CN104955832A - 在3位具有羧烷基取代的睾酮及其在制备用于测定生物学样品中的睾酮浓度的标记的类固醇中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)的睾酮衍生物：

Description

在3位具有羧烷基取代的睾酮及其在制备用于测定生物学样品中的睾酮浓度的标记的类固醇中的用途
技术领域
本发明涉及检测生物学样品中的睾酮的领域。具体地，本发明涉及特别可用于免疫测定的衍生自睾酮的新化合物，其制备方法，以及其在测定睾酮中的用途。
背景技术
通常称作睾酮的17β-羟基雄甾-4-烯-3-酮是人中的主要雄激素。其由睾丸中的Leydig细胞在垂体激素：LH(黄体生成素)的影响下分泌。
睾酮大部分结合至转运蛋白循环，主要是SHBG(性激素结合球蛋白)和白蛋白。游离睾酮相当于总睾酮的1-2％(Litwack G.,1992)。
具有原子编号的睾酮的结构式如下所示。
在人中，睾酮在精子发生、外生殖器的成熟、第二性征(胡须、阴毛和腋毛)和蛋白合成代谢中发挥作用。因此，测定人中的睾酮使得可以评价睾丸类固醇合成功能。认为3.2ng/ml以上的血清睾酮水平为正常，低于2ng/ml的水平使得能诊断身体的性腺机能减退或女性化。人中正常值的上限为8-9ng/ml。
在女性中，睾酮由卵巢和肾上腺少量分泌。其主要产生自前体(特别是雄烯二酮)的外周转化。因此，测定女性中的睾酮使得能探索雄激素分泌。高水平的睾酮可能与多囊卵巢综合征、卵巢或肾上腺肿瘤、肾上腺增生或者特发性多毛症相关。
几种方法可用于定量生物学样品中的睾酮。这些方法可以分为2个主要的组：
(1)质谱(MS)
这种分析技术允许测定所分析的化合物的分子量以及鉴定和定量它们。应用于复杂混合物如生物流体，其需要结合允许降低复杂性的分离技术。最常用的是气相色谱(GC)或液相色谱(LC)。串联质谱(MS/MS)组合2个分析仪。第一分析仪中选择的离子化合物在第二分析仪中更细致地分析。这种双重分析使得可以显著增加方法的特异性。因此，可以通过组合分离技术和MS技术的几种方法测定睾酮：
-同位素稀释气相色谱-质谱(ID-GCMS)(Moneti G.,et al.,1987；Wudy,S.A.,et al.,1992)。
-同位素稀释液相色谱-串联质谱(ID-LC-MS/MS)(Thienpont L.,et al.,2008)。
(2)用标记的免疫测定
也称作免疫学测定或免疫化学测定的免疫测定方法包括待检测的分析物睾酮与至少一种第一化合物之间的免疫学反应，所述第一化合物是这种分析物的结合配对物。因为睾酮测定通过竞争进行，所述方法还包括另一化合物，其与待测定的睾酮竞争，并且是睾酮衍生物。因此将两种化合物之一标记用于可视化。这种标记的化合物称作标记的缀合物。
当然，术语“免疫”，例如在“免疫测定”中，在本申请中并不认为严格表示结合配对物是免疫学配对物如抗体。事实上，当也称作配体的结合配对物不是免疫学配对物，而是例如待测定的分析物的受体时，本领域技术人员也广泛使用这个术语。因此，术语ELISA(酶联免疫吸附测定)往往用于使用非免疫学结合配对物的测定，在英语中更一般称作“配体结合测定”，而术语“免疫”包括在首字母缩略词ELISA中。为了清晰，申请人在整个申请中对使用结合配对物的任何测定均会使用术语“免疫”，甚至当其不是免疫学配对物时也是如此。
根据使用的标记的缀合物的类型和这种缀合物可以产生的信号的类型，三种类型的免疫测定之间产生区别：
-放射性同位素免疫测定(RIA)(Cekan,S.Z.,1979)，其之前可以是分离技术如高效液相色谱(Ueschiba,H.et al.,1991)，
