ES2461415B1 - Derivados funcionalizados e inmunorreactivos para el fungicida fludioxonil - Google Patents

Abstract

Derivados funcionalizados e inmunorreactivos para el fungicida fludioxonil.#La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para fludioxonil. Asímismo, la presente invención también se refiere al uso de conjugados de fludioxonil como antígenos de ensayo o inmunógenos para obtener anticuerpos de este fungicida; y al uso de los derivados marcados de fludioxonil como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a un método de análisis de fludioxonil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar fludioxonil que comprende anticuerpos de este fungicida, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados.

Description

DERIVADOS FUNCIONALIZADOS E INMUNORREACTIVOS PARA EL FUNGICIDA FLUDIOXONIL

DESCRIPCiÓN

La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para f1udioxonil. Ademas, la presente invención también se refiere a un método de analisis de ftudioxonil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los fungicidas son el grupo de plaguicidas que con mayor frecuencia aparece en los programas de vigilancia y control. Esto es asi no sólo por su elevado uso, sino principalmente porque estos proouclos de protección vegetal se emplean para combatir las infecciones causadas por hongos en momentos muy próximos a la cosecha o incluso con posteriOridad (fungicidas postcosecha). Este hecho incrementa considerablemente la probabilidad de que residuos de dichos tratamientos permanezcan cuando el alimento llegue al consumidor, lo que obliga a los organismos de regulación y control a estar más vigilantes e idealmente a aumentar los controles. Los ataques por hongos en frutos almacenados constituyen uno de los motivos principales de pérdidas económicas en agricultura. El uso intensivo de fungicidas convencionales, como el tiabendazol o el imazalil, ha llevado en los ultimas años a la aparición de cepas resistentes y por tanto a una menor efICacia de los tratamientos con estos productos. Ante esta circunstancia. las empresas agroquimicas pusieron en marcha programas de I+D encaminados a desarrollar nuevos productos que presentaran mecanismos de acción innovadores y que permitieran combatir de forma eficaz las infecciones fungicas. al tiempo que fueran seguros y compatibles con los programas de gestión integrada de plagas. Estos productos están comenzando a sustituir progresivamente a los productos más antiguos. que resultan menos aceptables desde un punto de vista toxicológico y medioambiental.

Entre los fungicidas más relevantes desarrollados en la última década con aplicaciones en postcosecha destaca el fludioxonil, un compuesto de la familia de los fenilpirroles. Este plaguicida bloquea la acción de una enzima encargada de catalizar la fosforilación de la enzima reguladora de la sintesis del glicerol. compuesto que regula la presión osmótica intracelular del hongo. De esta manera se estimula la síntesis del glicerol que, al acumularse, produce una hipertrofia que acaba destruyendo las célulaS del hongo. El fludioxonil (4-(2.2-difluoro-l.3benzodioxol-4-il)-IH-pirrol-3-carbonitrilo) es un producto de uso agroquimico comercializado a nivel mundial por Syngenta. En la actualidad las denominaciones comerciales más habituales son Switch, Beret y Celest. encontrándose también en forma de formulaciones combinadas con otros fungicidas, entre los que destaca ciprodinil. Su utilización como fungicida postcosecha esta autorizada tanto en cítricos como en frutas de hueso y pepita. El fludioxonil fue incluido en el anexo I de la UE en el 2008. Entre los cultivos para los que la UE ha establecido límites máximos de residuos de forma explícita se encuentran los citricos (7-10 ppm). frutas de hueso o de pepita (5-7 ppm). bayas (1-5 ppm), uva (4-5 ppm), fresa (3 ppm) y ciruelas (0.5 ppm). además de una gran variedad de otras frutas y hortalizas.

Las metodologías analiticas empleadas para el análisis de estos fungicidas son fundamentalmente de tipo instrumental. en especial cromatografía de gases (GC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). acopladas a diferentes detectores según el tipo de compuesto a analizar y la sensibilidad requerida. Estas técnicas se caracterizan por su capacidad para analizar simultáneamente varios residuos con una elevada precisión y exactitud. Sin embargo, pese a que resultan imprescindibles en muchas circunstancias. con frecuencia implican la utilización de metodologias laboriosas y de elevado coste. que deben realizarse por personal altamente cualificado en laboratorios centralizados bien equipados y habitualmente alejados de las zonas de producción. Estas limitaciones condicionan la idoneidad de estas técnicas para acometer el análisis de grandes números de muestras y para obtener resultados en breve plazo. dos aspectos que contribuirían a garantizar la seguridad de los alimentos comercializados y a la realización de estudios mas exhaustivos sobre la exposición de los consumidores a fungicidas a través de los alimentos.

Los inmunoensayos son técnicas bioanaliticas basadas en la interacción de un antígeno (el ana lito) con un anticuerpo que lo reconoce específicamente. No obstante. un plaguicida es una molécula orgánica pequeña que constituye un unico sitio de unión al anticuerpo. por lo que en este tipo de técnicas analiticas la interacción entre el analito y el anticuerpo se realiza por desplazamiento de la unión entre el anticuerpo y un análogo marcado del analito. De este modo. en presencia del analito se establece una competencia entre éste y el análogo marcado por la unión al anticuerpo. Habitualmente. el marcaje se realiza con una actividad enzimatica, dando así lugar a los enzimoinmunoensayos. Cuando además uno de los participantes en la reacción se encuentra inmovilizado sobre un soporte sólido, la técnica se denomina ELlSA (del inglés Enzyme-Linl<ed Immunosorbent Assay). Los primeros inmunoensayos enzimáticos para plaguicidas se desarrollaron durante la primera mitad de los años 80. Desde entonces hasta la actualidad el número de plaguicidas para los cuales se han desarrollado inmunoensayos ha aumentado espectacularmente. suponiendo varias decenas y cubriendo los principales

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grupos de compuestos: insecticidas, herbicidas y fungicidas. De hecho, un gran número de estos ensayos están disponibles comercialmente en fORTIs de kits con diferentes formatos. La creciente aceptación de los inmunoensayos como técnicas complementarias a las cromalográficas para el análisis de pequeñas moléculas orgénicas se debe a que se trata de una metodología sencina, rápida y de bajo coste, exhibiendo al mismo tiempo una elevada sensibilidad y especificidad. Los inmunoensayos permiten detectar específicamente el analilo diana en mezclas muy complejas, simplificando considerablemente los laboriosos procedimientos de preparación de la muestra, lo que a su vez redunda en un aumento en la capacidad de muestreo. Además, los inmunoensayos pueden realizarse en formatos portátiles, lo que los independiza de los laboratorlos centralizados y los convierte en idóneos para el análisis en los puntos de producción . Las excelencias analíticas atribuidas a los inmunoensayos ya han sido demostradas en muchas aplicaciones prácticas, donde han competido favorablemente con las técnicas cromatográficas (M.C. Hennion, Ana/ysis 1998, 26,149-155; A. Abad et al., J. Chromatogr. A 1999, 833, 3-12; A. Abad et al., J. Agric. Food Chem. 2001 , 49, 1707-1712; N.A. lee y IR Kennedy, J. AOAC Int. 2001, 84, 1393-1406; FA Esteve-Turrillas et al., Anal. Chim. Acta 2010, 682, 93-103).

Sin embargo, hasta la fedla no se ha descrito la utilización de la tecnologla de inmunoensayo para analizar el contenido del fun9icida fludioxonil en una muestra.

Por lo tanto, existe una necesidad, en particular en la industria alimentaria y/o agricola, de desarrollar un método analitico que permita la determinación o detección mediante la tecnologla de inmunoensayo del plaguicida fludioxonil, fungicida ampliamente utilizado en la actualidad, preferentemente mediante la utilización de un kit que comprenda al menos un anticuerpo para fludioxonil.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención proporciona haptenos de fludioxonil, compuestos de fórmula (1), que presentan una funcionalización adecuada, en diferentes posiciones de la molécula, para la obtención de conjugados de fludioxonil o derivados marcados de fludioxonil.

Un primer aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula (1):

T-L-Y

(1) caracterizado porque T se selecciona del grupo que consiste en R.t, R-II y R-III;

H H T

, ,

F::Y° CN F::Y°'"tfCN

' ~ FiOr¡_ "" )"

° r¡ ~ ° r¡ ~

'"tf

--1R~ R-III

R-II donde R-I se selecciona del grupo que consiste en (4-( 4-ciano-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzo[ dJ[1 ,3)dioxol-5-ilo], (7-(4-ciano-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzo[d)[1 ,31dioxol-5-ilo) y (7 -(4-ciano-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzo[ d)[1 ,3Jdioxol-4-ilo); R-II es (4-(2,2-difluorobenzo[d][1 ,3]dioxol-4-il)-1 H-pirrol-3-ilo); R-III es [3-cian0-4-(2,2-difluorobenzo[d][1 ,3)dioxol-4-il)-1 H-pirrol-1-ílo]; L es una cadena hidrocarbonada de O a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada

o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O Y N; e y es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -COOH, -NH2, -N3, -CH2Br, -CH21, -C=:CH, -CHO, -SH, -S03H, -OS02Ar y -NH-NH2; con la condición de que:

a) cuando T es [3-cian0-4-(2,2-difluorobenzo(d)[1,3]dioxol-4-il)-1H-pirrol-1-ilo], L es una cadena lineal hidrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, b) cuando T es [3-cian0-4-(2,2-difluorobenzo(d)[1,3)dioxol-4-il)-1H-pirrol-1-ilo) e Y es COOH, l es una cadena hidrocarbonada de 4 a 40 átomos de carbono,

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e) cuando T es [4-(2,2-difluorobenzold][1,3)dioxol-4-il)-1H-pirrol-3-ilo) e Y es COOH, L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono.

En la presente solicitud de patente se entiende por arilo (-Ar) un grupo carboclclico aromático con un único anillo,

S por ejemplo fenilo, múltiples anillos, por ejemplo bifenilo, o múltiples anillos condensados donde al menos uno de ellos es aromático, por ejemplo 1,2,3,4-tetrahidronaftil0, 1-naftilo, 2-naftilo. El grupo arilo puede estar sustituido o no. Preferentemente, el grupo arilo es 4-metilfenilo.

Según una realización preferida. el compuesto de fórmula (1) de la presente invención se caracteriza porque L es 10 una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre Oy 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consisle en O y N.

Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (1) de la presente invención se caracteriza porque y se selecciona del grupo que consiste en -COaH, -CHa, -C:::CH, -NH2 y -SH. Preferentemente, et 15 compuesto de fórmula (1) objeto de la presente invención se caracteriza porque Y es -COaH.

Según otra realizaciÓn preferida, el compuesto de formula (1) tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T se selecciona del grupo que consiste en [4-( 4-oan0-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2 -difluorobenzo[d][ 1,3)dioxol-5-ilo),

20 [7-(4-cian0-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzo[d][ 1 ,3)dioxol-5-ilo] y [7-(4-cian0-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzo[d][1 ,31dioxol-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; e Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -C:::CH, -NH2 y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (1) de la presente invención se

25 caracteriza porque l es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 8 átomos de carbono y dicha cadena comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en a y N.

Según una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (1) de esta Invención es

H

/VO,

~CN

0-0

30 (CH2)sC02H

Según otra realización preferida, el compuesto de formula (1) tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [4-(2,2-difluorobenzo[d][1 ,3Jdioxol-4-il)-1 H-pirrol-3-ilo); l es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono y dicha cadena comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo

35 que consiste en a y N; e Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHa, -C::::CH, -NH2 y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (1) de la presente invención se caracteriza porque l es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 8 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N.

