全面的检测辣木叶中的主要成分，为药材质量控制提供科学参考。

Description

辣木叶UPLC指纹图谱建立方法及其UPLC指纹图谱
技术领域
本发明涉及一种辣木叶的质量检测方法，特别是涉及辣木叶UPLC指纹图谱的建立及其 UPLC指纹图谱。
背景技术
辣木叶为辣木科植物辣木(Moringaoleifera Lam.)的干燥叶，生长在非洲东部及印度北部，较常食用的品种有印度传统辣木、印度改良种辣木和非洲辣木。我国于20世纪60年代初开始引种，目前在云南、广东、广西、海南、福建和台湾等地均有种植。辣木的叶子含有丰富的营养成分，含钙量是牛奶的4倍，还含有很高的钾、铁、锌等微量元素和矿物质等，是一种含全营养素的功能食品，在2012年8月被批准为新资源食品。辣木叶中的化学成分有黄酮及其苷、酚类及其苷、木脂素类、核苷和有机酸类成分(孙一蕊等.中国药房，2012，23(31)：2965-2968.)辣木叶民间常用其治疗糖尿病、高血压、便秘等病症。文献报道辣木叶具有降血糖、降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化、保肝、神经系统保护、抗氧化等多种药理作用(许敏等.食品科学，2016，37(23)：291-301)。其中黄酮类化合物为主要成分。
近年来，市场上出现了许多辣木叶产品，但多为粗加工产品，附加值低，质量参差不齐，无适当的质量控制方法，因此，对辣木叶中的特征成分或主要成分进行质量控制迫在眉睫。金玲等人(金玲等.中国实验方剂学杂志，2017，23(8)：86-91)采用HPLC法测定5个不同产地 12批辣木叶的指纹图谱，建立了辣木叶HPLC指纹图谱共有模式，标定14个共有峰，指认了三个成分峰，分别为没食子酸、芦丁和槲皮苷。被指认的三个成分峰为植物中常见的化合物，并不是辣木叶的特征性成分或主要成分，在辣木叶的鉴别和质量控制方面有一定局限性。因此，有必要建立一种快速、可以全面反映辣木叶内在质量的指纹图谱方法及其指纹图谱。
超高效液相色谱(UPLC)技术已经成为一种常规的分析方法，是在传统HPLC系统基础上开发的，充分利用了小粒度色谱柱的优势，配备了超高压液相色谱泵和高速、灵敏的检测器，使色谱的分离度、速度和灵敏度均达到了新的高度，极大的缩短了分析时间，改善了色谱峰型，在很大程度上促进了中药及天然药物质量控制领域的发展。采用超高效液相色谱法建立辣木叶的指纹图谱，可为辣木叶的质量控制提供有效的方法。
发明内容
本发明提供了一种辣木叶UPLC指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，通过对辣木叶UPLC 指纹图谱的研究，得到一种比较好的辣木叶质量控制方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取腺苷、L-苯丙氨酸、5-咖啡酰奎宁酸、L-色氨酸、4-咖啡酰奎宁酸、维采宁-2、牡荆素、异牡荆素、异槲皮素、槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷和山奈酚 -3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷，分别加入甲醇溶液稀释配制成浓度为0.05～1.0mg/mL的溶液，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
(2)供试品溶液的制备
精确称取辣木叶细粉，加入一定比例的溶剂，提取方法采用加热回流或者超声提取，放至室温，补足重量。静置，取上清液，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
(3)色谱条件及系统适用性试验
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
检测波长：205-280nm
流速：0.3-0.5mL/min
柱温：30-45℃
进样量：0.5-5.0μL
a流动相：流动相A为三氟乙酸体积百分比为0.005％-0.02％的水溶液或者为甲酸体积百分比为0.05％-0.2％的水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
0分钟时，流动相A的体积百分比为95％，流动相B体积百分比为5％；
10分钟时，流动相A的体积百分比为87％，流动相B体积百分比为13％；
20分钟时，流动相A的体积百分比为82％，流动相B体积百分比为18％；
25分钟时，流动相A的体积百分比为70％，流动相B体积百分比为30％；
b流动相：流动相A为三氟乙酸体积百分比为0.005％-0.02％的水溶液或者为甲酸体积百分比为0.05％-0.2％的水溶液。流动相B为甲醇，梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
0分钟时，流动相A的体积百分比为95％，流动相B体积百分比为5％；
12分钟时，流动相A的体积百分比为82％，流动相B体积百分比为18％；
14分钟时，流动相A的体积百分比为70％，流动相B体积百分比为30％；
30分钟时，流动相A的体积百分比为67％，流动相B体积百分比为33％；
(4)测定：将步骤(2)的供试品溶液照超高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
(5)进一步的，步骤(3)中所述色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18 RRHD柱，规格为2.1×100 mm，1.8～2.1μm；Agilent Eclipse XDB C18柱，规格为3.0×100mm，1.8～2.1μm；Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱，规格为2.1×100mm，1.8～2.1μm。
上述辣木叶UPLC指纹图谱建立方法得到的指纹图谱中有15个特征共有峰，其中10号峰被选为参照峰；
a当选用乙腈-0.01％三氟乙酸水为流动相时，数据采集时间为25分钟，具体如下：
1号峰为腺苷，保留时间为1.237分钟，峰面积为200568；
2号峰为L-苯丙氨酸，保留时间为2.034分钟，峰面积为318903；
3号峰为5-咖啡酰奎宁酸，保留时间为3.281分钟，峰面积为202142；
4号峰为L-色氨酸，保留时间为3.874分钟，峰面积为246032；
5号峰所对应的成分有待确认，保留时间为5.880分钟，峰面积为176491；
6号峰为4-咖啡酰奎宁酸，保留时间为6.290分钟，峰面积为175833；
