CN116559337A - 同时定量分析葡萄糖四聚体和麦芽四糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用高效液相色谱‑离子淌度差分质谱串联装置同时定量分析葡萄糖四聚体及麦芽四糖的方法，所述方法包括以下步骤：1）制备含有葡萄糖四聚体和麦芽四糖的样品溶液；2）将所述样品溶液注入到高效液相色谱‑离子淌度差分质谱串联装置中，获得质量色谱图；3）根据所述质量色谱图使用内标法对葡萄糖四聚体和麦芽四糖进行定量分析，其中，在所述高效液相色谱中使用由流动相A和流动相B组成的混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为pH值在8.5至11.5范围内的水性流动相，且所述流动相B为乙腈，并且其中，用于葡萄糖四聚体的离子淌度差分补偿电压在‑2.0至‑4.0 V的范围内，且用于麦芽四糖的离子淌度差分补偿电压在‑0.2至‑0.8 V的范围内。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学和药物分析化学领域，具体而言，涉及一种利用高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置同时定量分析葡萄糖四聚体和麦芽四糖的方法。
背景技术
庞贝病是一种溶酶体贮积症，主要累及心脏和骨骼肌。由于溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶的缺乏，糖原积聚在这些患者的溶酶体中[1]。婴儿型最为严重，其特征为肥厚型心肌病、运动发育迟缓、喂养困难和呼吸功能不全。由于心肺功能不全，患者通常不能存活超过1岁。在庞贝病患者中，经尿排泄的葡萄糖四聚体6-α-D-吡喃葡萄糖基-麦芽三糖（6-α-D-glucopyranosyl-maltotriose，Glc4）明显升高[2]。Glc4来源于α-淀粉酶和中性α-1,4-葡萄糖苷酶对糖原的降解。麦芽四糖（M4）是Glc4的一种手性异构体，在血浆和尿液中也存在，会干扰Glc4的定量检测。另外，M4也可能是庞贝病的生物标志物，目前尚未见有研究其临床意义的报道。以下给出Glc4和M4的结构式：
据报道，Glc4是长期监测疾病进展和酶替代疗法治疗反应的生物标志物[3-4]。与传统血清标志物肌酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶相比，尿Glc4与骨骼肌糖原含量和临床治疗反应密切相关[4]。在过去的几年里，已经开发了几种 Glc4和M4的检测方法，包括薄层色谱法[5]、高效液相色谱法 (HPLC)[6]、液相色谱-质谱法 (LC-MS)[7-11]。在这些方法中，只HPLC [6]和LC-MS [9]具有区分Glc4和M4的能力。然而，HPLC 需要很长的色谱运行时间（35分钟），并且需要对氨基苯甲酸丁酯衍生化，这是一个非常耗时的制备过程。在LC-MS [9]方法中，尿样经过简单稀释后即可分析。然而，该方法运行时间较长（10分钟），且无法定量M4，这可能会导致M4失去其作为生物标志物的潜力。随着生物分析技术的发展，复杂的分析步骤和较长的运行时间已经不能满足现代实验室的需求，灵敏、快速、简便的分析方法是现代临床实验室的必然趋势。
因此，本领域急需一种简便、快速的方法来同时定量分析尿液中的Glc4和M4，为患者诊断和治疗效应评估提供支持。
发明内容
本发明目的在于提供一种同时定量分析葡萄糖四聚体和麦芽四糖的方法。
本发明的一个方面涉及一种利用高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置同时定量分析葡萄糖四聚体和麦芽四糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）制备含有葡萄糖四聚体和麦芽四糖的样品溶液；
2）将所述样品溶液注入到高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置中，获得质量色谱图；
3）根据所述质量色谱图使用内标法对葡萄糖四聚体和麦芽四糖进行定量分析，
其中，所述高效液相色谱中使用由流动相A和流动相B组成的混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为pH值在8.5至11.5范围内的水性流动相，且所述流动相B为乙腈，并且