-免疫酶促测定或EIA“酶联免疫测定”。根据所选的酶底物，我们可以具有比色信号(ELISA)(Rassasie,M.J.,et al.,1992)、荧光信号(ELFA)或化学发光信号(CLIA)(Stabler T.V.,et al.,1991)。
-电化学发光免疫测定(Owen,W.E.,et al.,2010)。
因此最后两种类型的免疫测定称作非放射性同位素免疫测定。
20世纪60年代RIA方法的开发使类固醇的定量发生变革。那时使用的示踪剂为放射性睾酮衍生物(3H或125I)如标记的睾酮-3-(O-羧甲基)肟(或睾酮-3-O-CMO)(Cook B.and Beastall G.H.,1987)。但是，这些方法具有显著缺点，放射性废物的处理和标记的试剂相对较短的半衰期。
这是为什么开发的非放射性免疫测定的方法和试剂损害现在很少使用的RIA。但是，在自动化免疫分析平台上进行的免疫测定在常规使用的条件下不能正确和可重复地检测低于1.5ng/ml的睾酮量(Rosner W.et al.,2007)。这对常具有这样低的血清水平的患有性腺机能减退的人的适当管理提出了问题。
此外，当在女性中使用时，睾酮的非放射性免疫测定的大多数现有方法是不准确的，因为它们不具有足够的分析灵敏度以检测和定量血液循环中存在的睾酮水平。在18-49岁年龄范围中的女性中总睾酮的参考值为0.04-0.44ng/ml(Demers L.M.,2010)，而睾酮的自动化免疫测定的检出限或分析灵敏度为0.1ng/ml数量级。因此，Shrivastav T.G.,2002显示当待测定的样品中睾酮的量低时，利用与辣根过氧化物酶缀合的睾酮-3-O-CMO作为示踪剂通过ELISA测定睾酮产生偏差，因为获得的浓度通常远高于测定的样品中实际包含的浓度。Fiet J.et al.,2004还描述了使用这样的化合物3-O-CMO，也称作化合物3-CMO作为示踪剂，其是事先生物素化的。但是，在最低范围中利用这种化合物测定睾酮的灵敏度并不好。此外，所述化合物3-O-CMO的制备复杂，因为其为立体异构体混合物的形式，也称作异构体混合物。为了可重复测定，因此推荐在免疫测定中使用之前分离立体异构体，这是复杂的，并且导致合成率的退化。
因此迫切需要睾酮的测定，其足够灵敏，因此临床上可用于包含低睾酮浓度的样品，并且使用可以容易制备的化合物。
发明内容
出乎意料地，申请人已发现新的睾酮化合物，其使得可以克服现有技术的免疫测定的缺点，因为在竞争性免疫测定中使用它，特别是作为示踪剂，提供高度灵敏的测定，尤其是在低范围的睾酮中，并且易于制备。
因此，本发明的一个目的涉及以下通式(I)的衍生自睾酮的化合物：
其中n为1-10的整数，并且Y表示活化或待活化的偶联基团，其允许与分子的伯胺形成酰胺键。
本发明的另一目的包括缀合物以及包含所述化合物的试剂盒，所述缀合物包含如上文所述的式(I)的睾酮衍生物或者由如上文所述的式(I)的睾酮衍生物组成。
本发明的另一目的包括所述缀合物在睾酮的免疫测定的方法中，特别是作为示踪剂的用途。
最后，最后一个目的涉及一种制备所述睾酮衍生物的方法。
因此，本发明涉及如上文所述的式(I)的化合物，其特别可用于竞争性免疫测定，尤其是示踪剂制备。
实际上，出乎意料地，申请人发现通过将羰基还原为羟基并引入接头来在3位修饰睾酮，产生睾酮衍生物，其不是异构体混合物形式，并且在用于睾酮的测定时特别有利，尤其是作为示踪剂，因为睾酮的测定特别灵敏，并且使得可以检测低睾酮浓度。
如Cook B.and Beastall G.H.,1987所示，类固醇激素在结构上非常相似。因此，如下文所示，睾酮、雌二醇、雌酮和雄烯二酮的不同之处仅在于在3和17位存在羟基或酮官能团，以及10位存在或不存在甲基：
基本结构的取代基的轻微修饰，特别是在3位或17位，导致从一种类固醇激素转变为另一种。
出乎意料地，尽管对睾酮的基本化学结构的修饰，但是由于3位的羰基还原为羟基，因此由于其在这个位置的官能团与我们不希望测定的分析物雌二醇的结构相似性，本发明的式(I)的化合物特别适合用于测定睾酮。