40 Según una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (1) de esta invención es H

/ VO'

~CONH(CH2)'C02H

0-0

Según otra realización preferida, el compuesto de formula (1) tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [3-cian0-4-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-4-il)-1H-pirrol-l-ilo]; l es una cadena

45 hidrocarbonada lineal de 4 a 20 átomos de carbono y dicha cadena comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; e Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -C::::CH, -NH2 'i -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (1) de la presente invención se caracteriza porque l es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 a 8 átomos de carbono y dicha cadena comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en a y N.

50

Según una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (1) de esta invención es

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Un segundo aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula (11):

5

[T-L-Z)o-P

(U) caracterizado porque T se selecciona del grupo que consiste en R-I, R-II Y R-III;

H H

10 , , T

F~O CN F~O CN

,"d-~ F1;'0I¡'_~ )" '"<f(

O I¡' ~ O I¡' ~

'"tf

--1

R-III

R-I R-II

donde R-I se selecciona del grupo que consiste en (4-( 4-ciano-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzo[d1l1 ,3)dioxol-5-ilo).

15 [7-( 4-cian0-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzold1l1 ,3)dioxol-5-ilo] y [7-(4-cian0-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzo(d1l1 ,3Jdioxol-4-ilo]; R-I! es [4-(2,2-diftuorobenzo[dJ[1 ,3]dioxol-4-il)-1 H-pirrol-3-ilo); R-III es [3-ciano-4-(2,2-difluorobenzo(d][ 1,3)dioxol-4-il)-1 H-pirrol-1-ilo1; L es una cadena hidrocarbonada de O a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada

20 o ¡nsaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O Y N; Z es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -5-, -S-S-, -NH(C=NH)-, -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N=N-, -NH-, -NR-, O Y .,: N, /'

25 N" N

/S0

'--iN )=f

-

O

30 P es un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor de 2000 daltons; y n es un número con un valor entre 1 y 500.

El valor de n indica el grado de conjugación, es decir la relación molar entre la fracción derivada del compuesto de fórmula (1) y P, el polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor de 2000 dallons en el compuesto de 35 fórmula (11) resultante.

El compuesto de fórmula (11) de la presente invención puede utilizarse para la producción de anticuerpos o junto con un anticuerpo de f1udioxonil, para determinar o detectar este fungicida en una muestra mediante la tecnologfa de inmunoensayo competitivo.

40

Según una realización preferida, el compuesto de fórmula (11) se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 álomos de carbono y dicha cadena hidrocarhonada comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N. Preferentemente, la cadena hidrocarbonada lineal comprende entre O y 8 átomos de carbono y entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en

45 O Y N.

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Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fónnula (11) de la presente invención se caracteriza porque Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, ~o y N /' ....... 8 N1' 'N/ N

)=i

5

O

Preferentemente, el compuesto de fórmula (11) objeto de la presente invención se caracteriza porque Z es -CONH-.

10 Según otra realización preferida de la presente invención, el compuesto de fórmula (11) descrito en esta solicitud de patente se caracteriza porque P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, ¡3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidase. Preferentemente, cuando P es albúmina, es albúmina de huevo o albúmina sérica.

15 Según otra realización preferida, el compuesto de formula (11) de la presente invención se caracteriza porque T se selecciona del grupo que consiste en [4-(4-ciano-1 H-pirrol-3-i 1}-2,2-difluorobenzo[dJ[1 ,3]dioxol-5-ilo], [7 -(4-ciano-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzo[dJ[1 ,3]dioxol-5-iloJ y

20 [7 -(4-ciano-1 H-pirrol-3-il)-2,2-difluorobenzo[d)[1 ,3]dioxol-4-ilo); L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende

entre O y 4 heleroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; O Zse selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, ...... Sy-k' y

25 '--(.N

imagen1

O

P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, liroglobulina, hemocianina, j3-galactosidasa, peroxidasa, 30 fosfatasa y oxidasa. Según una realización aún más preferida, el compuesto de formula (11) es H

N

\0 " I

CN

F O (1

~

P

(CH')5-CONH

n 35 donde P se selecciona del grupo que consiste en albúmina o peroxidasa, y n es un valor seleccionado entre 1 y SO.

Según otra realización preferida, el compuesto de fOnTlula (11) de la presente invención se caracteriza porque T es (4-(2,2-difluorobenzo(dJ[ 1 ,3Jdioxol-4-il)-1 H-pirrol-3-iloJ;

40 L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; Z se selecciona del grupo que consiste en-CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,

45

P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, j3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasB.

50

Según una realizaci6n aún más preferida , el compuesto de fOm'lula (11) es

imagen1

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,,\-~ t~",,--,

o f " n

donde P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa , y n es un valor seleccionado entre 1 y

50.

5 Según otra realización preferida, el compuesto de fonnula (11) de la presente invención se caracteriza porque T es [3-ciano-4-(2,2-difluorobenzo[d)[1 ,31dioxol-4-il)-1 H-pirrol-1-ilo); L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heleroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; Z se se'ec6ona de' grupo que cons;s'e en -CONH-. -NHCO-. -NH-. -S-o y

/S-,l<0

10

~N

imagen1

O

15 P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, jJ-galadosidasa, peroxidasa, fostelase y oxidasa.

Según una realización aún más preferida, el compuesto de formula (11) es

imagen2

20

donde P se selecciona del grupo que consiste en albumina o peroxidasa, y n es un valor seleccionado entre 1 y

50.

Un tercer aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula (111):

25 (T-L-Zlm-Q

(111)

caracterizado porque

T.

L Y Z tienen el mismo significado definido anteriormente para el compuesto de fórmula (tt);

30 a es un marcador no isotópico; y m es un numero entero con un valor entero entre 1 y 1000.

En la presente invención se entiende por marcador cualquier molécula o fragmento que dé lugar a una sei'ial medible por cualquier tipo de técnica analltica. En la presente invención, a del compuesto de fórmula (111)

35 identifica un fragmento o una molécula qulmica detectora, marcadora o trazadora.

Este compuesto de fórmula (111) puede utilizarse con un anticuerpo de fludioxonil para determinar o detectar este fungicida en una muestra mediante la tecnologia de inmunoensayo competitivo.

40 Segun una realización preferida, el compuesto de fórmula (111) se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 ¡Momos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N. Preferentemente, L es una cadena hidroearbonada lineal de O a 8 átomos de carbono y comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N.

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Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (III) de la presente invención se caracteriza

porque Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, O y /.N,./.

/S0

N~ N

'--iN r

-

O

Preferentemente, el compuesto de fórmula (111) se caracteriza porque Z es -CONH-.

Según olra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (111) de la presente invención se caracteriza porque Q es biotina, un compuesto luminiscente, un fluoróforo, un marcador acoplado a un sistema de detección indirecta, micro o nanopartículas u otros.

Preferentemente, Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceina o uno cualquiera de sus derivados, un fluor6foro de cianina, un fluor6foro de rodamina, un fluoroforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio, nanoparticuias cuánticas (en inglés quantum dOls), y micro-o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.

Según otra realización preferida, el compuesto de formula (111) de la presente invención se caracteriza porque T se selecciona del grupo que consiste en 14-(4-ciano-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzold1l1 ,3)dioxol-5-ilo], [7 -(4-ciano-1 H-pírrol-3-¡ 1)-2,2-difluorobenzold1l1,3]dioxol-5-ilo] y [7 -(4-ciano-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzo[d1l1 ,3)dioxol--4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineat de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; O Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, ....... s~ y N.¿N .....N/; Y

'--iN r

-

O

Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceina o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio. nanopartlcutas cuánticas, y micro-o nanoparticulas de oro coloidal, de carbón o de látex.

Según otra realización preferida, el compuesto de formula (111) de la presente invención se caracteriza porque T es 14-(2,2-difluorobenzo[d)[1, 3]dioxol-4-il)-1 H-pirrol-3-ilo); L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heleroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; O 9'N ............ Z se seleee;on. del grupo que cons;s1e en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, /S~N_y ~N ;y

O

Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un f1uoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio, nanopartlculas cuánticas, y micro-o nanoparticulas de oro coloidal, de carbón o de látex.

Según otra realización preferida, el compuesto de formula (111) de la presente invención se caracteriza porque T es [3-cian0--4-(2,2-difluorobenzo[d)[1 ,3]dioxol--4-il)-1 H-pirrol-1-ilo); L es una cadena hídrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; O Z se setecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, ....... s~ y

'--iN-

O Q se selecciona del grupo que consiste en biotína, fluoresceina o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio. nanoparticulas cuánticas, y micro-o nanopartlculas de oro coloidal, de carbón o de látex.

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Un cuarto aspecto de la presente invención describe un anticuerpo generado en respuesta a un compuesto de fórmula (11) tal como se describe en esta solicitud de patente.

Segun una realización preferida de la invención, el compuesto de f6nnula (11) que genera un anticuerpo lal como

5 se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T se selecciona del grupo que consiste en [4-(4-ci ano-1 H-pirrol-3-il)-2,2-difluorobenzo[d)[1 ,3]dioxol-5-ilo), [7-(4-ci 8no-1 H-pirrol-3-il)-2,2-difluorobenzo[d)[1 ,3]dioxol-5-ilo) y [7-( 4-ci ano-1 H-pirrol-3-il)-2,2-difluorobenzo[d)[1 ,3jdioxol-4-iloj:

10 L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre Oy 4 heleroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; O N Z ,e ,eleroo". del grupo que oon,;,'e en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -5-, /S~N_ y ~t/;y

15 O

P se selecciona del grupo que consiste en albumina, tiroglobulina y hemocianina.

Preferentemente, el compuesto de tannula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud 20 de patente es el compuesto H

N

\-0 " I

CN F O i'

~

(CH2),-CONH P n

donde P en albúmina y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.

Segun otra realización preferida de la invención, el compuesto de fórmula (11) que genera un anticuerpo lal como

25 se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es (4-(2.2-difluorobenzo(dJ(1 ,3]dioxol-4-il)-1 H·pirrol-3-ilo); L es una cadena hidrocaroonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; O Z se selecciona del grupo que consiste en -CQNH-, -NHCO-, -NH-, -S-, y ...,: N, /' y

,.....S0 N' N ',

30 '--(.N

r

O

P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina y hemocianina,

35

Preferentemente, el compuesto de formula (11) es

H

F\-O, ACONH(CH2),CONH

P

0-0 .

n

donde P es albúmina y n es un valor seleccionado enlre 1 y 50,

40

Segun olra realización preferida de la invención, el compuesto de fórmula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [3-cian0-4-(2,2-difluorobenzo[dJ( 1 ,3)dioxol-4-il)-1 H-pirrol-1-ilo]: L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende

45 entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N;

Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCQ-, -NH-, -S-,

5 P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina y hemocianina. Preferentemente, el compuesto de f6nnula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud

10 de patente es

imagen1

imagen1

donde P es albúmina y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.

Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un método de análisis in vitro de fludioxonil en una 15 muestra que comprende las siguientes etapas:

8. poner en contacto la muestra con el anticuerpo descrito en esta solicitud de patente;

b.

incubar la muestra y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que lenga lugar una reacción inmunoqulmica; y

c.

determinar la existencia de reacción inmunoqulmica tras la incubación del paso (b).

20

El método de la presente Invención permite la determinación cuantitativa o análisis cualitativo del contenido del fungicida fllJdioxonil en una muestra. Asl mismo, el método de la presente invención permite analizar el contenido de fludioxonil en diferentes tipos de muestras, por ejemplo, muestras de alimentos, muestras medioambientales tales como agua, suelo o superficie, y muestras biológicas tales como orina. Preferentemente, la presente

25 invención proporciona un método de análisis in vitro de fludioxonil en un alimento.

Según una realización preferida, la determinación de la reacción inmunoqulmica en el paso (e) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un compuesto de fórmula (11) tal como se describe en esta solicitud de patente. Preferentemente, el inmunoensayo competitivo es de lipo ELlSA.