其中，用于葡萄糖四聚体的离子淌度差分补偿电压在-2.0至-4.0 V的范围内，且用于麦芽四糖的离子淌度差分补偿电压在-0.2至-0.8 V的范围内。
优选地，所述流动相A为pH值在9.0至11.0范围内的水性流动相，更优选pH值在9.5至10.5范围内的水性流动相。更优选地，所述流动相A为0.005质量%至0.100质量%的氨水。
优选地，用于葡萄糖四聚体的离子淌度差分补偿电压为-3.0 V，且用于麦芽四糖的离子淌度差分补偿电压为-0.5 V。
在一个优选实施方案中，所述梯度洗脱程序的总时长不超过10.0分钟，优选不超过5.0分钟，更优选不超过2.6分钟。
在一个优选实施方案中，在所述梯度洗脱程序中，起始流动相和最终流动相均为30体积%流动相A+70体积%流动相B，流动相B的浓度梯度从70体积%变化至50体积%所用的时间为1.0至5.0分钟。
优选地，所述梯度洗脱程序为：
0.0至1.5分钟，70体积%至50体积%流动相B；
1.5至2.7分钟，50体积%至50体积%流动相B；
2.7至2.8分钟，50体积%至70体积%流动相B；
2.8至5.0分钟，70体积%至70体积%流动相B，
其中流动相A和流动相B的总量为100体积%。
更优选地，所述梯度洗脱程序为：
0.0至0.2分钟，70体积%至70体积%流动相B；
0.2至1.0分钟，70体积%至50体积%流动相B；
1.0至1.8分钟，50体积%至50体积%流动相B；
1.8至1.9分钟，50体积%至70体积%流动相B；
1.9至2.6分钟，70体积%至70体积%流动相B，
其中流动相A和流动相B的总量为100体积%。
在一个优选实施方案中，所述高效液相色谱中的色谱柱为氨基色谱柱，优选为以亚乙基桥杂化颗粒填充的色谱柱。
在一个优选实施方案中，所述制备含有葡萄糖四聚体和麦芽四糖的样品溶液包括：用乙腈-水混合溶剂溶解葡萄糖四聚体和麦芽四糖来得到样品溶液。优选地，所述制备含有葡萄糖四聚体和麦芽四糖的样品溶液还包括：用乙腈-水混合溶剂将所得样品溶液稀释至所需浓度。优选地，所述乙腈-水混合溶剂中乙腈与水的体积比在1：3至3：1的范围内，更优选为1:1。
在一个实施方案中，所述葡萄糖四聚体和麦芽四糖来自受试者的尿液。
在一个实施方案中，所述制备含有葡萄糖四聚体和麦芽四糖的样品溶液包括：向受试者的尿液中加入内标工作液，然后加入乙腈稀释，涡旋混合后将所得混合物离心，取上清液用于分析。
优选地，葡萄糖四聚体和麦芽四糖的内标物均为具有以下分子结构式的6-α-D-吡喃葡萄糖基-麦芽三糖-13C6 (Glc4-13C6)：
。
优选地，所述内标工作液通过用乙腈稀释内标物的母液来制备。
在一个实施方案中，在所述离子淌度差分质谱中，所述葡萄糖四聚体的去簇电压（DP）为-200至-50 V，优选为-115 V，并且所述葡萄糖四聚体的碰撞能量（CE）为-55至-15V，优选为-38 V。
在一个实施方案中，在所述离子淌度差分质谱中，所述麦芽四糖的去簇电压（DP）为-200至-50 V，优选为-180 V，并且所述麦芽四糖的碰撞能量（CE）为-55至-15 V，优选为-30.5 V。
在一个实施方案中，在所述离子淌度差分质谱中，用于Glc4-13C6的离子淌度差分补偿电压在-2.0至-4.0 V的范围内，优选为-3.0 V，所述Glc4-13C6的去簇电压（DP）为-200至-50 V，优选为-200 V，并且所述Glc4-13C6的碰撞能量（CE）为-55至-15 V，优选为-35 V。
与现有技术相比，本发明利用高效液相色谱-离子淌度差分质谱联用技术在非常短的时间内同时分离并且定量分析了葡萄糖四聚体和麦芽四糖。本发明的方法具有灵敏度高，稳定性好，分析速度快和数据重现性强等优点，具有较高的实用性和可靠性。此外，本发明方法的尿液样本前处理简单，无需复杂的衍生化处理，分析时间短，能够准确、高效的定量尿液中的葡萄糖四聚体和麦芽四糖。
本发明的方法能够同时对葡萄糖四聚体和麦芽四糖进行准确定量分析，从而满足庞贝病诊断和疗效监测研究的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施方案描述中所使用的附图作简单地介绍。
图1A、图1B和图1C分别为通过高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置获得的葡萄糖四聚体、麦芽四糖和内标的单标样品的质量色谱图。