7号峰为维采宁-2，保留时间为10.228分钟，峰面积为260836；
8号峰为牡荆素，保留时间为14.663分钟，峰面积为69981；
9号峰为异牡荆素，保留时间为15.055分钟，峰面积为108018；
10号峰为异槲皮素，保留时间为15.623分钟，峰面积为1091375；
11号峰为槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷，保留时间为17.184分钟，峰面积为374728；
12号峰所对应的成分有待确认，保留时间为18.178分钟，峰面积为34760；
13号峰为紫云英苷，保留时间为18.930分钟，峰面积为219008；
14号峰所对应的成分有待确认，保留时间为20.104分钟，峰面积为45417；
15号峰为山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷，保留时间为21.360分钟，峰面积为105530。
b当选用甲醇-0.01％三氟乙酸水为流动相时，数据采集时间为30分钟，具体如下：
1号峰为腺苷，保留时间为1.887分钟，峰面积为203680；
2号峰为L-苯丙氨酸，保留时间为3.461分钟，峰面积为302700；
3号峰为5-咖啡酰奎宁酸，保留时间为5.419分钟，峰面积为193354；
4号峰为L-色氨酸，保留时间为6.309分钟，峰面积为195124；
5号峰所对应的成分有待确认，保留时间为8.484分钟，峰面积为167438；
6号峰为4-咖啡酰奎宁酸，保留时间为10.492分钟，峰面积为164862；
7号峰为维采宁-2，保留时间为15.449分钟，峰面积为246648；
8号峰为牡荆素，保留时间为17.659分钟，峰面积为67844；
9号峰为异牡荆素，保留时间为18.929分钟，峰面积为99317；
10号峰为异槲皮素，保留时间为19.553分钟，峰面积为1101695；
11号峰为槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷，保留时间为20.609分钟，峰面积为353623；
12号峰所对应的成分有待确认，保留时间为21.975分钟，峰面积为33612；
13号峰为紫云英苷，保留时间为23.729分钟，峰面积为208765；
14号峰所对应的成分有待确认，保留时间为25.339分钟，峰面积为43312；
15号峰为山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷，保留时间为26.327分钟，峰面积为103435。
本发明是在对辣木叶的化学成分进行系统研究，并通过高效液相色谱法、质谱法和核磁共振等方法鉴定了辣木叶主要色谱峰结构的基础上，提供了一种可指认辣木叶多指标成分 UPLC指纹图谱的构建方法。所述UPLC指纹图谱建立的方法操作简便、快速，可全面检测辣木叶中多种主要成分，从而更全面的监控辣木叶、辣木叶茶及辣木叶制剂的质量。
附图说明
图1为实施例1中腺苷的HRESI-MS图
图2为实施例1中腺苷的核磁共振氢谱图
图3为实施例1中腺苷的DEPT图和核磁共振碳谱图
图4为实施例1中L-苯丙氨酸的HRESI-MS图
图5为实施例1中L-苯丙氨酸的核磁共振氢谱图
图6为实施例1中L-苯丙氨酸的DEPT图和核磁共振碳谱图
图7为实施例1中5-咖啡酰奎宁酸的HRESI-MS图
图8为实施例1中5-咖啡酰奎宁酸的核磁共振氢谱图
图9为实施例1中5-咖啡酰奎宁酸的DEPT图和核磁共振碳谱图
图10为实施例1中L-色氨酸的HRESI-MS图
图11为实施例1中L-色氨酸的核磁共振氢谱图
图12为实施例1中L-色氨酸的DEPT图和核磁共振碳谱图
图13为实施例1中4-咖啡酰奎宁酸的HRESI-MS图
图14为实施例1中4-咖啡酰奎宁酸的核磁共振氢谱图
图15为实施例1中4-咖啡酰奎宁酸的DEPT图和核磁共振碳谱图
图16为实施例1中维采宁-2的HRESI-MS图
图17为实施例1中维采宁-2的核磁共振氢谱图
图18为实施例1中维采宁-2的DEPT图和核磁共振碳谱图
图19为实施例1中牡荆素的HRESI-MS图
图20为实施例1中牡荆素的核磁共振氢谱图
图21为实施例1中牡荆素的DEPT图和核磁共振碳谱图
图22为实施例1中异牡荆素的HRESI-MS图
图23为实施例1中异牡荆素的核磁共振氢谱图
图24为实施例1中异牡荆素的DEPT图和核磁共振碳谱图
图25为实施例1中异槲皮素的HRESI-MS图
图26为实施例1中异槲皮素的核磁共振氢谱图
图27为实施例1中异槲皮素的DEPT图和核磁共振碳谱图
图28为实施例1中槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷的HRESI-MS图
图29为实施例1中槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷的核磁共振氢谱图
图30为实施例1中槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷的DEPT图和核磁共振碳谱图
图31为实施例1中紫云英苷的HRESI-MS图
图32为实施例1中紫云英苷的核磁共振氢谱图
图33为实施例1中紫云英苷的DEPT图和核磁共振碳谱图
图34为实施例1中山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷的HRESI-MS图
图35为实施例1中山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷的核磁共振氢谱图
图36为实施例1中山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷的DEPT图和核磁共振碳谱图
图37为辣木叶供试品溶液和对照品溶液的UPLC图谱叠加图
图38为11批辣木叶的UPLC指纹图谱
图39为可化学指认的辣木叶UPLC指纹图谱
图40为辣木叶的UPLC标准指纹图谱
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1辣木叶主要化学成分的分离、纯化以及结构鉴定
