CN101215313B - 具有抗肿瘤作用的乌骨藤碳-21甾体皂苷混合物 - Google Patents

Abstract

本发明属医药技术领域，具体涉及从中药乌骨藤(Marsdenia tenacissima)中提取分离得到的具有抗肿瘤作用的碳-21甾体苷类混合物，这种混合物主要包含有5种碳-21甾体苷类化合物，这5种化合物分别为：通光藤苷A，通光藤苷B，通光藤苷C，通光藤苷D，Marsdenoside K。这种甾体苷化合物总重量含量≥80％的混合物被定名为乌骨藤总苷H。本发明还涉及该化合物的制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及本发明化合物和药用组合物在抗肿瘤药物方面的应用。

Description

具有抗肿瘤作用的乌骨藤碳-21甾体皂苷混合物

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种从中药乌骨藤(Marsdeniatenacissima)中提取分离得到的具有抗肿瘤作用的碳-21甾体苷混合物-乌骨藤总苷H和以该类化合物为活性成分的药物组合物，以及它们在抗肿瘤方面的应用。

背景技术

癌症是当今世界最大的疑难病症之一。大量的临床和实验研究证明，中医药在癌症的防治和康复方面具有重要的作用，从中草药中寻找抗癌活性成分，不仅对发现新药有很大潜力，而且可为设计更理想的新药提供独特的化学结构。因此，很多国家和制药企业把抗癌药物开发的重点逐步转向天然药物。

乌骨藤，为萝藦科植物，具有清热解毒、化痰软坚之功效。以乌骨藤单味制成的制剂“消癌平片”和“消癌平注射液”临床用于治疗食道癌、胃癌、肺癌、肝癌，取得较好的疗效，但存在以下几个问题：(1)提取工艺有待改进“消癌平片”系乌骨藤水提取后加工制成的片剂，每日服用量24-30片。成分复杂，成品体积大，有效成分相对含量低，生物利用度低，服用量大；“消癌平注射液”系乌骨藤水提取浸膏，加聚山梨酯80加工制成的注射剂，以聚山梨酯80作增溶剂，毒副作用大。(2)质量控制技术落后“消癌平片”质量标准仅有理化鉴别项；“消癌平注射液”用分光光度法测定总酚酸的含量。(3)有效成分有待确证。乌骨藤中绿原酸等酚酸类成分仅为其抗炎有效成分，而其中的抗癌有效成分尚不明确。近年来，随着新的提取分离技术的产生，并应用于药物的生产中，同时政府十分重视提高中药产品的附加值和技术含量，从而提高药物的疗效。因此十分有必要对乌骨藤抗肿瘤作用有效成分进行进一步的研究与开发，阐明其中的有效成分或有效部位，这不仅对加快传统中药产业改造，实施中药现代化工程及促进医药产业发展有重要意义，而且对创制具有我国特色、拥有自主知识产权、并符合国际规范的新药有重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的是通过现代化学和药理手段，从乌骨藤中提取分离出具有抗肿瘤作用的碳-21甾体苷混合物-乌骨藤总苷H。

本发明从乌骨藤中提取分离具有抗肿瘤作用的碳-21甾体苷类化合物，得到5种碳-21甾体苷，分别为：通光藤苷A，通光藤苷B，通光藤苷C，通光藤苷D，Marsdenoside K，以及包含这5种碳-21甾体苷的混合物-乌骨藤总苷H。该混合物中，一般地其碳-21甾体苷类化合物的重量含量≥80％。

乌骨藤总苷H的制备方法，该方法包括以下步骤：

a.将乌骨藤的茎粉碎后，以乙醇提取；

b.乙醇提取液浓缩后经硅胶柱层析，氯仿-乙醇进行梯度洗脱；

c.用薄层层析检测层析流分，具有相同单一斑点的流分合并浓缩，得到含上述碳-21甾体苷类化合物的流份即为乌骨藤总苷H。

本发明提取的乌骨藤总苷H，在动物体内抗肿瘤试验中，对小鼠移植性肿瘤S₁₈₀肉瘤及H₂₂实体瘤具有明显的抑制作用。

本发明中乌骨藤总苷H所包含的5种碳-21甾体皂苷是下列5个化学结构所示的5种甾体皂苷元之一与同一种糖链形成的5种糖苷，其中R为糖链。

通光藤苷元乙-I                                 通光藤苷元乙-II

通光藤苷元乙-III                                通光藤苷元乙-IV

11-α-O-苯甲酰基-12-β-O-乙酰基-通光藤苷元乙

通光藤苷A中，苷元为通光藤苷元乙-I，R为3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基。

通光藤苷B中，苷元为通光藤苷元乙-II，R为3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基。

通光藤苷C中，苷元为通光藤苷元乙-III，R为3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基。

通光藤苷D中，苷元为通光藤苷元乙-IV，R为3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基。

Marsdenoside K中，苷元为11-α-O-苯甲酰基-12-β-O-乙酰基-通光藤苷元乙，R为3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基。