图2A和图2B分别为人工尿液中葡萄糖四聚体和麦芽四糖的典型标准曲线。
图3A和图3B分别为通过高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置获得的庞贝病患者尿液中葡萄糖四聚体和麦芽四糖的色谱图。
图4A、图4B和图4C分别为在关闭离子淌度的情况下，在相同高效液相色谱-串联质谱联用方法下获得的葡萄糖四聚体、麦芽四糖和内标的单标样品的质量色谱图。
图5为在仅依靠色谱分离葡萄糖四聚体和麦芽四糖的情况下，通过高效液相色谱-串联质谱联用装置获得的葡萄糖四聚体和麦芽四糖的混合标准样品的质量色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在不背离本发明的精神的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面给出本发明的技术方案的具体实施例，但本领域技术人员能够理解，以下具体实施例仅是实施本发明的多种方案中的一部分示例，它们不应被理解为以任何方式限制本发明的范围。
实施例所使用的试剂及原料如下：
葡萄糖四聚体和Glc4-13C6购自Toronto Research Chemicals(TRC)（多伦多，加拿大）；
麦芽四糖购自上海安谱璀世标准技术服务有限公司（上海，中国）；
乙腈（HPLC级，Honeywell，美国）和氨水（分析纯，西陇科学，中国）均商购获得；
若无特别说明，在实验过程中使用的纯净水均由Milli-Q水纯化系统（Millipore公司，Mosheim，法国）制得。
下列实施例中采用的仪器：
高效液相色谱LC 30 AD系统（岛津公司，京都，日本）；离子淌度差分质谱仪为SelexION® DMS系统联合QTRAP® 5500系统（SCIEX公司，Concord，加拿大）。
实施例一：方法学验证
本实施例说明了血浆和尿液中葡萄糖四聚体和麦芽四糖定量分析方法的方法学验证。
混合内标工作液的配制：取Glc4-13C6的1 mg/mL母液50 μL加入950 μL乙腈并混匀，制成内标工作液（50 μg/mL）。
尿液样本制备方法：
取20 μL含葡萄糖四聚体和麦芽四糖的尿液，加入20 μL内标工作液（50 μg /mL），再加入40 μL乙腈进行稀释，混匀后17000 g离心3分钟，取1-10 μL上清液上样分析。
采用本发明提供的分析方法，使用内标法进行定量分析。对方法的线性、精密度和加标回收率、相对基质效应、定量下限、残留、稳定性和选择性进行了验证，详细结果见表1-6。
表1：葡萄糖四聚体和麦芽四糖线性
表2：葡萄糖四聚体和麦芽四糖的精密度结果
注：LLOQ：定量下限，LQC：低浓度质控，MQC：中浓度质控，HQC：高浓度质控，RSD：相对标准偏差。
表3：葡萄糖四聚体和麦芽四糖的加标回收率结果
注：LLOQ：定量下限，LQC：低浓度质控，MQC：中浓度质控，HQC：高浓度质控。
表4：葡萄糖四聚体和麦芽四糖的相对基质效应结果
注：LQC：低浓度质控， HQC：高浓度质控。
表5：葡萄糖四聚体和麦芽四糖的定量下限结果
注：RE：相对误差，RSD：相对标准偏差。
表6：葡萄糖四聚体和麦芽四糖的稳定性结果
注： RE：相对误差，RSD：相对标准偏差，LQC：低浓度质控， HQC：高浓度质控。
从表中数据可以看出，本发明方法的各项性能参数均满足相关要求，通过本发明的方法定量的尿液中葡萄糖四聚体和麦芽四糖在0.5-100 μg/mL范围内线性良好，精准度高，重现性好，基质干扰小，灵敏度高，选择性好，无残留影响。因此，本发明的方法具有较高的实用性和可靠性。
实施例二：临床样本监测
本实施例说明了利用高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置对14例尿液样本中葡萄糖四聚体和麦芽四糖的分离定量。
溶液配制：分别精密称量葡萄糖四聚体、麦芽四糖和Glc4-13C6各1 mg，并使用1 mL乙腈-水混合溶剂（乙腈:水的体积比=1:1）溶解，得到各自浓度为1 mg/mL的单标样品溶液。再使用稀释液（乙腈-水混合溶剂，其中乙腈:水的体积比=1:1）将上述样品溶液稀释为1000ng/mL的溶液。各取10 μL注入高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置中，采用本发明提供的分析方法，得到代表性色谱图（图1A、图1B 和图1C）。