干燥辣木叶32.8kg粉碎成粗粉，于室温下用95％乙醇冷浸提取3次，每次5倍量溶剂浸泡24小时，过滤，合并提取液，减压回收溶剂至无醇味，得总浸膏约7.9kg。将所得浸膏加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，各部分萃取液分别减压回收溶剂，得到石油醚部位(4.3kg)，乙酸乙酯部位(1.05kg)和水部位。乙酸乙酯部位(1.05kg)经硅胶(100-200目)柱层析，石油醚-乙酸乙酯(100∶0→9∶1→8∶2，v/v)、氯仿-甲醇 (100∶0→95∶5→85∶5→7∶3→0∶100，v/v)梯度洗脱，经薄层色谱检识(TLC)，合并相同流分，得到11个主流分(Fr.A-Fr.K)。Fr.K馏分进行ODS柱层析，甲醇-水(35∶65→30∶70→50∶50，V/V) 梯度洗脱，经薄层色谱检识合并相同馏分，得到四个部分，标记为Fr.I-1～Fr.I-4。Fr.I-2经过2 次SephadexLH20(甲醇-水)柱层析及制备型HPLC(乙腈-水)分离，得到化合物7(20mg)、化合物8(22mg)、化合物9(100mg)和化合物11(30mg)。
将Fr.K进行经硅胶(100-200目)柱层析，用氯仿-甲醇 (100∶0→90∶10→8∶2→7∶3→6∶4→0∶100，v/v)梯度洗脱，经薄层色谱检识合并相同馏分，得到 9个流分，标记为Fr.K-1～Fr.K-9，Fr.K-8经ODS柱层析，甲醇-水(10∶90→15∶85→20∶80→30∶70， V/V)梯度洗脱，再经2次Sephadex LH-20(甲醇-水)和制备型HPLC(甲醇-0.1％甲酸水) 等色谱方法分离纯化，得到化合物6(32mg)、化合物10(35mg)和化合物12(35mg)。
水部位经AB-8型大孔树脂洗脱，乙醇水(20∶80→40∶60V/V)梯度洗脱得到2个主流分 (Fr.1～Fr.3)，Fr.3经ODS柱层析，甲醇-水(5∶95→10∶90→15∶90→20∶80→30∶70V/V)梯度洗脱、再经3次Sephadex LH-20和制备型HPLC(甲醇-0.1％甲酸水)分离，得到化合物1(200mg)，化合物2(28mg)，化合物3(22mg)，化合物4(26mg)，化合物5(30mg)。
本发明分离得到的12个化合物，利用HR-ESI-MS、NMR等方法鉴定其结构，分别为腺苷、L-苯丙氨酸、5-咖啡酰奎宁酸、L-色氨酸、4-咖啡酰奎宁酸、维采宁-2、牡荆素、异牡荆素、异槲皮素、槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷，紫云英苷和山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷；12个化合物的光谱和理化数据如下：
腺苷：白色粉末(甲醇)，其化学结构式为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z268.1045[M+H]+(计算值C10H14N5O4，268.1040)，提示该化合物的分子式为C11H13N5O4。腺苷的HRESI-MS图如图1所示。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δH：8.28(1H，s，H-8)，8.07(1H，s，H-2)，7.28(2H，br s，-NH2)， 5.81(1H，d，J＝6.4Hz，H-1＇)，5.39(1H，d，J＝6.2Hz，OH-2′)，5.36(1H，dd，J＝7.1，4.4Hz，OH-3′)， 5.13(1H，d，J＝4.6Hz，OH-5′)，4.55(1H，m，H-2′)，4.08(1H，m，H-3＇)，3.90(1H，m，H-4′)，3.61(1H， m，H-5′a)，3.49(1H，m，H-5′b)。腺苷的核磁共振氢谱图如图2所示。13C-NMR(DMSO-d6， 100MHz)δc：156.2(C-6)，152.5(C-2)，149.1(C-4)，140.0(C-8)，119.4(C-5)，88.0(C-1＇)，86.0(C-4＇)， 73.5(C-2′)，70.7(C-3＇)，61.8(C-5′)。腺苷的核磁共振碳谱图如图3所示。以上数据与文献报道 (李锋华等.中国中药杂志，2018，43(1)：115-118)的腺苷一致，故鉴定为腺苷。
L-苯丙氨酸：白色粉末(甲醇)，其化学结构式为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MSm/z 166.0861[M+H]+(计算值C9H12NO2，166.0863)，提示该化合物的分子式为 C9H11NO2。L-苯丙氨酸的HRESI-MS图如图4所示。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δH：7.28(2H，d，J＝7.5Hz，H-5，9)，7.26(2H，t，J＝7.5Hz，H-6，8)， 7.23(1H，t，H-7)，4.06(1H，t，J＝6.4Hz，H-2)，3.09(2H，m，H-3)。L-苯丙氨酸的核磁共振氢谱图如图5所示。13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)δC：170.6(C-1)，135.4(C-4)，129.6(C-5，9)，128.6(C-6，8)， 127.2(C-7)，53.7(C-2)，36.1(C-3)。L-苯丙氨酸的核磁共振碳谱图如图6所示。以上数据与文献报道(熊山等.现代药物与临床，2009，24(01)：34-36)的苯丙氨酸一致，故鉴定为苯丙氨酸。
5-咖啡酰奎宁酸：白色粉末(甲醇)，其结构式为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z353.0879[M-H]-(计算值C16H17O9，353.0878)，提示该化合物的分子式为 C16H18O9。5-咖啡酰奎宁酸的HRESI-MS图如图7所示。
1H-NMR(CD3OD，400MHz)δH：7.61(1H，d，J＝15.9Hz，H-7′)，7.06(1H，d，J＝1.9Hz，H-2′)，6.96(1H，dd，J＝8.2，1.9Hz，H-6′)，6.79(1H，d，J＝8.2Hz，H-5′)，6.33(1H，d，J＝15.9Hz，H-8′)， 5.37(1H，m，H-5)，4.17(1H，td，J＝9.4，4.2Hz，H-3)，3.66(1H，dd，J＝8.5，3.3Hz，H-4)，2.35-1.74(4H，m， H-2，6)。5-咖啡酰奎宁酸的核磁共振氢谱图如图8所示。13C-NMR(100MHz，CD3OD)δC：178.3(C-7)，169.1(C-9＇)，149.4(C-4＇)，146.8(C-3＇，7′)，128.0(C-1＇)，122.9(C-6＇)，116.5(C-5＇)， 115.9(C-8′)，115.1(C-2＇)，75.4(C-1)，74.8(C-4)，73.0(C-3)，68.3(C-5)，41.5(C-6)，36.7(C-2)。 5-咖啡酰奎宁酸的核磁共振碳谱图如图9所示。以上数据与文献报道(刘珊珊等.中国实验方剂学杂志，2016，22(08)：58-64)的5-咖啡酰奎宁酸一致，故鉴定为5-咖啡酰奎宁酸。