30 Según otra realización preferida, la determinación de la reacción inmunoqulmica en el paso (e) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo. usando como competidor un compuesto de fÓrmula (111) tal como se describe en esta solicitud de patente. Preferentemente, el inmunoensayo competitivo es de lipo ELISA.

35 El término inmunoensayo hace referencia a un ensayo analitico en el que ocurre una reacción inmunoqulmica para la detección o cuantificación de un analito. Los inmunoensayos competitivos son aquellos en los que el analito compite con otra molécula por la unión con el anticuerpo.

El término antlgeno en esta solicitud de patente se refiere a una molécula capaz de interacdonar

40 especificamente con un anticuerpo. La interacción o reacción inmunoquimica consiste en la unión específica y no covalente entre un anticuerpo y un antígeno, pudiendo ser éste el analito o un antlgeno de ensayo.

En la presente memoria el término antlgeno de ensayo, antlgeno enzimático o trazador se refiere a un compuesto de fórmula (11) o de fórmula (111) que se utiliza en el ensayo competitivo.

45 Un sexto aspecto de la presente invención también se refiere a un kit de detección de fludioxonil que utiliza al menos un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente. Adicionalmente, el kit de detección de fludioxonil puede comprender un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un compuesto de formula

(11) y un compuesto de formula (111) tal como se describen en la presente solicitud de patente.

50 El compuesto de fórmula (11) de la presente invención se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (1) con P, un polipéptido nalural o sintético de peso molecular mayor a 2000 daltons, por métodos ampliamente conocidos en la técnica .

55 El procedimiento de obtención del compuesto de fórmula (11) también puede comprender, de ser necesario, una etapa adicional de activación del grupo funcional Y.

Por otro lado, el compuesto de fórmula (111 ) de la presente invención se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (1) con Q, un marcador no isotópico, por métodos ampliamente conocidos en la técnica.

El procedimiento de obtención del compuesto de fórmula (111 ) también puede comprender, de ser necesario, una etapa adicional de activación del grupo funcional Y.

Cuando el compuesto de fórmula (1) se caracteriza porque Y es un grupo carboxílico, la activación mencionada anteriormente puede tener lugar haciendo reaccionar el compuesto de fórmula (1) con carbonato de N,"'disuccinimidilo. Este procedimiento de activación puede tener lugar en un disolvente orgánico como por ejemplo acelonitrilo, propanonitrilo, diclorometano, cloroformo, teirahidrofurano, benceno o tolueno; en presencia de una base como por ejemplo trietilamina, triisopropilamina, piridina, 4 -N,N-dimetilaminopiridina, picolina o diazo(1 ,3)biciclo-(5.4.0]undecano; en un intervalo de temperatura entre O y 30~C.

Los términos inmunógeno e inmunogénico tal como se utilizan en la presente invención se refieren a una sustancia que es reconocida como extraña al organismo vivo y por lo tanto es capaz de producir o de generar una respuesta inmune en un huésped.

Asi mismo, la obtención de anticuerpos a partir de compuestos de fórmula (11) también puede tener lugar por métodos de inmunización ampliamente conocidos en la técnica.

Los anticuerpos generados a partir de un compuesto de fórmula (11) tal como se describe en esta solicitud de patente pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoc:lonales, anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpo.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra ~comprende~ y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderén en parte de la descripción y en parte de la practica de la invención.

Para preparar anticuerpos frente a fludioxonil se requiere la preparación de derivados funcionalizados de dicho fungicida, es decir, analogos estructurales de fludioxonil que incorporan un grupo funcional susceptible de ser utilizado para la conjugación a un portador P o marcador Q. Este grupo funcional esta separado del esqueleto de la molécula de f1udioxonil por un espaciador L La posición de incorporackJn del grupo funcional a la estructura de f1udioxonil para la conjugación no es un aspecto obvio y puede ser detenTIinante para la viabilidad de los compuestos de fórmula (11) como inductores de la producción de anticuerpos de afinidad y selectividad adecuadas frente a f1udioxonil e incluso de compuestos de fórmula (11) o (111 ) que actúen como moléculas competidoras y que permitan el desarrollo de un inmunoensayo sensible y especifico para dicho fungicida, objeto u~imo de la presente invención.

A continuación se ilustra con algunos ejemplos y figuras la forma en que puede efectuarse la preparación de varios derivados de fludioxonil que son compuestos de fórmula (1) y los correspondientes compuestos de fórmula (11), que no pretenden que sean limitativos de la presente invención, y que sirven para mostrar no solo la forma en que puede efectuarse la preparación de los mismos sino también la importancia que puede tener la naturaleza estructural del compuesto de fÓnTIula (11) para la producción de anticuerpos de afinidad adecuada hacia el analito, aptos para el desarrollo de un buen inmunoensayo.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Esquema de la síntesis del compuesto de fórmula (1) FOa6.

Figura 2. Esquema de la sintesis del compuesto de fórmula (1) FDc6.

Figura 3. Esquema de la síntesis del compuesto de fórmula (1) FOn6.

Figura 4. Esquema de la preparación de un compuesto de fórmula (11 ) a partir del correspondiente compuesto de fórmula (1), donde el término II-INM significa compuesto de fórmula (11) que se puede utilizar para generar un anticuerpo para fludioxonil, y el término II-ANT significa compuesto de fórmula (11) que puede actuar como competidor en un ensayo inmunológico competitivo.

Figura 5. Señales obtenidas frente a 0.01 ¡.¡g de compuesto de fórmula (lit homólogo inmovilizado con los anticuerpos anti-fludioxonil a diluciones de 3x104 (negro), 105 (gris claro) y 3x10 (gris oscuro).

Figura 6. Curva estandar para f1udioxonil en el formato de ElISA competitivo indirecto.

EJEMf3LOS

A continuación se ilustrara la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de

manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de fórmula (11 ) para la obtención de anticuerpos antif1udioxoni1. En los siguientes ejemplos los números en negrita hacen referencia a la correspondiente estructura que se muestra en los esquemas de las Figuras 1 a 3. Estos ejemplos se presentan a modo de demostración pero de ningún modo pueden suponer un límite a la invención.

, . Preparación de compuestos de fórmula (11)

1.1. Síntesis de compuestos de fórmula (1)

Ejemplo 1: Síntesis de FDa6 (13) [radical de tipo T= R-I)

La sintesis del compuesto FOa6 (13) se describe en la Figura 1. Comienza con la nitración del acido 2,2difluorobenzo[d)[1,3)dioxol4-carboxilico (2), preparado conforme el procedimiento de Schlosser (Eur. J. Org. ehem. 2001 , 691-695) a partir del compuesto 1, para dar una mezcla de los derivados nitrados en meta y para respecto del grupo carboxilato, a partir de la que separa por cristalizaci6n el compuesto 3. Este compuesto es hidrogenado en condiciones esté:ndar para dar la anilina 4, que es transformada en el ioduro 5 a través de una reacción de diazotación con ácido nitroso, seguida de tratamiento in situ de la sal de diazonio formada con ioduro potásico. La transformación del grupo carboxilato de 5 en el grupo formilo se efectua en dos etapas, primero reducción del grupo carboxilato a hidroximetilo con diborano, seguido de reoxidación con el periodinano de OessMartin. La reacción de Wittig del aldehído formado 7 con (cianometileno)trifenilfosforano procede suavemente para proporcionar el nilrilo a-p-insaturado 8 como una mezcla de isómeros cisltrans. La elaboración final del anillo de pirrol se lleva a cabo tratando esta mezcla con TosMle en medio basico. obteniéndose el derivado pirrólico 9 con rendimiento moderado. Una vez completado el esqueleto biciclico caracteristico de fludioxonil se lleva a cabo la incorporación de la cadena hidrocarbonada carboxilada que constituye el brazo espaciador, utilizando una reacción de acoplamiento de Sonogashira entre el ioduro 9 y el alquino-éster 10, catalizada por Pd(O). La síntesis del compuesto FOa6 (13) se completa mediante una reacción de hidrogenación del triple enlace del alquino obtenido 11 . seguidO de hidrólisis ácida de grupo éster ferc-bulílico.

A continuación se ilustran los detalles de la preparación y caracterización de este compuesto de fórmula general (11·

i) Preparación del acido 2,2-difluoro-6-nilrobenzo[d][1,3]dioxol-4-carboxilico (3). El acido 2,2difluorobenzo[d)[1,3)dioxol4-carboxilico (2, 1.8 g, 8.9 mmol) se suspendió en H2S0. concentrado (20 mL) y la mezcla se enfrió en un baño de hielo. A continuación se añadió gota a gota una mezcla de HN03 fumante y H2SO. concentrado (4 mL) desde un embudo de adición y la mezcla resultante se agitó a oce por 3 h Y se vertió sobre hielo picado (aproximadamente 300 g). El precipitado amarillo formado se recogió por filtración a vacio. se lavó con agua fria y se secó a vacío bajo P20 S obteniendo una mezcla de los ácidos regioisoméricos 2,2-difluoro5-nitrobenzo[d][1,3]dioxol-4-carboxilico y 2,2-difluoro-7-nitrobenzo[d][1,3]dioxol-4-carboxilico (3) (1 .91 g, correspondiente a un rendimiento combinado del 87 %). El compuesto 3 se purificó por cristalización de la mezcla de re~ioisómeros de hexano-eter (844 mg, 49 %). Pf 201.1-203.4 "e (cristalizado de Et20-hexano). IR (KBr) vrnaJcm' : 3119, 1874, 1707, 1658, 1235, 1171. RMN de l H (300 MHz, MeOH-c4) ¡s (ppm): 8.61 (1 H, d, J =

2.3 Hz), 8.34 (I H,d, J= 2.3 Hz). RMN de 13e (75 MHz, MeOH-c4) ¡s (ppm): 163.7 (C), 148.9 (C), 146.2 (e), 145.3 (e), 133.7 (t, J = 255 Hz, e), 123.0 (eH), 116.3 (C), 110.2 (CH). EMAR (TOF-MS) miz: calculado para e sH2F2N06 [M-H¡< 245.9843. encontrado 245.9850.

ii) Preparación del ácido 6-amino-2,2-djfluorobenzo[d][1,3]dioxol-4-carboxílico (4 ). El compuesto 3 (1 .36 g, 5.5 mmol) se disolvió en EtOH (45 mL) bajo atmósfera de N2. El catalizador, 10% Pd/e (150 mg), se suspendió en AcOEt (5 mL) y se añadió a la mezcla de reacción. El matraz se purgó con H2 y la mezcla se agitó a temperatura ambiente por 1 h bajo atmósfera de H2 (globo). La mezcla de reacción se filtró a través de una pequeña capa de celite, que se lavó con AcOEt. La eliminación de los disolventes a vacio proporcionó 4 (1.2 g, 100%) como un sólido parduzco. Pf 227-230 oC. IR (KBr) vmax/cm'l : 3426, 1585, 1395, 1254. RMN de l H (300 MHz, MeOH-d.) ¡s (ppm): 6.93 (I H, d, J = 2.3 Hz), 6.73 (1 H, d, J = 2.3 Hz). RMN de 13e (75 MHz, MeOH-d.) ¡s (ppm): 166.3 (e ),

146.3 (el, 146.2 (el, 137.5 (el, 133.3 (1, J = 251 Hz, el, 116.1 (el, 110.7 (eHI, 102.2 (eHI. EMAR (TOF-MSI miz: calculado para CsHsF2NO. [M+Hr 218.0265, encontrado 218.0260.