由图1A、图1B 和图1C可见，通过本发明的方法基本能够消除葡萄糖四聚体和麦芽四糖的互相干扰，因此能够实现同时对二者的准确定量。
高效液相色谱条件：
色谱柱：Acquity UPLC® BEH Amide柱，规格为：1.7 µm 2.1×50 mm
流动相：流动相A为0.028质量%的氨水，流动相B为乙腈。
梯度洗脱程序：
0.0至0.2分钟，70体积%至70体积%流动相B；
0.2至1.0分钟，70体积%至50体积%流动相B；
1.0至1.8分钟，50体积%至50体积%流动相B；
1.8至1.9分钟，50体积%至70体积%流动相B；
1.9至2.6分钟，70体积%至70体积%流动相B，
其中流动相A和流动相B的总量为100体积%。
流速：0.4 mL/min
柱温：40°C
自动进样器温度：10°C
进样体积：1 μL-10 μL
所述离子淌度差分质谱的工作参数在以下表7中示出：
表7：离子淌度差分质谱的工作参数
将患者的尿液样本收集到洁净的离心管中，取500微升尿液加入20微升氨水，混匀后置于-80 ℃冰箱中，在一个月内完成分析。
根据本发明的方法对尿液进行预处理，利用高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联技术定量分析方法分析人尿液中的葡萄糖四聚体和麦芽四糖浓度，以实现庞贝病诊断，以及治疗效应监测。尿液样本中葡萄糖四聚体和麦芽四糖的色谱图见图3A 和图3B。
对比例
（1）相同高效液相色谱-串联质谱方法在开启和关闭离子淌度下的对比
图1 A、图1B和图1C分别为离子淌度开启时Glc4单标样品、M4单标样品和内标单标样品的色谱图，图4 A、图4B和图4C分别为相同高效液相色谱-质谱法方法在关闭离子淌度时Glc4单标样品、M4单标样品和内标单标样品的色谱图。从图中可以看出，关闭离子淌度时，Glc4和M4无法实现色谱分离，在Glc4单标的结果中，M4通道会出现干扰峰，而在M4单标的结果中，Glc4通道也会出现干扰峰，即二者会互相干扰。当开启离子淌度时，在Glc4单标的结果中，M4通道会出现一个特别小的峰，该峰基本不会干扰Glc4的定量；而在M4单标的结果中，Glc4通道不会出现干扰，即离子淌度使二者在无需色谱分离的条件下也不会发生相互干扰。
（2）在无离子淌度的情况下仅靠色谱进行分离的方法对比
图5为利用高效液相色谱-串联质谱装置获得的Glc4和M4的混标样品的色谱图。由图1A、图1B 和图1C可以看出，在使用离子淌度的情况下，仅需2.6分钟即可实现Glc4和M4的分离和同时定量。而在无离子淌度的情况下仅依靠色谱进行分离时，需要10分钟才能实现Glc4和M4的分离和同时定量，且二者的色谱峰并未完全分离，可能存在一定的相互干扰。因此，本发明的方法具有极高的分析效率和抗干扰能力。
（3）与文献中报道的方法相比
从表8可以看出，本发明的方法在检测效率、灵敏度、特异性和操作便捷性等方面具有独特的优势。
表8：本发明的方法与文献中报道方法的对比
本发明的方法是一种多分析物分析方法，在一次运行中可同时定量两种四糖聚体。在本发明的方法中，采用一步稀释法来制备尿液样品，操作简单，易于推广，大大缩短制备时间。经测试，在30分钟内可制备30份尿样，具有分析效率的优越性。样本需求量少，尿液仅需20 µL。两种四糖聚体之间基本互不干扰。在本发明的方法中未观察到任何分析物残留，无需在相邻样本之间注入空白样本减少干扰。最后，本发明的方法能够成功应用于庞贝病患者的治疗效应监测研究。
总之，本发明的方法在可靠性、分析效率和可操作性方面显示出巨大的优势。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求的保护范围为准。
参考文献：
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Claims (17)
1.一种利用高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置同时定量分析葡萄糖四聚体和麦芽四糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）制备含有葡萄糖四聚体和麦芽四糖的样品溶液；
2）将所述样品溶液注入到高效液相色谱-离子淌度差分质谱串联装置中，获得质量色谱图；
3）根据所述质量色谱图使用内标法对葡萄糖四聚体和麦芽四糖进行定量分析，