L-色氨酸：淡黄色粉末(甲醇)，其结构式为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z205.0973[M+H]+(计算值C11H13N2O2，205.0972)，提示该化合物的分子式为C11H12N2O2。L-色氨酸的HRESI-MS图如图10所示。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δH：11.01(1H，s，NH)，7.57(1H，d，J＝1.7Hz，H-4)，7.36(1H，d， J＝3.1Hz，H-7)，7.22(1H，s，H-2)，7.08(1H，s，H-6)，6.99(1H，s，H-5)，3.41(3H，m，H-10，11)。L- 色氨酸的核磁共振氢谱图如图11所示。13C-NMR(125MHz，DMSO-d6)δC：170.9(C-12)， 136.3(C-8)，127.1(C-9)，124.6(C-5)，121.1(C-4)，118.5(C-2)，118.3(C-6)，111.5(C-3)，107.8(C-7)， 53.5(C-11)，26.5(C-10)。L-色氨酸的核磁共振碳谱图如图12所示。以上数据与文献报道(熊山等.现代药物与临床，2009，24(01)：34-36)的L-色氨酸一致，故鉴定为L-色氨酸。
4-咖啡酰奎宁酸：白色粉末(甲醇)，其化学结构式为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z353.0873[M-H]-(计算值C16H17O9，353.0878)，提示该化合物的分子式为 C16H18O9。4-咖啡酰奎宁酸的HRESI-MS图如图13所示。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δH：9.56(1H，s，COOH-7)，9.15(1H，s，OH-1)，7.50(1H，d，J＝15.9Hz，H-7′)，7.04(1H，br s，H-2′)，7.00(1H，d，J＝1.8Hz，H-6′)，6.77(1H，d，J＝8.1Hz，H-5′)， 6.28(1H，d，J＝15.9Hz，H-8′)，4.88(1H，m，H-5)，4.66(1H，m，H-3)，4.08(1H，m，H-4)，2.07-1.79(4H， m，H-2，6)。4-咖啡酰奎宁酸的核磁共振氢谱图如图14所示。13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)δC： 175.2(C-7)，166.3(C-9＇)，148.3(C-4＇)，145.6(C-3＇)，144.8(C-7＇)，125.6(C-1＇)，121.2(C-6′)，115.8(C-5＇)， 114.7(C-8＇)，114.6(C-2＇)，77.0(C-1)，74.1(C-5)，66.6(C-4)，63.8(C-3)，40.8(C-2)，37.6(C-6)。 4-咖啡酰奎宁酸的核磁共振碳谱图如图15所示。以上数据与文献报道(刘珊珊等.中国实验方剂学杂志，2016，22(08)：58-64)的4-咖啡酰奎宁酸一致，故鉴定为4-咖啡酰奎宁酸。
维采宁-2：淡黄色无定形粉末(甲醇)，其化学结构式为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z593.1511[M-H]-(计算值C27H29O15，593.1512)，提示该化合物的分子式为 C27H30O15。维采宁-2的HRESI-MS图如图16所示。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δH：13.69(1H，s，5-OH)，10.42(1H，d，J＝14.1Hz，4′-OH)，9.35(1H，s，7-OH)，8.01(2H，d，J＝8.8Hz，H-2′，6′)，6.91(2H，dd，J＝24.3，8.7Hz，H-3′，5＇)，6.80 (1H，s，H-3)，4.85(2H，m，H-1″，H-1″′)，3.15～3.87(10H，m，糖上质子)。维采宁-2的磁共振氢谱图如图17所示。13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)δC：182.4(C-4)，164.1(C-2)，161.3(C-4＇)，160.8(C-7)， 158.6(C-5)，155.1(C-9)，129.1(C-2＇，6＇)，121.5(C-1＇)，115.9(C-3′，5＇)，107.5(C-6)，105.3(C-8)， 103.9(C-10)，102.6(C-3)，82.0(C-5″′)，80.9(C-5″)，78.9(C-3″＇)，77.8(C-3″)，74.1(C-1″＇)，73.4(C-1″)， 72.0(C-2″′)，71.0(C-2″)，70.6(C-4″′)，69.0(C-4″)，61.3(C-6″′)，59.8(C-6″)。维采宁-2的核磁共振碳谱图如图18所示。以上数据与文献报道(夏鹏飞等.中国中药杂志，2009，34(20)：2604-2606) 的维采宁-2一致，故鉴定为维采宁-2。
牡荆素：淡黄色无定形粉末(甲醇)，其化学结构式为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z433.1125[M+H]+(计算值C21H21O10，433.1129)，提示该化合物的分子式为 C21H20O10。牡荆素的HRESI-MS图如图19所示。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δH：13.17(1H，s，OH-5)，8.03(2H，d，J＝8.7Hz，H-2′，H-6′)， 6.89(2H，d，J＝8.7Hz，H-3′，5＇)，6.78(1H，s，H-3)，6.28(1H，s，H-6)，4.69(1H，d，J＝9.9Hz，H-1″)，3.84(1H，t，J＝9.2Hz，H-2″)，3.77(1H，dd，J＝10.8，5.6Hz，Ha-6″)，3.53(1H，dt，J＝11.3，5.5Hz， Hb-6″)，3.26(3H，m，H-3″，4″，5″)。牡荆素的核磁共振氢谱图如图20所示。13C-NMR(DMSO-d6， 100MHz)δc：182.1(C-4)，164.0(C-2)，162.6(C-7)，161.1(C-4＇)，160.4(C-5)，156.0(C-9)，129.0(C-2＇， 6＇)，121.6(C-1＇)，115.8(C-3′，5＇)，104.6(C-8)，104.1(C-10)，102.5(C-3)，98.2(C-6)，81.9(C-5″)， 78.7(C-3″)，73.4(C-1″)，70.9(C-2″)，70.6(C-4″)，61.3(C-6″)。牡荆素的核磁共振碳谱图如图21 所示。以上数据与文献报道(纳智等.中国中药杂志，2009，34(18)：2338-2342)的牡荆素一致，故鉴定为牡荆素。