因此本发明的化合物的特征在于如上文给出的式(I)，其中n为1-10的整数，并且Y表示活化或待活化的偶联基团，其使得能与分子的伯胺形成酰胺键。
这些化合物必须不太疏水，在这方面必须控制n的值。根据一实施方案，n为1-5，并且优选1-3。根据一特定实施方案，n为1。
可以与本发明的睾酮衍生物偶联的分子是天然具有伯胺的所有分子如蛋白，或者已化学修饰以包括这样的伯胺的所有分子，例如具有伯胺的修饰的生物素。
“活化或待活化的偶联基团”表示合适的官能团，活化后如果需要，其允许本发明的睾酮衍生物与偶联分子的伯胺官能团偶联。这个基团还可以称作离去基团，因为其不再存在于睾酮衍生物和具有伯胺的分子之间形成的缀合物中。因此在所关注的偶联分子的伯胺亲核基团的亲核取代反应期间，这个离去基团会从分子的剩余部分解离。当其称作“已活化”时，这个离去基团会直接解离，或者当其称作“待活化”时，其仅在活化之后解离。
因此“活化的偶联基团”表示这样的基团，其使得可以直接形成酰胺键，这个基团不必修饰。作为实例，可以提到以下基团：
m为整数，优选1-10，其构成本发明的一实施方案。
因此“待活化的偶联基团”表示必须通过本领域技术人员已知的方法活化以能够形成酰胺键的任何基团。这类基团具有–OH或–COOH基团。作为实例，我们可以提到基团-OH和-NH-(CH2)m-COOH，m为整数，优选1-10，其构成本发明的一实施方案。
根据本发明的一特定实施方案，m为1-5，或者1-3。
根据另一实施方案，Y选自–OH、–NH-(CH2)m-COOH和
m为1-10，并且优选等于1。
特别适合测定睾酮，尤其是示踪剂制备的化合物是在3位的碳为立体化学纯的化合物(α或β异构体)，因为如睾酮中，在3位不再有双键。
实际上，与3-O-CMO化合物(其更难以控制并重复异构体混合物，因为在合成批次之间异构体的比例不同)相比，在碳3处立体化学纯的化合物(α或β异构体)是有利的，因为它们更可重复，具有更好的质量，并且其中使用它们的测定更稳健。
在3位为β异构体形式的式(I)的本发明的睾酮衍生物如以下式(Iβ)所示：
Y和n如上文所述。
在3位为α异构体形式的式(I)的本发明的睾酮衍生物如以下式(Iα)所示：
Y和n如上文所述。
换句话说，在式(I)中，以如下一段直线形式表示的：3位的碳和接头的氧原子之间的键包括β类型的键和α类型的键。
这还应用于下文所述的3位的碳和所述化合物的接头的氧原子之间包含键的所有化合物，所述键为一段直线形式，而不是箭头形式，如下：表示β异构体，或表示α异构体。
这特别应用于制备本发明的睾酮衍生物的方法的描述中使用的化合物，对其而言式中未加入数字指示符号α或β。
本发明的化合物可以在通过竞争性免疫测定确定睾酮的方法如诊断测试中以两种方式使用。它们直接使用，或者它们偶联至另一分子以形成缀合物使用。所述其他分子为标记物，或者化学键或“接头”，或者与睾酮衍生物偶联是为了通过竞争性免疫测定实施睾酮测定的化合物。
因此，本发明还涉及缀合物，其包含如上文所述的睾酮衍生物和另一分子，特别是标记物或化学键，或者由如上文所述的睾酮衍生物和另一分子组成，特别是标记物或化学键。
“标记物”表示包含伯胺基团的任何分子，其直接包含伯胺基团而没有化学修饰，或者在化学修饰之后以包括这样的基团，所述分子能够直接或间接产生可检测的信号。用于直接检测的这些标记物的非详尽列表由以下组成：
·产生例如可通过比色法、荧光、发光检测的信号的酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，
·发色团如荧光化合物、发光化合物、染料，
·放射性分子如32P、35S或125I，以及
·荧光分子如Alexa或藻蓝蛋白；