其中，所述高效液相色谱中使用由流动相A和流动相B组成的混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为pH值在8.5至11.5范围内的水性流动相，且所述流动相B为乙腈，并且
其中，用于葡萄糖四聚体的离子淌度差分补偿电压在-2.0至-4.0 V的范围内，且用于麦芽四糖的离子淌度差分补偿电压在-0.2至-0.8 V的范围内。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述梯度洗脱程序的总时长不超过10.0分钟，并且在所述梯度洗脱程序中，起始流动相和最终流动相均为30体积%流动相A+70体积%流动相B，流动相B的浓度梯度从70体积%变化至50体积%所用的时间为1.0至5.0分钟。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述梯度洗脱程序的总时长不超过5.0分钟。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述梯度洗脱程序的总时长不超过2.6分钟。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述梯度洗脱程序为：
0.0至0.2分钟，70体积%至70体积%流动相B；
0.2至1.0分钟，70体积%至50体积%流动相B；
1.0至1.8分钟，50体积%至50体积%流动相B；
1.8至1.9分钟，50体积%至70体积%流动相B；
1.9至2.6分钟，70体积%至70体积%流动相B，
其中流动相A和流动相B的总量为100体积%。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述高效液相色谱中的色谱柱为氨基色谱柱。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述高效液相色谱中的色谱柱为以亚乙基桥杂化颗粒填充的色谱柱。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述制备含有葡萄糖四聚体和麦芽四糖的样品溶液包括：用乙腈-水混合溶剂溶解葡萄糖四聚体和麦芽四糖来得到样品溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述乙腈-水混合溶剂中乙腈与水的体积比在1：3至3：1的范围内。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述乙腈-水混合溶剂中乙腈与水的体积比为1：1。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述葡萄糖四聚体和麦芽四糖来自受试者的尿液。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述制备含有葡萄糖四聚体和麦芽四糖的样品溶液包括：向受试者的尿液中加入内标工作液，然后加入乙腈稀释，涡旋混合后将所得混合物离心，取上清液用于分析。
13.根据权利要求12所述的方法，其中葡萄糖四聚体和麦芽四糖的内标物均为具有以下分子结构式的6-α-D-吡喃葡萄糖基-麦芽三糖-13C6：
。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述离子淌度差分质谱中，所述葡萄糖四聚体的去簇电压为-200至-50 V，并且所述葡萄糖四聚体的碰撞能量为-55至-15 V。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述离子淌度差分质谱中，所述葡萄糖四聚体的去簇电压为-115 V，并且所述葡萄糖四聚体的碰撞能量为-38 V。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中所述离子淌度差分质谱中，所述麦芽四糖的去簇电压为-200至-50 V，并且所述麦芽四糖的碰撞能量为-55至-15 V。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述离子淌度差分质谱中，所述麦芽四糖的去簇电压为-180 V，并且所述麦芽四糖的碰撞能量为-30.5 V。
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