异牡荆素：黄色无定形粉末(甲醇)；其结构式为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z433.1128[M+H]+(计算值C21H21O10，433.1129)，提示该化合物的分子式为 C21H20O10。异牡荆素的HRESI-MS图如图22所示。
1H-NMR(CD3OD，400MHz)δH：7.81(2H，d，J＝7.9Hz，H-2′，H-6′)，6.93(2H，d，J＝8.7Hz，H-3′，5′)，6.57(1H，s，H-3)，6.48(1H，s，H-8)，4.93(1H，d，J＝9.9Hz，H-1″)，4.20(1H，t，J＝9.3Hz， H-2″)，3.92(1H，dd，J＝12.0，1.8Hz，Ha-6″)，3.78(1H，dd，J＝12.0，5.2Hz，Hb-6″)，3.34(3H，m， H-3″，4″，5″)。异牡荆素的核磁共振氢谱图如图23所示。13C-NMR(MeOD，100MHz)δC： 184.0(C-4)，166.1(C-2)，164.8(C-7)，162.7(C-4＇)，162.0(C-5)，158.7(C-9)，129.4(C-2＇，6＇)， 123.1(C-1＇)，117.0(C-3＇，5′)，109.1(C-6)，105.2(C-10)，103.8(C-3)，95.3(C-8)，82.6(C-5″)，80.1(C-3″)， 75.3(C-1″)，72.6(C-2″)，71.8(C-4″)，62.9(C-6″)。异牡荆素的核磁共振碳谱图如图24所示。以上数据与文献报道(李雨蔚等.中草药，2015，46(14)：2052-2056)的异牡荆素一致，故鉴定为异牡荆素。
异槲皮素：黄色无定形粉末(甲醇)，其化学结构式为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z487.0842[M+Na]+(计算值C21H20NaO12，487.0847)，提示该化合物的分子式为C21H20O12。异槲皮素的HRESI-MS图如图25所示。
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δH：12.64(1H，s，5-OH)，7.58(2H，dq，J＝4.0，2.2Hz，H-2′，6′)， 6.85(1H，d，J＝9.0Hz，H-5′)，6.41(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.20(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，5.46(1H，d，J＝7.4Hz，Glc-1″)，3.65-3.02(6H，m，H-2″，3″，4″，5″，6″)。异槲皮素的核磁共振氢谱图如图26所示。13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)δc：177.5(C-4)，164.2(C-2)，161.3(C-7)，156.4(C-5)，156.2(C-9)， 148.5(C-4′)，144.9(C-3＇)，133.4(C-3)，121.7(C-1＇)，121.2(C-6′)，116.2(C-5＇)，115.3(C-2＇)， 104.0(C-10)，100.9(C-1″)，98.7(C-6)，93.6(C-8)，77.6(C-5″)，76.5(C-3″)，74.1(C-2″)，70.0(C-4″)， 61.0(C-6″)。异槲皮素的核磁共振碳谱图如图27所示。以上数据与文献报道(夏鹏飞等冲国中药杂志，2009，34(20)：2604-2606)的异槲皮素一致，故鉴定为异槲皮素。
槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷：黄色粉末，其化学结构式为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z573.0856[M+Na]+(计算值C24H22NaO15，573.0851)，提示该化合物的分子式为C24H22O15。槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷的HRESI-MS图如图28所示。
1H-NMR(DMSO-d6，600MHz)δH：12.57(1H，s，5-OH)，7.49(2H，m，H-2′，6′)，6.83(1H，d，J＝ 8.3Hz，H-5′)，6.40(1H，s，H-8)，6.19(1H，s，H-6)，5.36(1H，s，H-1″)，4.17(1H，d，J＝11.1Hz，Ha-6″)， 3.97(1H，m，Hb-6″)，3.23(4H，m，H-2″，3″，4″，5″)，3.02(2H，s，Hmal-2)。槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷的核磁共振氢谱图如图29所示。13C-NMR(DMSO-d6，150MHz)δC：177.4(C-4)， 168.5(Cmal-3)，167.3(Cmal-1)，164.4(C-7)，161.2(C-5)，156.7(C-2)，156.4(C-9)，148.7(C-4＇)， 145.0(C-3′)，133.2(C-3)，121.5(C-1＇)，121.0(C-6′)，116.3(C-5＇)，115.2(C-2′)，103.9(C-10)， 101.1(C-1″)，98.8(C-6)，93.6(C-8)，76.2(C-3″)，74.0(C-5″)，74.0(C-2＇)，69.6(C-4″)，63.3(C-6″)， 42.2(Cmal-2)。槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷的核磁共振碳谱图如图30所示。以上数据与文献报道(Jaramillo，et al.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59(3)，975-983)的槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷一致，故鉴定为槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷。