·电化学发光盐如基于吖啶酯(acridinium)或钌的有机金属衍生物。
还可以使用间接检测系统，例如能够与抗配体反应的配体。然后配体对应于标记物，并且与睾酮衍生物构成本发明的缀合物。
本领域技术人员熟悉配体/抗配体对，例如以下对：生物素/链霉抗生物素蛋白、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/多核苷酸的互补物。
然后抗配体可以通过上文所述的直接检测标记物直接检测，或者其本身可以通过另一配体/抗配体对检测，等等。
在某些条件下，这些间接检测系统可以导致信号的放大。本领域技术人员熟悉信号放大的这种技术，并且可以参考申请人以前的专利申请FR98/10084或WO-A-95/08000。
根据所用的标记物的类型，本领域技术人员会添加试剂，所述试剂允许标记物可视化，或者发射可通过任何合适类型的测量装置如分光光度计、荧光分光光度计或高清摄像机检测的信号。
化学键或“接头”表示包含伯胺基团的任何分子，其直接包含伯胺基团而没有化学修饰，或者在化学修饰之后以包括这样的基团，所述分子能够共价或非共价地、选择性或非选择性地固定在固相上。
如上文指出的，本发明的睾酮衍生物或缀合物特别可用于体外测定生物学样品中睾酮的浓度，这构成本发明的另一目的。
其中可以进行本发明的方法的生物学样品是可能包含睾酮的任何动物，优选人的生物学样品，其中可以进行免疫测定。这些样品是本领域技术人员公知的。测定方法中采用的样品在它们使用之前可以修饰或不修饰。作为事先不修饰的这类样品的实例，我们可以提到生物流体如全血、尿、脑脊液、精液、精子、白带(阴道分泌物)、宫颈粘液、宫颈阴道灌洗液、直肠灌洗液、唾液、支气管肺泡灌洗液和羊水。作为也称作样品衍生物的事先修饰的样品的实例，我们可以提到血清、血浆、从生物活组织检查或手术之后回收的细胞以及体外培养的细胞。然后可以在培养上清或细胞裂解物中测定睾酮的浓度。
可以通过也称作免疫学测定的竞争性免疫测定的方法确定生物学样品中睾酮的浓度，所述方法包括由以下组成的步骤：
a)在所述样品内使(i)睾酮结合配对物与(ii)选自如上文所述的睾酮衍生物和缀合物的化合物接触，所述组分(i)和(ii)之一适合发射信号，
b)任选地等待足够的时间以允许竞争反应，以及
c)测量信号的强度，并且通过与建立测量的信号强度和睾酮浓度之间关系的校准曲线进行比较来由其推断所述生物学样品中存在的睾酮的浓度。
竞争性免疫测定是本领域技术人员公知的测定。其由通过产生样品的分析物与所述分析物的衍生物(在这种情况下，睾酮衍生物)之间的竞争来测定样品中的分析物(在这种情况下，睾酮)组成。由于存在示踪剂，然后检测免疫反应。
如上文指出的，可以在竞争反应中使用分析物的衍生物，不用之前偶联或之后偶联至标记物以形成缀合物或示踪剂。
免疫测定还需要使用睾酮结合配对物，其中分析物衍生物和分析物竞争。当分析物衍生物未偶联至标记物时(不是示踪剂而是捕获配对物)，然后将结合配对物标记物以构成反应的示踪物。当分析物衍生物偶联至标记物时(则其为示踪剂)，则结合配对物变为捕获配对物。
测量的示踪剂发射的信号与样品中睾酮的量成反比。
“睾酮结合配对物”表示能够结合至睾酮的任何分子。作为睾酮结合配对物的实例，我们可以提到抗体、抗体部分、Nanofitins、睾酮受体或已知与睾酮具有相互作用的任何其他蛋白，例如SHBG。
作为结合配对物的抗体例如多克隆抗体或单克隆抗体。
多克隆抗体可以这样获得，用靶睾酮作为免疫原免疫动物，然后回收纯化形式的所需抗体，通过从所述动物采集血清，并且从血清的其他成分分离所述抗体，特别是通过在柱上亲和色谱，在所述柱上固定抗体特异性识别的抗原，特别是免疫原。
单克隆抗体可以通过本领域技术人员公知的杂交瘤技术获得。单克隆抗体还可以是通过本领域技术人员熟悉的技术，通过遗传工程获得的重组抗体。