iii) Preparadón del ácido 2,2-difluoro-6-jodobenzo[dJ[1,3}dioxof-4-carboxílico (5). Una disolución de NaN02 (953 mg, 13.81 mmol, 2.5 eq) en agua (7 mL) se añadió gota a gota durante 45 minutos sobre una suspensión de 4 (1.2 g, 5.5 rnmol) en una mezcla 1:1 de H20 y Hel concentrado (35 mL) enfriada en un bano de hielo. La mezcla se agitó por un tiempo adicional de 30 min en el baño de hielo y luego se vertió sobre una disolución de KI (5.5 g,

33.13 mmol, 6 eq) en agua (50 mL). La mezcla resultante se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y entonces se añadieron pequeñas porciones de NaHS03 hasta que la mezcla se tornó naranja pillido. La suspensión resultante amarillenta se filtró a vacío y el sólido recogido se lavó con agua y se secó a vacío bajo P2ÜS obteniéndose el oompuesto 5 (1 .38 g, 76%). Pf 194.1-196.6~C. IR (KBr) vma./cm·1: 1701, 1474, 1221 , 1055. RMN de 'H (300 MHz, MeOH-d4) 6 (ppm): 8.00 (lH, d, J = 1.7 Hz), 7.80 (lH, d, J = 1.7 Hz). RMN de He (75 MHz, MeOH-(4)6 (ppm): 164.2 (e), 146.3 (e ), 144.8 (C). 135.4 (eH), 133.1 (t, J= 251 Hz, C), 123.6 (eH). 117.8 (e), 85.3 (e). EMAR (TOF-MS) miz: calculado para CsH2F2104 [M-H¡< 326.8986, encontrado 326.8983.

iv) Preparación del (2,2-difluoro-6-iodobenzo[d}[f,3}dioxol-4-yl)metanoJ (6). Una disolución 1M del co mplejo BH3-THF en THF (2.8 mL, 2.8 mmol, 2 eq) se añadió gota a gota durante 15 minutos sobre una disolución del compuesto 5 (453 mg, 1.38 mmol) en THF anhidro (3 mL) bajo atmósfera de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche y entonces se añadió una disolución acuosa 2M de Hel (3 mL) y la mezcla resu~ante se extrajo con CH2CI2, las fases orgánicas combinadas se lavaron con una disolución saturada de NaHC03 y salmuera, se secaron sobre Na~04 anhidro y se concentraron a vacío. El residuo se purificó por cromatografia, usando CH2eI2-MeOH 40:1 como eluyente obteniendo el alcohol 6 (421 mg, 97%) como un sólido blancuzco. Pf 69.5-69.7 oC. IR (KBr) vm.../cm·' : 3434, 1474, 1237, 1158, 1038. RMN de ' H (300 MHz, CDCb) 6 \~pm): 7.45 (I H, d, J = 1.6 Hz), 7.29 (I H, d, J = 1.6 Hz), 4.66 (2H, d, J = 5 .8 Hz), 2.97 (1 H, t, J = 5.8 Hz). RMN de e (75 MHz, eDeb) 6 (ppm): 143.8 (e). 140.9 (e), 131.4 (e), 131 .3 (1, J = 257 Hz, el, 125.0 (e), 117.7 (CH),

84.8 (e), 58.2 (eH2). EMAR (TOF-MS) miz; calculado para e sHsF210 3 313.9252, encontrado 313.9263.

v) Preparación del 2,2-difluoro-6-iodobenzo[d}[1 ,3}dioxol-4-carbaldehido (7). Perdiodinano de Dess-Martin (760 mg, 1.79 mmol, 1.5 eq) se añadió bajo atmósfera de N2 a una disolución del alcohol 6 (38 mg, 1.21 mmol) en eH2el2 anhidro (4 mL) enfriada a O (>e. El matraz de reacción se cubrió con una hoja de papel de aluminio para protegerlo de la luz y se añadió piridina (357 pL, 3.1 eq). La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a ooe y 1.5 horas a temperatura ambiente, se diluyó con eH2el2 (100 mL), se lavó con una mezcla 1:1 de una disolución saturada de NaHe03 y una disolución acuosa al 10% de Na2S203, se secó sobre Na~04 anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purifiCó por cromatografia sobre gel de sílice, usando CH2el2"MeOH 40:1 como eluyente, obteniéndose el aldehído 7 (333 mg, 88%) como un sólido blanquecino. Pf 55-57°C. IR (KBr) vmaJcm": 1698, 1474, 1257, 1186, 991, 858. RMN de'H (300 MHz, CDCI3) 6 (ppm): 10.08 (IH, s). 7.89 (IH, d, J= 1.7 Hz), 7.60 (IH, d, J= 1.7 Hz). RMN de '3C (75 MHz. eDeb) 6 (ppm): 184.4 (e), 145.0 (e), 131.7 (eH), 131.9 (1, J = 263 Hz, C), 128.4 (C), 123.2 (eH), 120.8 (C), 84.9 (C). EMAR (TOF-MS) miz: calculado para e SH3F210 3 311.9095, encontrado 311.9112.

vi) Preparación del 3-(2, 2-difluoro-6-iodobenzo[d}[1 ,3}dioxol-4-il)acrilonitrilo (8): (eianometileno )trifeni tfosforano (580 mg. 1.93 mmol, 2.4 eq) se añadió bajo atmósfera de N2 a una disolución del aldehído 7 (246 mg, 0.80 mmol) en eH2el2 anhidro (20 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y el disolvente org.imico se eliminó a vacío. El residuo obtenido se purificó por cromatografía, usando eH2eI2-MeOH 40:1 como eluyente, obteniéndose un sólido blanco consistente en una mezcla 45:55 de los isómeros trans y ds del compuesto 8 (266 mg, 99%). IR (KBr) vma.Jcm·': 3434, 1466, 1247, 1162. RMN de'H (300 MHz, CDCb) 6 (ppm):

8.17 (O.45H, dd, J = 1.5, 0.5 Hz, isómero trans), 7.40-7.46 (1.55H, m, isómeros Gis y trans), 7.20 (0.45H, dd, J = 16.8,0.5 Hz, isómero trans), 7.12 (0.55H, dd, J = 12.1,0.5 Hz, isómero cis), 6.13 (0.45H, d, J = 16.8 Hz, ísómero trans), 5.68 (O.55H, d, J = 12.1 Hz, isómero Gis). EMAR (TOF-MS) miz: calculado para ClOH4F21N02 334.9255, encontrado 334.9250.

vii) Preparación del 4-(2,2-difluoro-6-iodobenzo[d}[1,3}dioxol-4-il)-1H-pirroJ-3-carbonitrilo (9). Una disolución de TosMIC (376 mg, 1.92 mmol, 2 eq) en THF anhidro (1 mL) y otra de t-BuOK (216 mg, 1.92 mmol, 2 eq.) en THF (1 mL) se añadieron sucesivamente bajo nitrógeno sobre una disolución de la mezcla de nitrilos insaturados ísoméricos 8 (323 mg, 0.96 mmol) en THF (2.5 mL) a o"e. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a la misma temperatura y posteriormente 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se vertió sobre hielo-agua y se extrajo con AcOEt, los extractos organicos se lavaron con salmuera y se secaron sobre Na2S04 anhidro. El residuo sólido obtenido tras la evaporación del disolvente se suspendió en eH2el2 (5 mL) y la suspensión resultante se sonicó durante 1 minuto. La suspensión resultante se filtró a vacio y el sólido recogido se purificó por cromatografía, utilizando eH2eI2-MeOH 100:1 como eluyente, obteniéndose 9 (185.4 mg, 51%) como un sólido ligeramente parduzco que se descompone cuando se calienta a 145~e. IR (KBr) vm.../cm·': 3260, 2226, 1638, 1257, 1226, 1161 . RMN de 'H (300 MHz, MeOH-(4) 6 (p.gm): 7.94 (1 H,d, J = 1.6 Hz), 7.56 (1 H, d, J = 2.1 Hz). 7.43 (1 H, d, J = 1.6 Hz), 7.28 (I H, d, J = 2.1 Hz). RMN de 3e (75 MHz, MeOH-d~) (') (ppm): 145.5 (C). 141.0 (e). 132.6 (l. J =255 Hz. e). 131.5 (eH). 130.0 (eH). 121.8 (eH). 120.2 (C) . 117.8 (eH). 117.4 (e). 117.3 (e).

91 .6 (C), 86.3 (C). EMAR (TOF-MS ) miz: calculado para C 12H4F21N2Ü2[M-H]+ 372.9286, encontrado 372.9292.

viii) Preparación del 6-(7-(4-ciano-1H-pirroJ-3-il)-2,2-dmuorobenzo[d][1,3] dioxol-S-il)hex-5-inoato de ten-butilo (11). Et3N anhídra (1.2 mL) se añadíó gota a gota sobre una mezcla del ioduro alílico 9 (113 mg, 0.30 mmol), 13

hex·5-inoato de terc-butilo (10) (76 mg, 0.45 mmol, 1.5 eqj, Pd(PPh3)2CI2 (6.4 mg, 3% mol), y Cut (0.6 mg, 1% mol) en DMF anhidra (1 .2 mL) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, se diluyó con agua y se extrajo con AcOEt. Los extractos argénicos combinados se lavaron con una disolución acuosa de Líel al 2% y salmuera, se secaron sobre Na~04 anhK:lro y se concentraron a presión reducida. La purificación cromatografica del residuo sobre gel de silíce, usando CH2CI2-MeOH 80:1 como eluyente,

1

proporcionó el compuesto 11 (108 mg, 87%) como un aceite incoloro. IR (NaCI) Vrna.Jcm-: 3284, 2978, 2226, 1720, 1427, 1241, 1152. RMN de ' H (300 MHz, MeOH-d 4) ~ (ppm): 7.64 (1 H, d, J = 1.5 Hz), 7.56 (lH, d, J = 2.0 Hz), 7.27 (IH, d, J = 2.0 Hz), 7.08 (1 H,dJ = 1.5 Hz), 2.47 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.41 (2H, t, J = 7.3 Hz), 1.85 (2H,

j

quint, J =7.2 Hz), 1.45 (9H, s). RMN de ' e (75 MHz, MeOH-d4) ~ (ppm): 174.4 (C), 145,0 (C), 140.6 (e), 132.9 (t, J = 254 Hz, e), 129.9 (eH), 126.4 (eH), 121.7 (C), 121.6 (eH), 118.4 (e), 118.2 (e), 117.6 (e), 111.6 (eH), 91.7 (C), 90.4 (C), 81.7 (C), 80.8 (e), 35.3 (eH2 ), 28.4 (eH3), 25.2 (eH2), 19.4 (eHú EMAR (TOF-MS) miz: calculado para e 22H,9F2N2Ü4 [M-Hj+ 413.1313, encontrado 413.1307.

ix) Preparación del 6-(7-(4-ciano-1H-pirrol-3-il)-2,2-difluorobenzo{d]{1,3]dioxol-5-il)hexanoato de terc-buti/o (12). Una mezcla del alquino 11 (80 mg, 0.193 mmol) y Pt02 (6.6 mg, 15% mol) en EtOH (3 mL) se purgó bajo una atmósfera de hidrógeno gas. A continuación, la presión de H2 se reguló a 35 psi y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción se diluyó con AcOEt (5 mL), se filtró a través de una capa de gel de silice que se lavó con AcOEt y los disolventes orgánicos se eliminaron a vacio proporcionando el éster 12 (84 mg, 98%) como un aceite. IR (Nael) vma.lcm·': 3283. 2933, 2224, 1724. 1367, 1235, 1151 . RMN de 'H (300 MHz. eDeh) ~ (ppm): 9.47 (IH, s), 7.47 (1 H, d, J = 1.5 Hz), 7.40 (IH, m), 7.28 (1 H, m), 6.79 (1 H, d, J =