紫云英苷：黄色无定形粉末(甲醇)，其化学结构式为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z471.0894[M+Na]+(计算值C21H20NaO11，471.0898)，提示该化合物的分子式为C21H20O11。紫云英苷的HRESI-MS图如图31所示。
1H-NMR(DMSO-d6，300MHz)δH：12.61(1H，s，OH-5)，8.04(2H，d，J＝8.8Hz，H-2′，6＇)，6.89(2H， d，J＝8.8Hz，H-3′，5＇)，6.44(1H，d，J＝1.8Hz，H-8)，6.22(1H，d，J＝1.8Hz，H-6)，5.46(1H，d，J＝7.2Hz， H-1″)，3.65-2.99(6H，m，H-2″，3″，4″，5″，6″)。紫云英苷的核磁共振氢谱图如图32所示。13C-NMR (DMSO-d6，75MHz)δC：177.6(C-4)，164.3(C-7)，161.3(C-5)，160.1(C-4＇)，156.5(C-9)，156.4(C-2)， 133.3(C-3)，131.0(C-2′，6′)，121.0(C-1＇)，115.2(C-3′，5′)，104.1(C-10)，101.0(C-1″)，98.8(C-6)， 93.8(C-8)，77.6(C-5″)，76.5(C-3″)，74.3(C-2″)，70.0(C-4″)，60.9(C-6″)。紫云英苷的核磁共振碳谱图如图33所示。以上数据与文献报道(刘安等.中国中药杂志，2009，34(07)：861-863)的紫云英苷一致，故鉴定为紫云英苷。
山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷：黄色粉末，其化学结构式为：
光谱数据如下：
HR-ESI-MS m/z557.0904[M+Na]+(计算值C24H22NaO14，557.0902)，提示该化合物的分子式为C24H22O14。山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷的HRESI-MS图如图34所示。
1H-NMR(DMSO-d6，600MHz)δH：7.97(2H，d，J＝8.6Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J＝8.6Hz，，H -3＇，5＇)，6.43(1H，s，H-8)，6.20(1H，s，H-6)，5.32(1H，d，J＝6.9Hz，H-1″)，4.12(1H，d，J＝11.1Hz， Ha-6″)，3.97(1H，dd，J＝11.3，5.1Hz，Hb-6″)，3.27-3.18(4H，m，H-2″，3″，4″，5″)，2.94(1H，s，Hmal -2)。山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷的核磁共振氢谱图如图35所示。13C-NMR(DM SO-d6，150MHz)δC：177.3(C-4)，169.3(Cmal-3)，168.1(Cmal-1)，165.1(C-7)，161.2(C-5)，160.3 (C-4＇)，156.7(C-9)，156.5(C-2)，133.2(C-3)，130.8(C-2＇，6＇)，120.6(C-1＇)，115.2(C-3′，5′)，103. 7(C-10)，101.6(C-1″)，99.1(C-6)，93.8(C-8)，76.2(C-3″)，74.1(C-2″)，74.1(C-5″)，69.7(C-4″)， 63.1(C-6″)，43.7(Cmal-2)。山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷的核磁共振碳谱图如图36 所示。以上数据与文献报道(李玉林等.急弯棘豆化学成分的研究，中草药，1998(03)：149-151) 的山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷一致，故鉴定为山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷。
实施例2：辣木叶UPLC指纹图谱的建立方法及其UPLC指纹图谱
(1)对照品溶液的制备
精密称取腺苷、L-苯丙氨酸、5-咖啡酰奎宁酸、L-色氨酸、4-咖啡酰奎宁酸、维采宁-2、牡荆素、异牡荆素、异槲皮素、槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷，紫云英苷和山奈酚 -3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷，分别加入甲醇溶液稀释配制成浓度为0.05～1.0mg/mL的溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得。
以上对照品除山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷纯度为90％外，其余对照品纯度均为98％以上。
(4)供试品溶液的制备
精确称取辣木叶细粉0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇50mL，称定重量，浸泡30 min，30℃下超声提取30min，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量。所得提取液静置，取上清液用微孔滤膜(0.22μm)过滤，取续滤液，即得。
(4)色谱条件和系统适应性
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD柱，规格为2.1×100mm，1.8μm；
检测波长：210nm；
流速：0.5mL/min；
柱温：35℃；
进样量：2μL
流动相：流动相A为体积百分比为0.01％的三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1所示：
表1辣木叶UPLC洗脱程序
(4)测定：将供试品溶液照超高效液相色谱法测定，得指纹图谱。
采用上述方法检测辣木叶，得到色谱图，再采用该色谱条件对各对照品溶液进行测定，对比供试品溶液和对照品溶液色谱峰的保留时间。同时，采用PDA检测器在210nm波长处进行在线检测，比较供试品溶液和各个对照品的紫外吸收。辣木叶供试品溶液和对照品溶液的UPLC图谱叠加图如图37所示。