本发明提供的碳-21甾体皂苷以及包含有碳-21甾体皂苷的乌骨藤总苷H的制备方法如下：乌骨藤用乙醇等作为提取溶剂进行提取，将提取浓缩得到的浸膏经硅胶柱层析，用薄层层析检测层析流分，合并具有相同单一斑点的流分，浓缩，得到乌骨藤总苷H。将乌骨藤总苷H经Rp-18低压柱或制备型HPLC(高效液相)分离和纯化，分得通光藤苷A，通光藤苷B，通光藤苷C，通光藤苷D，Marsdenoside K。

通过酸水解以及紫外光谱仪、红外光谱仪、电喷雾质谱仪、核磁共振氢谱仪、核磁共振碳谱仪等光谱分析技术，得到上述5种碳-21甾体苷的化学结构，依次为：通光藤苷元乙-I3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷；通光藤苷元-II3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷；通光藤苷元乙-III3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷；通光藤苷元乙-IV3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷；11-α-O-苯甲酰基-12-β-O-乙酰基-通光藤苷元乙3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的乌骨藤总苷H，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的乌骨藤总苷H和药物组合物可用于制备治疗抗肿瘤的药物。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使乌骨藤总苷H与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有乌骨藤总苷H占总重量比为0.1％～99.5％。最优选含有活性成分占总重量比为0.5％～95％。

对本发明中的乌骨藤总苷H进行了小鼠移植性肿瘤S₁₈₀肉瘤及H₂₂实体瘤体内抗肿瘤试验，以及对环磷酰胺抑制小鼠移植性肿瘤S₁₈₀肉瘤及H₂₂实体瘤的增效作用。

(一)乌骨藤总苷H对小鼠移植性肿瘤S₁₈₀肉瘤体内抗肿瘤试验。

1.方法

在无菌条件下取生长7～9天的小鼠移植性肿瘤S₁₈₀腹水，用4倍体积生理盐水稀释，于小鼠腋窝皮下接种0.2mL/只，接种次日随机分组，每组10只。设空白对照组，乌骨藤总苷H的不同浓度给药剂量组，环磷酰胺(CTX)组。接种次日起乌骨藤总苷H组每天灌胃给药1次，连用10天，CTX组腹腔注射给药2天，每天1次。停药次日动物称体重，处死后剥离瘤块，称瘤重。按下式计算肿瘤生长抑制率。

抑瘤率＝(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。

所得数据用平均值±标准差表示，并用t检验法比较各组间的统计学差异。

2.结果见表1

表1不同浓度乌骨藤总苷H对小鼠S₁₈₀肿瘤的抑制作用

注：与空白对照组比较，**P＜0.01

(二)乌骨藤总苷H对小鼠H₂₂实体瘤体内抗肿瘤试验。

1.方法

在无菌条件下取生长7～9天的小鼠移植性肿瘤H₂₂腹水，用4倍体积生理盐水稀释，于小鼠腋窝皮下接种0.2mL/只，接种次日随机分组，每组10只。设空白对照组，乌骨藤总苷H的不同浓度给药剂量组，环磷酰胺(CTX)组。接种次日起乌骨藤总苷H组每天灌胃给药1次，连用10天，CTX组腹腔注射给药2天，每天1次。停药次日动物称体重，处死后剥离瘤块，称瘤重。按下式计算肿瘤生长抑制率。

抑瘤率＝(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。

所得数据用平均值±标准差表示，并用t检验法比较各组间的统计学差异。

2.结果见表2

表2不同浓度乌骨藤总苷H对小鼠H₂₂肿瘤的抑制作用

注：与空白对照组比较，**P＜0.01

(三)乌骨藤总苷H对环磷酰胺抑制小鼠移植性肿瘤S₁₈₀的增效作用试验。

1.方法

在无菌条件下取生长7～9天的小鼠移植性肿瘤S₁₈₀腹水，用4倍体积生理盐水稀释，于小鼠腋窝皮下接种0.2mL/只，接种次日随机分组，每组10只。设生理盐水对照组，乌骨藤总苷H高、中、低剂量组，环磷酰胺(CTX)单用组，化疗药物与乌骨藤总苷H合用组。接种次日起每天给药1次，连用10天，联合给药组每天先腹腔注射给化疗药物，6小时后再灌胃给乌骨藤总苷H。停药次日动物称体重，处死后剥离瘤块，称瘤重。按下式计算肿瘤生长抑制率。