1.5 Hz). 2.64 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.21 (2H, t, J = 7.4 Hz), 1.62 (4H, m), 1.42 (9H, s), 1.35 (2H, m). RMN de 13e (75 MHz, COCI3) l) (ppm): 173.5 (C), 143.8 (e), 139.1 (eH), 138.1 (e), 131.5 (t. J = 254 Hz, C). 127.6 (eH), 121.0 (eHI, 119.6 (eH). 118.6 (el, 116.6 (el, 115.8 (el, 107.9 (el, 91.6 (e). 80.2 (el, 35.6 (eH,I, 35.5 ¡eH,I, 31.1 (eH2), 28.38 (eH2). 28.0 (eH3). 24.9 (eHú EMAR (TOF-MS) miz: calculado para e n HZ3F2N2Ü4 [M-H] 417.1626. encontrado 417.1621.

x) Preparación del ácido 6-(7-(4-ciano-1H-pirro/-3-il)-2,2-difluorobenzo{d][1,3] dioxo/-5-i1)hexanoico (FDa6). Una disolución del éster terc-butilico 12 (85 mg, 0.20 mmol) en ácido fórmico puro (2.7 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. El ácido fórmico se eliminó a presión reducida. el residuo obtenido se disolvió en benceno y la mezcla se concentró de nuevo a sequedad. El residuo se disolvió en cloroformo (10 mL) y se lavó con salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na~04 anhidro y el disolvente se eliminó a presión reducida, obteniéndose el compuesto FDa6 (13) (64 mg, 0.18 mmol, 88%) como un sólido blanquecino. Pf 153.9-154.4 oC. IR (KBr) vm""'cm " : 3389, 1719, 1256, 1139. RMN de 'H (300 MHz, MeOH-di) l) (ppm): 7.54 (IH, d, J = 2.0 Hz),

7.45 (1 H, d, J = 1.6 Hz), 7.25 (IH, d, J = 2.0 H~~, 6.93 (IH, d, J = 1.6 Hz), 2.66 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.29 (2H, t, J =

7.4 Hz), 1.39 (2H. m). 1.64 (4H. m). RMN de C (75 MHz, MeOH-d.¡) l) (ppm): 177.7 (e), 145.2 (C), 140.8 (C).

139.2 (C), 132.9 (t, J = 252.5 Hz, e), 129.6 (eH), 122.4 (eH), 121.2 (eH), 119.2 (e), 118.0 (e), 117.8 (e), 108.8 (eH), 91.6 (e), 36.6 (eH2), 34.9 (eH21, 32.3 (eH2), 29.7 (eH2), 25.9 (eH2). EMAR (TOF-MS) mIz: calculado para e' SH'5F2N204 (M-Hr 361.1000, encontrado 361.0995.

Ejemplo 2: Sintesis de FDc6 (19) [radical de tipo T= R-II]

La síntesis del compuesto FDc6 (19) se describe en la Figura 2. Para su preparación se parte de fludioxonil y se inicia con la reducción del grupo nitrilo a formilo para obtener el aldehído 14, que es oxidado con clorita sódico al acido carboxilico 15. el cual es transformado en la amida 18 por reacción con el amino éster 17. previa activación del grupo carboxilato a través de su transformación en el correspondiente éster de succinimidilo. La síntesis de FDc6 (19) finaliza con la hidrólisis del grupo éster metílico de 18 con LiOH en medio acuoso.

A continuación se ilustran los detalles de la preparación y caracterización de este compuesto de fórmula general

(11.

i) PreparaCión del 4-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-4-il}-1H-pirrolo-3-carbaldehido (14). Una disolución 1M de DIBAL-H en tolueno (2.3 mL, 2.3 mmol) se añadiÓ gota a gota sobre otra disolución de fludioxonil (400 mg, 1.61 mrnol) en EhO anhidro (20 mL) a -600C bajo N2. La mezcla de reacción se agitó mientras se dejaba calentar a -30 OC en el transcurso de 1 hora y una vez alcanzada esta temperatura se mantuvo a la misma 30 minutos adicionales, entonces el baño frio se retiró y la reacción se agitó durante 1 h. Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se transfirió vía canula sobre una suspensión de gel de sílice (1.8 g) en agua (0.7 rnL) enfriada a OOC, y la mezcla se agitó a esta temperatura durante t h Y luego a temperatura ambiente por 1 hora adicional. Se añadieron K2e03 (2.68 g) Y MgS04 (2.68 g) sólidos y la agitación se continuó por otra hora, la mezcla se filtró a vacío y el filtrado y el disolvente de lavado se concentraron a sequedad dando lugar al aldehído 14 (371 mg, 92%) como un sólido, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Pf 143.7-146.1 oC. IR (KBr) vma:Jcm " : 3281, 3924, 1659, 1453, 1317, 1233, 1133, 1099, 1050, 762, 716. RMN de ' H (300 MHz, eDeh) l) (ppm): 9.93 (1H, s), 8.88 (IH, s ancho), 7.56 (IH, dd, J= 3.2, 2.2 Hz), 7.44 (IH, dd, J= 8.1, 1.2 Hz), 7.17 (1H, dd, J = 2.2, 2.2 Hz), 7.12 (1H, dd, J = 8.0, 8.0 Hz), 6.99 (IH, dd, J = 8.0,1.2 Hz). RMN de 13e (75 MHz, eDeb) l) (ppm): 185.6 (eH), 143.7 (e), 140.9, 131.4 (1, J = 254 Hz, ej, 128.5 (eH), 125.0 (eH), 123.8 (e), 123.4 (eH),

121.0 (eH), 117.4 (e), 117.2 (C), 107.9 (eH). EMAR (TOF-MS) miz: calculado para C12HaF2N03 [M++H] 252.0472, encontrado 252.0478.

ii) Preparación del ácido 4-(2,2-difluorobenzo[dJ[1,3}dioxol-4-il)-1H-pirrolo-3-carboxilico (15). Una disolución de NaCI02 (800 mg, 8.84 mmol) y NaH 2P04 ,H20 (1.129 g, 1.18 mmol) en agua (3.2 mL) y 2-metil-Z-buteno (836 mg,

1.26 rnL 11.92 mmol) se añadieron sucesivamente a una disolución de 14 (318.6 rng, 1.27 mmol) en terc-BuOH

(2.5 mL) enfriada a aoco El matraz de reacción se cerró herméticamente y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante loda la noche. La mezcla de reacción se vertió sobre agua y se extrajo con EI02. La fase elérea se extrajo con una solución 1 M de NaOH y se lavó con salmuera, se secó sobre MgS04 anhidro y se concentró dando lugar al aldehído de partida sin reaccionar 14 (29.9 mg, 9.4%). La capa acuosa se acidificó a pH 4-5 con acido citrico y se extrajo con Et02. Las fases organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgS04 anhidro y se concentraron a sequedad a vacío dando lugar al ácido 15

[268.1 mg, 84% (93% basado en el material de partida recuperado)] como un sólido con una pureza suficienle para ser utilizado en la siguiente etapa sin necesidad de purificación. Pf 188.0-189.0 °e. IR (KBr) vllliUfcm" : 3500-2500,3126,2885,1668,1535,1454,1241,1156,780,578. RMN de lH (300 MHz, DMSO-ds) i5 (ppm):

11.84 (1 H~ s ancho), 11.65 (1 H, s ancho), 7.47 (1 H, dd, J =2.7, 2.4), 7.25-7.14 (3H, m), 7.02 (IH, 1, J = 2.4, 2.4). RMN de ' e (75 MHz, DMSO-ds) i5 (ppm): 165.1 (e), 142.4 (e), 140.6 (C), 130.9 (1, J= 251 Hz, e), 125.5 (eH),

125.4 (eH), 123.3 (C), 120.1 (eH), 119.3 (e), 116.4 (C), 113.8 (e), 107.5 (eH). EMAR (TOF-MS) mIz: calculado para e 12H7F2N04 [M·-H]266.0265, enconlrado 266.0269.

iíi) Preparación de/6-(4-(2,2-difluorobenzo{d){1,3)dioxol-4-il)-1H-pirrolo-3-carboxamido)hexanoato de metilo (18). EtJN anhidra (409 ",l, 297 mg, 2.93 mmol) se añadió a una disolución del ácido 15 (206.5 mg, 0.773 mmol) y carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSe, 257 mg, 1.00 mmol) en e H3 eN anhidro (7 ml) a oae bajo nitrógeno y la mezcla se agitó a esta temperatura durante 2 h. El disolvente y el exceso de EtJN se eliminaron a presión reducida yel residuo se purificó por cromatografia de columna, eluyendo primero con eH2el2 y luego con eHeb,

dando lugar al ésler de succinimidilo intermedio 16 (250.6 mg, 89%). RMN de lH (300 MHz, eHeb) i5 (ppm); 9.59 (lH, s ancho), 7.65 (IH, dd, J =3.3, 2.1), 7.21 (IH, dd, J =8.1, 1.5 Hz), 7.02 (IH, dd, J =8.1, 8.1 Hz), 7.00 (1 H, dd, J = 3.3, 1.5 Hz), 6.94 (IH, dd, J = 8.1, 1.5 Hz), 2.86 (4H, s).

Una disolución del hidrocloruro del 6-amino-hexanoato metilo (17) (152.6 mg, 0.84 mmol) y EbN (129 I-lL, 93.5 mg, 0.924 mmol) en DMF anhidra (4 mL) se añadió a una solución del éster de succinimidilo 16 obtenido anteriormente (102 mg, 0.280 mol) en DMF (0.5 ml). la mezcla se agitó a temperatura ambiente por 4 h, se diluyó con agua y se extrajo con E120 . Los extractos orgánicos combinados se lavaron oon una solución acuosa al 2% de uel y salmuera y se secaron sobre MgS04 anhidro. La purificación cromatografica del residuo que quedÓ después de la evaporación del disolvente, utilizando eHeb como eluyente, proporcionó la amida 18 (99.5 mg, 90%) como un aceite. IR (KBr) vma./cm·' : 3335, 3131, 2947, 1736,1653,1603,1561,1458,1239,1144, 1110,771,726. RMN de de 'H (300 MHz, eDel3) i5 (ppm): 9.92 (lH, s ancha), 7.32 (IH, dd, J = 2.3, 2.3 Hz), 7.15 (IH, dd, J =7.9, 1.3 Hz), 7.06 (1 H, dd, J =7.9, 7.9 Hz ), 6.96 (1 H, dd, J =7.9, 1.3 Hz ), 6.90 (1 H, dd, J =2.4, 2.4 Hz), 5.66 (I H, t ancho, J= 5.5 Hz), 3.64 (3H, s), 3.30 (2H, dd, J= 12.9,7.0 Hz), 2.26 (2H, t, J= 7.4 Hz), 1.59 (2H, t, quint, J = 7.4 Hz), 1.45 (2H, m), 1.24 (2H, m). RMN de de '3e (75 MHz, eDel3) i5 (ppm ); 174.1 (C), 165.7 (C), 143.7(C), 141.0 (C), 131.3 (1, J =252 Hz, C), 124.7 (eH), 123.5(eH), 122.4 (C), 119.7 (eH), 118.3 (e), 118.2 (C),

114.6 (C), 107.7 (eH), 51.5 (eH3), 39.3 (eH2), 33.8 (eH2), 29.1 (eH2), 26.3 (eH2), 24.5 (CH2). EMAR (TOF-MS) miz: calculado para e 19H20F2N20 S [M+-H] 393.1262, encontrado 393.1258.