将供试品溶液的色谱图采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》模拟生成辣木叶UPLC指纹图谱。所得指纹图谱包括了14个特征峰和1个参照峰(S，异槲皮素)，根据对照品和供试品溶液色谱图保留时间和分子量对照，可指认辣木叶UPLC指纹图谱中12个主要色谱峰，其保留时间和相对于参照峰的相对保留时间见表2。
表2辣木叶UPLC指纹图谱特征峰的保留时间和相对保留时间
本发明所检测的辣木叶样品为11批。11批辣木叶的来源如表3所示：
表3 11批辣木叶产地和批号信息
11批辣木叶按照步骤(2)制备供试品溶液，采用步骤(3)的色谱条件进行检测，所得的11批辣木叶的指纹图谱如图38所示。
分析所得11批辣木叶指纹图谱的检测数据，计算各特征峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积，结果如表4、5所示。
将11批辣木叶指纹图谱中各特征峰相对保留时间和相对峰面积的平均值，分别作为辣木叶UPLC标准指纹图谱各特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见表6。
表6辣木叶的UPLC标准指纹图谱数据
将11批辣木叶的UPLC的指纹图谱叠加，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件进行分析，采用中位数法，时间窗0.1，以10号峰为参照峰(S，异槲皮素)，经多点校正自动匹配后生成辣木叶的UPLC标准指纹图谱，确定了15个共有峰。通过对照品确定了12个可化学指认的共有峰所代表的化合物，即构建了可化学指认的辣木叶 UPLC指纹图谱，如图39所示。
实施例3辣木叶UPLC指纹图谱的测定方法
(1)供试品溶液的制备
精确称取辣木叶细粉0.5g，置圆底烧瓶中，加入75％甲醇水溶液50mL，加热回流提取30min，冷却至室温，取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
(2)色谱条件和系统适用性
色谱柱：Agilent Extend C18 RRHD柱，规格为2.1×150mm，1.8μm；
检测波长：220nm；
流速：0.5mL/min；
柱温：40℃；
进样量：2μL
流动相：流动相A为甲酸体积百分比为0.1％的水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，梯度洗脱程序同实施例2。
实施例4辣木叶UPLC指纹图谱的测定方法
(1)供试品溶液的制备
精确称取辣木叶细粉0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇水溶液50mL，混匀，冷浸提取60min后，混匀静置取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，即得。
(2)色谱条件和系统适用性
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD柱，规格为2.1×100mm，1.8μm；
检测波长：230nm；
流速：0.45mL/min；
柱温：35℃；
进样量：2μL
流动相：流动相A为体积百分比为0.005％的三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，梯度洗脱程序同实施例2。
(3)测定：将供试品溶液照超高效液相色谱法测定。
采用上述方法检测辣木叶，得到色谱图，其他步骤同实施例2.
实施例5辣木叶UPLC指纹图谱的测定方法
(1)供试品溶液的制备
精确称取辣木叶细粉0.5g，置圆底烧瓶中，加入75％甲醇水溶液50mL，加热回流提取30min，冷却至室温，取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
(2)色谱条件和系统适用性
色谱柱：Agilent Extend C18 RRHD柱，规格为2.1×150mm，2.1μm；
检测波长：220nm；
流速：0.5mL/min；
柱温：40℃；
进样量：2μL
流动相：流动相A为三氟乙酸体积百分比为0.01％的水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱，梯度洗脱程序如表7所示。
表7辣木叶UPLC洗脱程序
(3)测定：将供试品溶液照超高效液相色谱法测定。
采用上述方法检测辣木叶，得到色谱图，其他步骤同实施例2.
实施例6辣木叶UPLC指纹图谱的测定方法
(1)供试品溶液的制备
精确称取辣木叶细粉0.5g，置圆底烧瓶中，加入75％甲醇水溶液50mL，加热回流提取30min，冷却至室温，取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
(2)色谱条件和系统适用性
色谱柱：Agilent Extend C18 RRHD柱，规格为2.1×150mm，1.8μm；
检测波长：220nm；
流速：0.5mL/min；
柱温：40℃；
进样量：1μL
流动相：流动相A为甲酸体积百分比为0.1％的水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱，梯度洗脱程序同实施例5。
(3)测定：将供试品溶液照超高效液相色谱法测定。
采用上述方法检测辣木叶，得到色谱图，其他步骤同实施例2.
实施例7辣木叶UPLC指纹图谱的测定方法
(1)供试品溶液的制备
精确称取辣木叶细粉0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇水溶液50mL，混匀，冷浸提取60min后，混匀静置取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，即得。
(2)色谱条件和系统适用性
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD柱，规格为2.1×100mm，1.8μm；
检测波长：230nm；
流速：0.45mL/min；
柱温：35℃；
进样量：2μL
流动相：流动相A为体积百分比为0.005％的三氟乙酸-水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱，梯度洗脱程序同实施例5。
(3)测定：将供试品溶液照超高效液相色谱法测定。
采用上述方法检测辣木叶，得到色谱图，其他步骤同实施例2.