抑瘤率＝(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。

两药合用后是否增效，按下式计算q值：

$q=\frac{E_{\mathrm{AB}}}{E_A+(1-E_A)E_B}$

式中E_A为A药抑瘤率，E_B为B药抑瘤率，E_AB为两药合用的抑瘤率，q＝0.85～1.15为两药作用相加，q＞1.25为两药作用增强(或协同)，q＜0.85为两药拮抗。

2.结果见表3

表3不同浓度乌骨藤总苷H对小鼠S₁₈₀肿瘤CTX化疗的增效作用

说明乌骨藤总苷H与CTX合用对抑制小鼠S₁₈₀肿瘤有相加作用。

(四)乌骨藤总苷H对环磷酰胺抑制小鼠移植性肿瘤H₂₂的增效作用试验。

1.方法

在无菌条件下取生长7～9天的小鼠移植性肿瘤H₂₂腹水，用4倍体积生理盐水稀释，于小鼠腋窝皮下接种0.2mL/只，接种次日随机分组，每组10只。设生理盐水对照组，乌骨藤总苷H高、中、低剂量组，环磷酰胺(CTX)单用组，化疗药物与乌骨藤总苷H合用组。接种次日起每天给药1次，连用10天，联合给药组每天先腹腔注射给化疗药物，6小时后再灌胃给乌骨藤总苷H。停药次日动物称体重，处死后剥离瘤块，称瘤重。按下式计算肿瘤生长抑制率。

抑瘤率＝(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。

两药合用后是否增效，按下式计算q值：

$q=\frac{E_{\mathrm{AB}}}{E_A+(1-E_A)E_B}$

式中E_A为A药抑瘤率，E_B为B药抑瘤率，E_AB为两药合用的抑瘤率，q＝0.85～1.15为两药作用相加，q＞1.25为两药作用增强(或协同)，q＜0.85为两药拮抗。

2.结果见表4

表4不同浓度乌骨藤总苷H对小鼠H₂₂肿瘤CTX化疗的增效作用

说明乌骨藤总苷H与CTX合用对抑制小鼠H₂₂肿瘤有相加作用。

下面对本发明中的乌骨藤总苷H进行碳-21甾体皂苷含量测定来进一步说明本发明。

实验：乌骨藤总苷H中碳-21甾体皂苷的含量测定

1.实验仪器与试剂

(1)恒温水浴锅：W501，上海申生科技有限公司。

(2)电子天平：Sartorius，BP211D，德国。

(3)紫外可见分光光度仪：TU-1800型，北京普析通用仪器公司。

(4)试剂：硫酸、茴香醛、乙醇、甲醇均为分析纯。

(5)对照品：采用自制的通光藤苷B为对照品，纯度为98.0％。

(6)茴香醛硫酸显色剂的配制：量取茴香醛0.2mL与硫酸2.0mL，加无水乙醇37.8mL混匀，即得。

2.含量测定

2.1对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的对照品5.05mg，置于10mL量瓶中，加乙醇液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1mL含通光藤苷B 0.505mg)。

2.2供试品溶液的制备

精密称取乌骨藤总苷H 12mg用乙醇定容至10mL量瓶(1.20mg/mL)，摇匀，即得。

2.3测定方法

精密吸取浓度为1.20mg/mL的乌骨藤总苷H 0.5mL至具塞试管中，挥干溶剂，分别加入0.5mL茴香醛硫酸显示剂于100℃下反应15分钟，冰水浴10分钟终止反应，精密加入10mL甲醇于432nm处测定吸收度值。

2.4检测波长的选择

标准品溶液吸收波长的扫描：精密量取0.5mL通光藤苷B对照品溶液(C＝0.505mg/mL)至具塞试管中，挥干溶剂，分别加入0.5mL茴香醛硫酸显示剂于100℃下反应15分钟，冰水浴10分钟终止反应，精密加入10mL甲醇，在紫外分光光度计上400-600nm范围内扫描。结果标准品溶液在432nm处有最大吸收。