iv) Preparación del ácido 6-(4-(2,2-difluorobenzo{d){1,3}dioxoJ-4-il)-1H-pinolo-3-carboxamido)hexanoico (FDc6). Una solución del éster metílico 18 (112.5 mg, 0.285 mmol) en un mezcla de THF (2.3 ml) y H2Ü (0.95 ml) se trató oon LiOH'H20 (120.4 mg, 2.869 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 2.5 h. La mezcla de reacción se diluyó con H20 (20 mL) y se extrajo con éter etílico. la capa organica se descartó y la capa acuosa se evaporó bajo vacio para eliminar los restos de disolvente organico, después se enfrió en un baiío de hielo y se acidificó con una solución acuosa saturada de KHS04 hasta aproximadamente pH 3. El precipitado formado se filtró, se lavó con agua y se secó para dar el compuesto FDc6 (19) (96 mg, 88%) como un semisólido. IR (KBr) vm8J</cm·1: 3500-2500, 2936, 1712, 1654, 1605, 1544, 1453, 1235, 1149, 723. RMN de lH (300 MHz, THF-ds) i5 (ppm): 10.7 (1 H, s ancho), 7.42 (IH, dd, J = 8.1, 1.5 Hz), 7.17 (IH, dd, J = 2.7, 2.4 Hz), 7.04 (1 H, dd, J = 7.8, 7.8 Hz), 6.98-6.94 (2H, a dd solapado con otro dd de J =8.1, 1.2 Hz), 6.83 (1H, t ancho, J = 5.7 Hz), 3.25 (2H, dd, J = 12.9, 6.9 Hz), 2.21 (2H, t, J =7.5 Hz), 1.53 (4H, m), 1.35 (2H, m). RMN de De (75 MHz, TH F-ds) 6 (ppm): 174.7 (e), 165.9 (e), 144.4 (e), 141.6 (C), 132.5 (t, J = 253 Hz, e), 126.3(eH), 124.0 (eH), 122.1 (eH), 120.8 (e), 120.6 (eH), 120.4 (C) , 116.2 (C), 107.3 (eH), 40.0 (eH2), 34.3 (eH2), 30.6 (eH2), 27.7 (eH2), 25.8 (eH2). EMAR (TOFMS) miz: calculado para e18H19F2N20 S [M++H] 381.1262, encontrado 381.1260.

Ejemplo 3: Síntesis de FDn6 (22) [radical de tipo T= R-III]

La síntesis del oompueslo FDn6 (22) se describe en la Figura 3. Se utiliza fludioxonil como malerial de partida e implica una reacción de alquilación del nitrógeno pirrólico para formar el ester 21, transformación que se lleva a cabo por tratamiento de f1udioxonil con HNa y el bromo-ésler 20, seguido de hidrólisis del grupo éter ten:;-butílico de 21 que proporciona directamente FDn6 (22 ).

A continuación se ilustran los detalles de la preparación y caracterización de este compuesto de fórmula general (1).

i) Preparación del 6-(3-ciano-4-(2, 2-diffuorobenzo[d}[1,3}dioxol-4-il) -1 H-pirrol-1 -il)hexanoato de tere-butilo (21 ). Una disolución de f1udioxonil (93.4 mg, 0.38 mmol) en DMF seca (0.4 ml ) se añadió lentamente bajo nitrógeno sobre una suspensión de NaH prelavado con pentano (33 mg de una suspensión del 60% en aceite mineral, 0.82 mmol) en OMF (0.3 ml). Después de agitar a 2 h a temperatura ambiente, se añadió una disolución de Na l (15.2 mg, 0. 10 mmol) y 6-bromohexanoato de ten;-butilo (20, 142 mg, 0.56 mmol) en DMF (0.6 ml) y la mezcla se agitó por un periodO de 3 h, se vertió sobre agua y se extrajo con éter etílico. los extractos organicos combinados se lavaron con una disolución acuosa al 2% de Liel y salmuera y se secaron sobre MgS04. El disolvente se eliminó a vacío y el residuo se cromatografíó en gel de sílice, usando mezclas de hexano-AcOEt (dese 100:0 a 80:20) como eluyente. dando lugar al éster 21 {126 mg, 80%) como un aceite. IR (Nael) vm""/cm" : 3129,2977,2937,2222,1720,1651,1552,1527,1455,1244, 1152, 1033,920.763.721. RMN de ' H (300 MHz, CHCI3) 6 (ppm): 7.70 (1 H, dd, J =8.1, 1.1 Hz), 7.25 (IH, d. J =2.3 Hz), 7.14 (1H, d, J =2.3 Hz), 7.12 (1 H, dd, J = 8.1, 8.1 Hz), 6.95 (IH, dd. J =8.1, 1.1 Hz), 3.95 (2H, 1, J =7.5 Hz), 2.22 F H, 1, J =7.5 Hz), 1.84 (2H, quint, J =

7.4 Hz), 1.63 (2H, quint, J= 7.2 Hz), 1.42 (9H, s), 1.35 (2H, m). RMN de le RMN de (75 MHz, eHeb) 6 (ppm):

172.6 (C), 143.7 (e), 139.7 (e), 131.3 (t. J= 255 Hz, C), 129.5 (eH), 124.0 (eH), 122.3 (CH), 121.2 (eH), 118.5 (e), 116.5 (C), 116A (C), 107.7 (eH), 91.0 (e), 80.2 (C), 50.4 íeH2), 35.1 (eH2), 30.7 (eH2), 28.0 (eH3), 25.8 (eH2), 24.3 (eH2). EMAR (TOF-MS) mIz: calculado para e 22H25F2N204 [M+Hf 419.17824, encontrado

419.1 7864.

ii) Preparación del ácido 6-(3-ciano-4-(2,2-difluorobenzo[d}[1,3]dioxo/-4-il)-1H-pirro/-1-il)hexanoico (FOn6). El éster len;-butilico 21 (87 mg, 0.0.21 mmol) se disolvió en acido fórmico (2 ml) a ooe y la disolución resultante se agitó a 0-4~C durante 30 mino La mezcla se diluyó con benceno y se concentró a sequedad (temperatura del baño no superior a 40<><:). El residuo obtenido se disuelve en benceno y la mezcla se concentra de nuevo a sequedad, obteniéndose el compuesto FDn6 (22) (72 mg, 96%) como un sólido blanco. IR (K8r) vmax/cm" : 35002500.3136.2943,2220,1705,1549,1525.1258.1133,762, 71B. RMN de'H (300 MHz, CHCI3) 6 (ppm ): 11.2 (I H, s ancho), 7.71 (IH, dd, J = B.l, 1.0 Hz), 7.24 (IH, d, J =2.3 Hz), 7.15 (IH, d, J = 2.3 Hz), 7.13 (I H, dd, J = 8.1, 8. 1 Hz), 6.96 (I H, dd, J =8.1, 1.0 Hz), 3.97 (2H, t, J =7.1 Hz), 2.39 (2H, t, J =7.0 Hz), 1.87 (2H, quint, J =

7.3 Hz), 1.70 (2H. quint, J =7.2 Hz), 1.39 (2H, m). RMN de '3e (75 MHz, CHCI3) 6 (ppm): 179A (C), 143.8 (C),

139.7 (C), 131.3 (1, J= 255 Hz, e), 129.5 (eH), 124.0 (eH), 122.3 (eH), 121.2 (eH), 118.6 (e), 116.5 (e), 116.4 (C), 107.7 (eH), 91 .0 (C). 50A (eH2), 33.6 (eH2), 30.6 (eH2), 25.8 (eH2), 23.9 (eH2). EMAR (TOF-MS) miZ'. calculado para C'BH'7F:,N~04 [M+HJ+ 363.1156, encontrado 363.1151.

1.2. Activación de los compuestos de fórmula (1)

Los ejemplos de compuestos de fórmula (1) aquí presentados contienen un grupo carboxilo como grupo químico funcional para su conjugación a proteínas portadoras, concretamente por reacción con los grupos amino libres de la proteína. El grupo carboxilo se activó utilizando carbonato de N,N"-disuccinimidilo (OSe¡ siguiendo protocolos previamente publicados [FA Esteve-Turrillas et al., Anal. Chim. Acta 2010, 682, 93-103]. En concreto, se disolvió 0.082 mmol del correspondiente compuesto de fórmula (1) y 0.14 mmol de OSC en 0.8 mL de acelonitrilo seco en atmósfera de nitrógeno. A continuación, se añadió 0.31 mmol de EbN y se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La disolución se diluyó en cloroformo, se lavó con una disolución saturada de NaHC03 y salmlJera y se secó con Na:<.804 anhidro. Después de evaporar el disolvente, el residuo restante se purificó por cromatografia en columna, usando cloroformo como eluyente, obteniéndose el éster de N-hidroxisuccinimidilo del compuesto de fórmula (1) en forma pura.

1.3. Conjugación de los compuestos de fórmula (1) a proteínas para obtener compuestos de fórmula (11)

Tampones y disoluciones: PB: Tampón fosfato sódico 100 mM, pH 7A: PBS: Tampón fosfato sódico 10 mM, pH 7A con NaCI140 mM: PBST: Tampón PBS conteniendo 0.05% (vlv) de polioxietilen (20) sorbrtan monolaurato (conocido como Tween 20):

es: Tampón carbonato sódico 50 mM, pH 9.6; Disolución de lavado: N.aC1150 mM conteniendo 0.05% (vlv) de Tween 20.

Los analilos se disolvieron en N,N-dimetilformamida (DMF) anhidra y se almacenaron a -20GC.

Los compuestos de fórmula (11) se prepararon como se esquematiza en la Figura 4, según los procedimientos siguientes.

1.3.1. Compuestos de fórmula (11 ) donde P es BSA

A 2.0 mL de una disolución de 15 mg/rnL de proteína albúmina de suero bovino (BSA) en tampón CS se añadió gola a gola 200 ~L de una disolución 50 mM de compuesto de fórmula (1) activado, obtenido lal como se indica en el apartado 1.2, en DMF. La reacción se llevó a cabo durante 2 h a temperatura ambiente con agitación suave ya continuación, el compuesto de fórmula (11) se purificó por cromatografia de exclusión molecular en Sephadex G-25 usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación, n tal como se describe en el compuesto de fórmula (11), medido espectrofotométricamente fue de 14, 15 Y 17 para FDa6, FDc6 y FDn6, respectivamente.

1.3.2. Compuestos de fórmula (11 ) donde P es OVA

A 2.0 mL de una disolución de 15 mglmL de proteína albúmina de huevo (OVA) en tampón CB se añadió gota a gota 200 tJL de una disolución 34 mM del compuesto de fórmula (1) activado, obtenido tal como se indica en el apartado 1.2, en OMF. La reacción se llevó a cabo durante 2 h a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación, el compuesto de fórmula (11) se purificó por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G25 usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación, n tal como se describe en el compuesto de fórmula (11), medido espectrofotométricamente fue de 7, 6 Y 8 moléculas para FOa6, FDc6 y FDn6, respectivamente.

1.3.3. Compuestos de fórmula (U) donde P es HRP

A 1.0 mL de una disolución de 2.2 mglmL de proteína peroxidasa de rábano picante (HRP) en tampón CB se añadió gota a gota 100 tJL de una disolución 5 mM de compuesto de fórmula (1) activado, obtenido tal como se indica en el apartado 1.2, en OMF. La reacción se llevó a cabo durante 2 h a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación, el compuesto de fórmula (11) se purificó por cromatografia de exclusión molecular en Sephadex G-25 usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación, n tal como se describe en el compuesto de fórmula (11), medido espectrofotométricamente fue de 6, 2 Y 4 para FOa6, FDc6 y FDn6, respectivamente.

2.