实施例8辣木叶UPLC指纹图谱建立方法的验证
1、仪器精密度试验
取批次为11的辣木叶，按照实施例2中辣木叶供试样品制备方法制备溶液，采用实施例2中的步骤(3)色谱条件进行测定，连续进样6次，测定结果见表8和9。
表8辣木叶UPLC指纹图谱精密度考察结果(主要峰的相对保留时间)
表9辣木叶UPLC指纹图谱精密度考察结果(主要峰的相对峰面积)
结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰的峰面积基本一致(RSD＜5％)，以第1次进样所得指纹图谱作为参照，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》相似度评价系统计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果见表10，其相似度均复合指纹图谱的技术要求。
表10仪器精密度试验的相似度计算结果(n＝6)
2、重复性试验
取批次为11的辣木叶，按实施例2中的步骤(2)平行制备6份供试品溶液，采用实施例2中的步骤(3)的色谱条件进行测定，测定结果见表11和12。
表11辣木叶UPLC指纹图谱重复性考察结果(主要峰的相对保留时间)
表12辣木叶UPLC指纹图谱重复性考察结果(主要峰的相对峰面积)
结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰的峰面积基本一致(RSD＜5％)，以第1次进样所得指纹图谱作为参照，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》相似度评价系统计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果见表13，其相似度均复合指纹图谱的技术要求。
表13重复性试验的相似度计算结果
3、稳定性试验
取批号为11辣木叶，按实施例2中的步骤(2)制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h考察稳定性，并采用实施例2中的步骤(3)的色谱条件进行测定，共测6次，测定结果见表14和15。
表14辣木叶UPLC指纹图谱稳定性考察结果(主要峰的相对保留时间)
表15辣木叶UPLC指纹图谱稳定性考察结果(主要峰的相对峰面积)
结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰的峰面积基本一致(RSD＜5％)，以第1次进样所得指纹图谱作为参照，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》相似度评价系统计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果见表16，其相似度均复合指纹图谱的技术要求。
表16稳定性试验的相似度计算结果
以上方法学考察结果表明，本发明建立的辣木叶UPLC指纹图谱方法仪器精密度、方法重复性较好，样品稳定，能够准确测定该制剂的指纹图谱，可应用于辣木叶的质量控制。
实施例9辣木叶UPLC指纹图谱相似度的考察
1、11批辣木叶的测定和UPLC标准指纹图谱的获得
11批辣木叶的来源见实施例2。按照实施例2中的步骤(2)制备供试品溶液，采用步骤(3)的色谱条件分别对11批辣木叶进行测定，所得辣木叶UPLC标准指纹图谱如图40 所示。
2、辣木叶UPLC指纹图谱相似度的考察
以实施例2中的辣木叶UPLC标准指纹图谱作为参照，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》计算每批辣木叶UPLC指纹图谱的相似度，结果如表17所示。
表17 11批辣木叶UPLC指纹图谱相似度考察结果
从表17中可看出，11批辣木叶UPLC指纹图谱与辣木叶UPLC标准指纹图谱的相似度基本大于0.90，方法重复性好，相似度高。其中批次1相似度为0.873，可能与样品的产地和采收时间及其加工状态有关。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种辣木叶UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取腺苷、L-苯丙氨酸、5-咖啡酰奎宁酸、L-色氨酸、4-咖啡酰奎宁酸、维采宁-2、牡荆素、异牡荆素、异槲皮素、槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷和山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷，分别加入甲醇溶液稀释配制成浓度为0.05～1.0mg/mL的溶液，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
(2)供试品溶液的制备
精确称取辣木叶细粉，加入溶剂，称重，加热回流或者超声提取，放至室温，补足重量。静置，取上清液，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
(3)色谱条件及系统适用性试验
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
检测波长：205-280nm
流速：0.3-0.5mL/min
柱温：30-45℃
进样量：0.5-5.0μL
流动相：流动相A为三氟乙酸体积百分比为0.005％-0.02％的水溶液或者为甲酸体积百分比为0.05％-0.2％的水溶液，流动相B为乙腈或甲醇，梯度洗脱。
(3)测定：将步骤(2)的样品照超高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的辣木叶UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中所述色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18 RRHD柱，规格为2.1×100mm,1.8～2.1μm；AgilentEclipse XDB C18柱，规格为3.0×100mm,1.8～2.1μm；Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱，规格为2.1×100mm，1.8～2.1μm。
3.根据权利要求1所述的辣木叶UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述流动相为B为乙腈，所述梯度洗脱程序为：
0分钟时，流动相A的体积百分比为95％，流动相B体积百分比为5％；
10分钟时，流动相A的体积百分比为87％，流动相B体积百分比为13％；
20分钟时，流动相A的体积百分比为82％，流动相B体积百分比为18％；
25分钟时，流动相A的体积百分比为70％，流动相B体积百分比为30％。
4.根据权利要求1所述的辣木叶UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述流动相为B为甲醇，所述梯度洗脱程序为：
0分钟时，流动相A的体积百分比为95％，流动相B体积百分比为5％；
12分钟时，流动相A的体积百分比为82％，流动相B体积百分比为18％；
14分钟时，流动相A的体积百分比为70％，流动相B体积百分比为30％；
30分钟时，流动相A的体积百分比为67％，流动相B体积百分比为33％。
5.根据权利要求1所述的辣木叶UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，有15个特征共有峰，利用PDA检测器和质谱检测器，供试品溶液与对照品溶液同时检测，其中选自以下一种或多种共有峰进行指认：1号峰为腺苷、2号峰为L-苯丙氨酸、3号峰为5-咖啡酰奎宁酸、4号峰为L-色氨酸、6号峰为4-咖啡酰奎宁酸、7号峰为维采宁-2、8号峰为牡荆素、9号峰为异牡荆素、10号峰为异槲皮素，11号峰为槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷，13峰为紫云英苷，15号峰为山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷。
6.根据权利要求5所述的辣木叶UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，对以下共有峰进行指认：1号峰为腺苷、2号峰为L-苯丙氨酸、3号峰为5-咖啡酰奎宁酸、4号峰为L-色氨酸、6号峰为4-咖啡酰奎宁酸、7号峰为维采宁-2、8号峰为牡荆素、9号峰为异牡荆素、10号峰为异槲皮素，11号峰为槲皮素-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷，13峰为紫云英苷，15号峰为山奈酚-3-O-(6″-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷。
7.根据权利要求1所述的辣木叶UPLC指纹图谱的建立方法，作为辣木叶、辣木茶或辣木叶制剂中的质量控制应用。
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