样品溶液吸收波长的扫描：精密量取0.5mL供试品溶液(C＝1.20mg/mL)至具塞试管中，挥干溶剂，分别加入0.5mL茴香醛硫酸显示剂于100℃下反应15分钟，冰水浴10分钟终止反应，精密加入10mL甲醇，在紫外分光光度计上400-600nm范围内扫描。结果样品溶液在432nm处有最大吸收。

2.5线性关系的考察

精密称取通光藤苷B 5.05mg用95％乙醇定容至10mL量瓶(0.505mg/mL)，分别精密吸取浓度为0.505mg/mL的通光藤苷B 0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL，0.8mL，0.9mL，1.1mL，1.3mL至具塞试管中，挥干溶剂，分别加入0.5mL茴香醛硫酸显示剂于100℃下反应15分钟，冰水浴10分钟终止反应，精密加入10mL甲醇，照紫外-可见分光光度法(中国药典72005年版一部附录VA)在432nm波长处测定，结果：标准曲线为y＝0.0129x+0.0178，R²＝0.9993，说明本品浓度在5.05-65.65μg.mL^-1范围内，与吸收度之间呈良好的线性关系，见说明书附图1。

2.6样品稳定性试验

精密量取0.5mL供试品溶液至具塞试管中，挥干溶剂，分别加入0.5mL茴香醛硫酸显示剂于100℃下反应15分钟，冰水浴10分钟终止反应，精密加入10mL甲醇，分别于0min，5min，10min，15min，20min，30min在紫外分光光度计上432nm波长处测定吸光度。结果RSD为1.16％，说明样品溶液在30min内稳定。

2.7仪器精密度

精密吸取供试品溶液于432nm处测定吸收度值。连续测定6次，结果：RSD为0.05％。

2.8重复性试验

精密称取乌骨藤总苷H6份分别依法测定吸收度值。结果平均含量为83.47％，RSD为1.63％

2.9加样回收率试验

称取乌骨藤总苷H各6mg置10mL量瓶中，分别精密加入浓度为5.1mg/mL的对照品1mL，用甲醇定容，混匀。分别依法测定吸收度值，计算，即得，结果平均回收率为99.3％，RSD为2.16％。

2.10样品含量测定

依法制备供试品溶液并测定，计算含量，结果见表5：

表5乌骨藤总苷H样品含量测定结果

本发明与现有技术相比，阐明了乌骨藤中抗肿瘤的有效成分，去除了现有产品中大量的杂质，工艺简单方便，质量控制标准有针对性。

附图说明

图1为通光藤苷B标准曲线图

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1：乌骨藤总苷H的制备

乌骨藤茎粉碎后，用70％乙醇回流3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物经硅胶柱层析，以氯仿-乙醇进行梯度洗脱，用薄层层析检测层析流分，合并具有相同单一斑点的流分，浓缩，分得1、2、3、4、5、6、7、8、9个流分，其中流分8即为乌骨藤总苷H。

乌骨藤总苷H，黄棕色粉末，Lieberman-Burchard和Keller-Killiani反应均呈阳性，显示为含2-去氧糖的甾体化合物。

实施例2制备通光藤苷A

乌骨藤茎粉碎后，用70％乙醇回流3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物经硅胶柱层析，以氯仿-乙醇进行梯度洗脱，用薄层层析检测层析流分，合并具有相同单一斑点的流分，浓缩，分得1、2、3、4、5、6、7、8、9个流分，将流分8经低压Rp-18柱(甲醇∶水)分离和制备HPLC(甲醇∶水)纯化后，得到通光藤苷A。

通光藤苷A，白色无定形粉末，mp142-144℃，[α]_D ²⁵-16.1°(MeOH；c＝0.5)，分子式：C₄₈H₇₄O₁₉。经光谱数据分析和理化性状测定与文献报道(Shuji Miyakawa，Kimiko Yamaura，Koji Hayashi et al.Five glycosides from the Chinese drug‘tong-guan-san’：The stems of Marsdenia tenacissima.Phytochemistry1986，25(12)：2861-2865)的通光藤苷A完全一致。

实施例3制备通光藤苷B

乌骨藤茎粉碎后，用70％乙醇回流3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物经硅胶柱层析，以氯仿-乙醇进行梯度洗脱，用薄层层析检测层析流分，合并具有相同单一斑点的流分，浓缩，分得1、2、3、4、5、6、7、8、9个流分，将流分8经低压Rp-18柱(甲醇∶水)分离和制备HPLC(甲醇∶水)纯化后，得到通光藤苷B。