Inmunización de conejos

Se inmunizaron, siguiendo protocolos estandarizados, 2 hembras de conejo blancas de la raza New Zealand con cada compuesto de fórmula (11) donde P es BSA obtenido tal como se describe en el apartado 1.3.1. (C. SuárezPanta[eón et al., J. Agric. Food Chem. 2010, 58. 6502-8511J. Cada animal recibió 0.3 mg de uno de los compuestos de fórmula (11) disuelto en 1 mL de una mezcla 1:1 de tampón PB y adyuvante de Freund completo. La inmunización prosiguió con la inoculación de una dosis de recuerdo cada 21 días con la misma cantidad de conjugado pero empleando adyuvante de Freund incompleto. Diez días después de la cuarta inyección, los animales fueron desangrados y la sangre ob1enida se dejó coagular a 4"C durante toda la noche. Al día siguiente, se recuperaron los sueros por centrifugación, se diluyeron a 'h con PBS frío y se les añadió un volumen de una disolución saturada de sulfato amónico. El precipitado proteico resultante de cada suero se recogió por centrifugación y se redisolvió en tampón PBS frío. Finalmente, las proteínas se reprecipitaron como anteriormente y se almacenaron en este estado a 4"C. Este precipitado contiene una mezcla indeterminada de proteinas que denominamos antisuero, anticuerpo policlonal o simplemente anticuerpo. Se obtuvieron dos anticuerpos de cada compuesto de fórmula (11) donde P es BSA, identificados como #1 y #2.

3.

Procedimiento ELISA

Se emplearon placas de poliestireno de 96 pocillos . Cada anticuerpo se evaluó en los dos formatos clásicos de EUSA competitivo (el de antígeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta y el de anticuerpo inmovilizado con detección directa) usando tanto antígenos de ensayo homólogos, es decir un antígeno de ensayo a partir del mismo compuesto de fórmula (1) que el utilizado para obtener el inmunÓQeno; como antígenos de ensayo heteról090s, es decir obtenidos a partir de un compuesto de fórmula (1) diferente al empleado para obtener el inmunógeno. Se emplearon pipetas electrónicas de 8 canales para la dispensación rapida y precisa de los inmunorreactivos. Después de cada etapa de incubación, las placas se lavaron cuatro veces con una disolución de lavado, usando un lavador de 96 canales ELx405 (Biotek Instruments, Winooski, EE .UU.). La actividad peroxidasa usada como marcador se reveló con 100 IJL por pocillo de una disolución 2 mg/mL de o· fenilendiamina en tampón citrato 25 mM, fosfato 62 mM, pH 5.4 conteniendo 0.012% (vfv ) de H20 2. Este revelado se desarrolló durante 10 min a temperatura ambiente y se paró usando 100 IJl por pocillo de H2S04 2.5 M. Al finalizar los ensayos, la absorbancia de cada pocillo se leyó a 492 nm usando una longitud de onda de referencia de 650 nm en un lector de microplacas PowerWave HT (Biotek Instruments, Winooski, EE.UU.). Las curvas palrón sigmoideas obtenidas al representar la absorbancia frente a la concentración de ana lito se ajustaron a una ecuación logistica de cuatro parametros usando el paquete informatico SigmaPlol de SPSS (Chicago, EE,UU.). El título del anticuerpo se definió como el recíproco de la dilución del anticuerpo que proporciona una señal maxima (Am",) alrededor de 1.0 en ausencia de analito libre en ensayo de ElISA competitivo en el formato de conjugado inmovilizado homólogo a 0.1 mglmL con detección indirecta. La afinidad del anticuerpo (le so) se estimó como la concentración de analito libre capaz de reducir a la mitad la señal maxima.

3.1. Ensayos ELlSA competitivos en formato de antígeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta (ensayo indirecto)

Las placas se tapizaron con 100 IJL por pocillo de una disolución de antígeno de ensayo que es un compuesto de fórmula (11) donde P es OVA a 0.01 o a 0.1 IJg/mL en tampón CS por incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas, en cada columna se dispensó 50 IJL por pocillo de una curva estandar completa del analito en PSS seguido de 50 IJL por pocillo de una dilución concreta de un determinado anticuerpo en PSST. La misma distribución de reactivos se repitió para cada placa con un antigeno de ensayo diferente. La reacción inmunoquímica se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron las placas. A continuación, cada pocillo recibió 100 IJL de una dilución 1/104 de GAR-HRP en PSST conteniendo 10% de suero bovino fetal. Esta reacción se dejó a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar las placas. se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha descrito anteriormente.

3.2.

Ensayos ELlSA competitivos en formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa (ensayo directo)

Las placas se tapizaron con 100 IJL por pocillo de una dilución de anticuerpo en tampón CS por incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. DespuéS de lavar las placas, en cada columna se dispensó 50 IJL por pocillo de una curva estándar completa del analito en PSS seguido de 50 IJL por pocillo de una dilución concreta en PSST de un trazador enzimatico determinado que es un compuesto de fórmula (11) donde Pes HRP. La misma distribución de reactivos se repitió para cada placa con un anticuerpo diferente. La reacción inmunoquímica se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron las placas. Finalmente, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha descrito.

4.

Resultados

4.1. Respuesta inmune

Los tres inmunógenos produjeron respuestas inmunes semejantes y equivalentes. con títulos entorno a 3x104 (Figura 5).

4.1.1. Determinación de la afinidad de los anticuerpos

Cada uno de los anticuerpos obtenidos se ensayó frente a su antígeno de ensayo homólogo usando el ensayo de tipo ELlSA competitivo, tanto en formato de ensayo de antígeno inmovilizado con detección indirecta como en el formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa. Se ensayaron diferentes concentraciones de anlígeno de ensayo frente a diferentes concentraciones de anticuerpo en ensayo competitivo utilizando como competidor diferentes concentraciones de f1udioxonil preparadas por dilución seriada. Un anticuerpo procedente de un animal inmunizado con un inmunógeno de FDa6 (rFDa6#2) y un animal inmunizado con uno de FDn6 (rFDn6#1 ) produjeron anticuerpos cuyos ensayos presentaron una buena sensibilidad para f1udioxonil. En cambio los anticuerpos obtenidos a partir del inmunógeno de FDc6 presentaron una muy baja afinidad por f1udioxonil. Este resultado confirma que unas estructuras son más idóneas que otras para el objetivo que se persigue y demuestra la dificultad para predecir la posición óptima de funcionalización de los compuestos de fórmula (1). Los valores de la señal maxima. de la ICso y de la pendiente de la curva de inhibición resultante para cada anticuerpo con antígeno de ensayo homólogo y heterólogo se han incluido en las Tablas 1 (a-e) y las Tablas 2 (a-e).

Como se desprende de los resultados obtenidos en los ejemplos ilustrados. los inmunógenos preparados con los compuestos de fórmula (1) con radical R-I o R-III proporcionaron anticuerpos de mayor afinidad para f1udioxonil. Por el contrario, el inmunógeno con radical de tipo R-II proporcionó anticuerpos de menor afinidad hacia dicho fungicida.

Resultado de los ensayos en formato ElISA competitivo de antígeno inmovilizado con detección indirecta: Tabla 1a

OVA-FDa6

Conjugado Título Ac. Anticuerpo (1:!9/mL) (xl03¡ ~ Pendiente IC50 (nM) rFOa6#1 0.1 30 0.85 0.58 653.7 rFOa6#2 0.1 30 1.21 0.61 24.0 rFDc6#1 1.0 10 1.03 0.41 225.5 rFOc6#2 1.0 3 1.12 0.81 1467.1 rFOn8#1 1.0 3 rFOn6#2 1.0 10 0.81 0.60 899.4

Tabla 1 b

OVA-FDc6

Conjugado Título Ac.

Anticuerpo (1:!9/mL) (xl0J ¡ ~ Pendiente le so (nM) rFOa6#-1 1.0 3 rFOa6#2 1.0 10 1.01 1.07 48.5

rFDc6#l 0.1 300 1.13 0.68 1405.7

rFDc6#2 0.1 100 0.81 0.58 1329.4 rFOn6#1 1.0 3 rFOn6#2 1.0 3

Tabla l e

OVA-FDn6

Conjugado Título Ac. Anticuerpo (1:!5!lrnll (xl03¡ Am~ Pendiente IC50 (nMI rFOa6#1 1.0 3 rFOa6#2 0.1 3 1.02 0.90 98.9

rFDc6#1 1.0 10 0.00 0.55 88.1 ó'Dd3#2 1.0 10 0.77

rFOn6#1 0.1 30 1.14 0.53 73.2 rFOn6#2 0.1 100 0.86 0.38 92.4

ES2 461415 Bl

Resultado de los ensayos en formato ElISA competitivo de anticuerpo inmovilizado con detección directa:

Tabla 2a

HRP-FOa6

Trazador

Título Ac.

Anticuer~

(ngfmL) (x103 ) A~ Pendiente le so (nM)

rFDa6#1

10 3 1.04 0.65 75.0

rFDa6#2

3 10 0.82 0.82 100.6

rFDc6#1

100 3 1.18 0.52 296.9

rFDc6#2

100 3 0.59 0.65 436.2

rFOn6#1

100 3

rFDn6#2

100 3 0.78 0.93 118.3

Tabla 2b

HRP-FDc6

Trazador

Título Ac.

Antjcuer~

(ngfmL) (x10J ) A~ Pendiente le so (nM)

rFDa6#1

100 3

rFDa6#2

100 3

rFDc6#1

3 3 1.07

rFDc6#2

10 3 1.75

rFDn6#1

100 3

rFDn6#2

100 3

Tabla 2e

HRP-FDnS

Trazador Título Ac. AnticuerE!2 (n9/rnll (x103¡ Am~ Pendiente leso (nM) rFDa6#1 100 3 rFDa6#2 10 3 1.11 0.75 36.4 rFOc6#1 100 3 0.75 0.57 77.6 <FDdl#2 100 3 rFDn6#1 3 10 0.78 0.61 16.7 rFDn6#2 3 3 1.00 0.57 454.6

5

En la Figura 6 se muestra la curva de inhibición obtenida en el formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa cuando el pocillo se tapizó con 100 IJL de una dilución del anticuerpo rFDn6#1 a 1/104 yen la etapa competitiva se usó 0.3 ng de compuesto homólogo de fórmula (11) donde P es HRP que es un trazador enzimático.

10

Claims (29)

1. Un compuesto de fórmula (1):

T-L-Y

(1) caracterizado porque T se selecciona del grupo que consiste en R~, R-II Y R.III;

imagen1

R-I R-III

R-II

donde

R-I se selecciona del grupo que consiste en

(4-(4.o8n0-1 H-plrrol-3-U)-2,2.-diftuorobenzo[d][1 .3)dloxol-5-lIo], 15 [7-( 4-ciano-1 H-pirrol-3-iI)-2,2 -difluorobenzo[d][1,3)dioxol-5-ilo] y [7.( okiano-1 H-pirrol-3-il)-2,2-difluorobenzo(d][1 ,3]dioxol-4-ilo]; R..JI es [4-(2,2-difluorobenzo[d)[1 ,3)dioxol-4-il)-1 H-pirrol-3-ilo1: R-l1I es (3-dan0-4-(2,2-difluorobenzo[d](1 ,3Jdioxol-4-il)-1 H-pirrol-1 ·ilo]; l es una cadena hidrocarbonada de O a 40 atomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada 20 o ¡nsaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 10 heteroátomos que se seleccionan del

grupo que consiste en S, O y N; e

y es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en: -COOH, -NH2, -N3, -CH2Br, -CH21, -C=:CH,

-CHO, -SH, -S03H, -OS02Ar y -NH-NH2;

con la condición de que: 25 a) cuando T es [3-cian0-4-(2,2-difluorobenzo(dl[1.3]dioxol-4-il)-1H-pirrol-1-ilo], L es una cadena lineal hldrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, b) cuando T es (3-cian0-4-(2,2-difluorobenzo(dJ(1,3]dioxol-4-il)-1H-pirrol-1-iIo) e Y es COOH, l es una cadena hidrocarbonada de 4 a 40 átomos de carbono, e) cuando T es (4-(2,2-difluorobenzo(d)(1 ,3]dioxol-4-il)-1 H-pirrol-3-ilo] e Y es COOH, l es una cadena 30 hidrocarbonada de 1 a 40 álomos de carbono.

2. Un compuesto de fórmula (1) según la reivindicación 1, caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de cartJono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heteroálomos seleccionados del grupo que consiste en O y N.

35

3.

Un compuesto de fórmula (1) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores. caracterizado porque Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -C=:CH. -NH2 y -SH.

4.

Un compuesto de fónnula (I) según una cualquiera de tas reivindicaciones anteriores, caracterizado porque T

40 se selecciona del grupo que consiste en

(4-( 4-dan0-1 H-plrrol-3-il)-2.2-difluorobenzo(dJ( 1 ,3)dioxol-5-ilo),

(7-( 4-dan0-1 H-pirrol-3-il)-2.2-difluorobenzo(dl(1 ,3Jdioxol-5-ilo) y

(7-( 4-dan0-1 H-pirrol-3-il)-2 .2-difluorobenzo(d](1 ,3Jdioxol-4-ilo);

l es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 8 átomos de carbono y dicha cadena comprende entre O y 4

45 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -C:CH, -NH2 y -SH.

5. Un compuesto de fórmula (1) según la reivindicación 4, caracterizado porque es

ES 2 461415 Bl

F\_O

F'1 (1 ~ CN

(CH,),CO,H

6. Un compuesto de fórmula (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque T es (4-(2,2-difluorobenzo(d](1 ,3]dioxol-4-il)-1 H-pirrol-3-ilo): L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 8 átomos de

5 carbono y dicha cadena comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; e y se selecciona dentro del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -C=CH, -NH2 y -SH.

7. Un compuesto de fórmula (1) según la reivindicación 6, caracterizado porque es

H

F5r°' ACONH(CH,),CO,H

0-0 .

10

8. Un compuesto de fórmula (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque T es [3-ciano4-(2,2.(jifluorobenzo(d)[1 ,3)dioxoI4.il)-1H-pirrol-1-i101; l es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 a 8 átomos de carbono y dicha cadena comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste

15 en Q y N; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en -CQQH, -CHQ, -C:::CH, -NH2 y -SH.

9. Un compuesto de fónnula (1) según la reivindicación 8, caracterizado porque es

(CH,),CO,H

F5r°' ACN

0-0

20

10. Un compuesto de fórmula (11): [T-L-Z)n-P

(11)

caracterizado porque 25 T se selecciona del grupo que consiste en R..J, R-II Y R-III;

H H

, ,

e1::¿~ e~ ~\

-

R~I!

R~ R-I! donde R..J se selecciona del grupo que consiste en

[4-(4-ci ano-1 H-pirrol-3-il)-2,2-diftuorobenzo(d)[1 ,3]dioxol-5-ilo],

30 [7-(4-ciano-1 H-pirrol-3-il)-2,2-diftuorobenzo(d)(1 ,3Jdioxol-5-ilo) y [7 -(4-ci ano-1 H-pirrol-3-ilo )-2 ,2-difluorobenzo[d1l1 ,3Jdioxol-4-ilol; R..JI es (4-(2,2-difluorobenzo(d]( 1 ,3Jdioxol-4-il)-1 H-pirrol-3-ilo]; R..JII es [3-cian0-4-(2,2-diftuorobenzo(d){1 ,3]dioxol-4-il)-1 H-pirrol-1-ilo];

ES 2 461415 Bl

l es una cadena hidrocarbonada de O a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada

o ¡nsaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 10 heteroétomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O Y N; Z es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-,

5 -OCONH-, -NHOCO-. -QCSNH-, -SCONH-, -S-, -5-5-, -NH(C=NH)-, -OCO-, -CQ-, -CHOH-, -N=N-, -NH-, -NR-, "S'G0 y N .

".. N'" 'N/ ' N

)=f

10 O

P es un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor de 2000 daltons; y n es un número con un valor entre 1 y 500.

11. Un compuesto de fónnula (II) segun la reivindicación 10, caracterizado porque L es una cadena

15 hidrocarbonada lineal de O a 20 álomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N.

12. Un compuesto de fórmula (11) segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11 , caracterizado porque Z

se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-. O Y ,..:N, / 20 /s~ N' N

~N-)=i

O

25 13. Un compuesto de fórmula (11) segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque P se selecciona del grupo que consiste en albumina, tiroglobulina, hemocianina, Il-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.

14. Un compuesto de fórmula (11) segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque

30 T se selecciona del grupo que consiste en 14·(4-ciano..1 H-pirrol·3-i 1}·2,2-difluorobenzo[d][1 ,3Jdioxol·5-iloJ, (7-(4-ciano..1 H-pirrol-3-i 1)-2 ,2-difluorobenzo[ d)[1 ,3Jdioxol-5-iloJ y (7-(4-ci ano-t H-pirrol-3-i 1)-2 ,2-difluorobenzo[ d)[1 ,3Jdioxol-4-iloJ; L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende

35 entre O y 4 heleroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; 0

Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, y

'G

/S N

imagen2

40 O

P se selecciona del grupo que consisle en albumina, tiroglobulina, hemocianina, /3-galactosidasa, peroxidasa, fosfalasa y oxidasa.

45 15. Un compuesto de formula (11) segun la reivindicación 14, caracterizado porque es

~

F\/O " IF"1 1 ~ eN

(eH,),-eONH P n donde P se selecciona del grupo que consiste en albumina o peroxidasa, y n es un valor seleccionado entre 1 y

50. 50

16. Un compuesto de fórmula (11) segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque T es [4-(2,2-difluorobenzo[d1l1 ,3Jdioxol-4-il)-1 H-pirrol-3-ilo); L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 álamos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N;

55

ES 2 461415 Bl

0

Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -8-,

/80. Y

'--iN

imagen2

5

O

P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, ,6-galactosidasa, peroxidasa, fostatasa y oxidasa.

10 17. Un compuesto de formula (11) según la reivindicación 16, caracterizado porque es

,\~ t~",m-',

O f 'l

n

donde P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa, y n es un valor seleccionado entre 1 y

50. 15

18. Un compuesto de fórmula (11) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque T es [3-ciano-4-(2,2-difluorobenzo[dJ[1 .3]dioxol-4-il)-1 H-pirrol-1-iloJ; l es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heleroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; O N

N9

20 Zse selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -5-, ...... 50. Y 'N/; Y '--iN )=f

-

O

25

P se selecciona del grupo que consisle en albúmina, liroglobulina, hemocianina, ¡3-galadosidasa, peroxidasa, fosfalasa y oxidasa.

19. Un compuesto de formula (11) según la reivindicación 18, caracterizado porque es

30

imagen2

donde P se selecciona del grupo que consiste en albúmina o peroxidasa y n es un valor seleccionado entre 1 y

SO.

35 20. Un compuesto de fórmula (111):

[T-L-Zlm-Q

(11')

caraderizado porque T se selecciona del grupo que consiste R-I, R-II Y R-III;

40

ES 2 461415 Bl

H, H, T

FJr° CN ~ >" FJr° CN

'~ F1;'' 0~_~

° ~ ~ ° ~ ~

'"tf

--1

R~II

R~ R-II donde R-I se selecciona del grupo que consiste en [4-( 4-ciano-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzoldIl1 ,3)dioxol-5-ilo1,

5 [7-(4-ciano-1 H-pirrol-3-i 1)-2.2 -difluorobenzo[dIl1 ,3Jdioxol-5-iloJ y [7-(4-ciano-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzo[dJ(1 .3)dioxol-4-ilo): R-II es [4-(2,2-difluorobenzold][1,3Idioxol-4-il)-1 H-pirrol-3-ilo]: R-111 es [3-ciano-4-(2 ,2-difluorobenzo[dJ[ 1 ,3)dioxol-4-il)-1 H-pirrol-1-ilo]; l es una cadena hidrocarbonada de O a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada

10 o ¡nsaturada. y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S. O y N; Z es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -N HCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -5-S-, -NH(C=NH)-, -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N .. N-,

-NH-, -NR-, ~a y N

rN9

15 /5 'N/

N-

a

Q es un marcaoor no ISOlOpICO; y 20 m es un numero entero con un valor entero entre 1 y 1000.

21. Un compuesto de fórmula (111) según la reivindicación 20, caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N.

25

22. Un compuesto de fÓrmula (111) segun una cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21. caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -5-, /s~o y N9N' N/

'--iN-r

30

a

23. Un compuesto de fórmula (111) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluorescelna o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de

35 cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumanna, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de aendinio, nanopartrculas cuánticas, y micro-o nanoparticulas de oro coloidal, de carbón o de látex.

24. Un compuesto de fórmula (111) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque

40 T se selecciona del grupo que consiste en [4-(4-cian0-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzo[d1l1 ,3)dioxol-5-iI01, [7-( 4-oan0-1 H-pirroi-3-i 1)-2,2-difluorobenzold][ 1 ,3)dioxol-5-ilo] y [7-( 4-oan0-1 H-pirrol-3-i 1)-2,2-difluorobenzoldlI1 ,3)dioxol-4-ilol; L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbooo y dicha cadena hidrocarbonada comprende

45 entre O y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; O N Z se selecciona del grupo que consiste en -CaNH-, -NHCa-, -NH-, -S-, /S~N_ y )~t/;y

a

50

Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluorescelna o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianína, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera

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de sus derivados, un éster de acridinio, nanopartículas cuánticas, y micro-o nanopartícutas de oro coloidal, de carbón o de látex.

25. Un compuesto de fórmula (111) segun una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque T es [4-(2,2-difluorobenzo[d)[1,3)dioxol-4-il)-1H-pirrol-3-ilo); L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre Oy 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N;

9N'N/

Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCQ-, -NH-, -S-, Y N ; Y

r

Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluor6foro de cianina, un fluoroforo de rodamina. un f1uoroforo de cumarina. un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio, nanoparticulas cuánticas, y micro-o nanoparticulas de oro coloidal, de carbón o de látex.

26.

Un compuesto de fórmula (111) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque T es [3-cianQ-4-(2,2-difluorobenzo[dJ[1 ,3)dioxol-4-il)-1 H-pirro¡'1-ilo); L es una cadena hidrocarbonada lineal de O a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 4 heleroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,

Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluorescerna o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de tianina, un ftuoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio. luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio, nanopartrculas cuánticas, y micro o nanopartrcutas de oro coloidal, de carbón o de látex.

27.

Un anticuerpo generado en respuesta a un compuesto de fórmula (11) tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19.

28.

Método de análisis in vitro de fludioxonit en una muestra que comprende las siguientes etapas:

a.

poner en contacto la muestra con el anticuerpo descrito en la reivindicación 27;

b.

incubar la muestra y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoqulmica; y

c.

determinar la existencia de reacción inmunoqulmica tras la incubación del paso (b).

29.

Método de análisis de fludioxonil según la reivindicación 28, caracterizado porque la determinación de la reacción inmunoquimica en el paso (c) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un compuesto de formula (11) tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19.

30.

Método de análisis de fludioxonil según la reivindicación 28, caracterizado porque la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un compuesto de formula (111) tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26.

31.

Kit de detección de fludioxonil, que comprende al menos un anticuerpo tal como se define en la reivindicación 27 junto con un compuesto de fórmula (11) tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 o un compuesto de fórmula (111) tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26.