通光藤苷B，白色无定形粉末，mp133-134℃，[α]_D ²⁵+11.5°(MeOH；c＝0.5)，分子式：C₅₁H₈₂O₁₉。经光谱数据分析和理化性状测定与文献报道(Shuji Miyakawa，Kimiko Yamaura，Koji Hayashi et al.Five glycosides from the Chinesedrug‘tong-guan-san’：The stems of Marsdenia tenacissima.Phytochemistry 1986，25(12)：2861-2865)的通光藤苷B完全一致。

实施例4制备通光藤苷C

乌骨藤茎粉碎后，用70％乙醇回流3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物经硅胶柱层析，以氯仿-乙醇进行梯度洗脱，用薄层层析检测层析流分，合并具有相同单一斑点的流分，浓缩，分得1、2、3、4、5、6、7、8、9个流分，将流分8经低压Rp-18柱(甲醇∶水)分离和制备HPLC(甲醇∶水)纯化后，得到通光藤苷C。

通光藤苷C，白色无定形粉末，mp129-131℃，[α]_D ²⁵+15.5°(MeOH；c＝0.5)，分子式：C₅₃H₇₆O₁₉。经光谱数据分析和理化性状测定与文献报道(Shuji Miyakawa，Kimiko Yamaura，Koji Hayashi et al.Five glycosides from the Chinese drug‘tong-guan-san’：The stems of Marsdenia tenacissima.Phytochemistry1986，25(12)：2861-2865)的通光藤苷C完全一致。

实施例5制备通光藤苷D

乌骨藤茎粉碎后，用70％乙醇回流3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物经硅胶柱层析，以氯仿-乙醇进行梯度洗脱，用薄层层析检测层析流分，合并具有相同单一斑点的流分，浓缩，分得1、2、3、4、5、6、7、8、9个流分，将流分8经低压Rp-18柱(甲醇∶水)分离和制备HPLC(甲醇∶水)纯化后，得到通光藤苷D。

通光藤苷D，白色无定形粉末，mp139-141℃，[α]_D ²⁵+16.5°(MeOH；c＝0.5)，分子式：C₅₁H₈₀O₁₉。经光谱数据分析和理化性状测定与文献报道(Shuji Miyakawa，Kimiko Yamaura，Koji Hayashi et al.Five glycosides from the Chinese drug‘tong-guan-san’：The stems of Marsdenia tenacissima.Phytochemistry1986，25(12)：2861-2865)的通光藤苷D完全一致。

实施例6制备Marsdenoside K

乌骨藤茎粉碎后，用70％乙醇回流3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物经硅胶柱层析，以氯仿-乙醇进行梯度洗脱，用薄层层析检测层析流分，合并具有相同单一斑点的流分，浓缩，分得1、2、3、4、5、6、7、8、9个流分，将流分8经低压Rp-18柱(甲醇∶水)分离和制备HPLC(甲醇∶水)纯化后，得到Marsdenoside K。

Marsdenoside K，白色无定形粉末，mp135-137℃，[α]_D ²⁵-5.5°(MeOH；c＝0.5)，分子式：C₅₀H₇₂O₁₉。经光谱数据分析和理化性状测定与文献报道(Deng J，Liao ZX，Cheng DF.Three new polyoxypregnane glycosides from MarsdeniaTenacissima.Helv Chim Act，2005(88)：2675-2682)的Marsdenoside K完全一致。

Claims (2)

1.一种从乌骨藤中提取得到的碳-21甾体苷类混合物-乌骨藤总苷H，其特征在于主要为5种碳-21甾体苷类化合物，分别为通光藤苷A，通光藤苷B，通光藤苷C，通光藤苷D，Marsdenoside K，且碳-21甾体苷类化合物的重量含量大于或等于80％，这5种碳-21甾体苷类化合物的化学结构如下所示：

       通光藤苷A                           通光藤苷B

      通光藤苷C                            通光藤苷D

Marsdenoside K

其中，R＝3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基。

2.根据权利要求1所述的碳-21甾体苷混合物-乌骨藤总苷H的制备方法，该方法包括以下步骤：

a.将乌骨藤的茎粉碎后，以乙醇提取；

b.乙醇提取液浓缩后经硅胶柱层析，氯仿-乙醇进行梯度洗脱；

c.用薄层层析检测层析流分，具有相同单一斑点的流分合并浓缩，得到含上述碳-21甾体苷类化合物的流份，即为乌骨藤总苷H。

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