作为抗体片段的实例，我们可以提到片段Fab、Fab'、F(ab')2以及链scFv(单链可变片段)、dsFv(双链可变片段)。这些功能片段可以特别地通过遗传工程获得。
Nanofitins(商品名)是小蛋白，像抗体一样，其能够结合至生物靶标，因此使得可以检测它，捕获它或者在生物内非常简单地靶向它。
所用的结合配对物可以是睾酮特异性或不是睾酮特异性的。当它们能够专门地或几乎专门地结合至睾酮时，则说它们是特异性的。当睾酮结合选择性低且它们能够结合至其他配体如其他蛋白或抗体时，则说它们是非特异性的。根据一优选实施方案，优选特异性结合配对物。
当它们用于捕获时，结合配对物或睾酮衍生物可以通过本领域技术人员公知的任何技术结合至基底或不结合至基底。
本发明的方法的第二步b)是竞争性测定方法的常规步骤。
本发明的方法的最后步骤c)由确定睾酮浓度组成。如上文所述，测量的信号与样品中睾酮的量成反比。为了确定浓度，将信号与事先通过本领域技术人员公知的技术获得的校准曲线进行比较。因此，例如，通过利用相同的结合配对物以及渐增量的睾酮进行免疫测定来获得校准曲线。因此通过在横坐标上作图睾酮浓度并在纵坐标上作图免疫测定之后获得的相应信号来获得曲线。
当化合物(ii)是如上文所述的本发明的缀合物(其构成本发明的一实施方案)时，通过用如上文所述的标记物进行标记来获得信号。
当化合物(ii)是如上文所述的本发明的睾酮衍生物时，即其不结合至标记物，信号由直接读取结合配对物/睾酮衍生物的结合组成，这可以例如通过表面等离子共振或通过循环伏安法进行。
为了进行确定睾酮浓度的方法，将如上文所述的本发明的睾酮衍生物或缀合物并入诊断试剂盒，所述诊断试剂盒构成本发明的另一目的。当然，所述试剂盒可以包含进行免疫测定所需的其他成分，例如，至少一种结合配对物、校准装置、洗涤缓冲液以及允许标记物可视化或发射可检测的信号的试剂。
通过合成化合物的特定方法制备睾酮衍生物，所述化合物为纯异构体α或纯异构体β。这些方法是新的，并且构成本发明的另一目的。
制备式(I)的本发明的所有睾酮衍生物的方法包括制备第一关键化合物，其为如下式(Ia)的化合物：
其中n如上文所定义。因此，其在制备如上文定义的式(I)的化合物中的用途构成本发明的另一目的。
事实上，式(Ia)的化合物为式(I)的睾酮衍生物，其中Y为–OH基团。这种睾酮衍生物在3位可以为β异构体的形式；其具有以下式(Iaβ)：
n如上文所定义。
因此，本发明的另一目的由一种制备具有以下通式(Iaβ)的3位为β异构体形式的睾酮衍生物的方法组成，所述方法包括或由以下步骤组成：
(1)使睾酮与乙酸酐反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(IIβ)的化合物：
其中Ac表示-CO-CH3，
(2)使由此获得的式(IIβ)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaβ)的化合物。
其中Y为-OH的式(I)的睾酮衍生物还可以在3位为α异构体形式；其具有以下式(Iaα)：
其中n如上文所述。
本发明的另一目的涉及一种制备具有以下通式(Iaα)的3位为α异构体形式的睾酮衍生物的方法，所述方法包括或由以下步骤组成：
(1)使睾酮与叔丁基二甲基氯硅烷反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原羰基3并获得式(VIIIβ)的化合物：
其中–SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(2)使由此获得的式(VIIIβ)的化合物与三苯膦、苯甲酸和偶氮二羧酸二乙酯反应，然后在溶剂的存在下与碱反应，以将3位的β异构体转化为α异构体，从而获得式(VIIIα)的化合物：
其中–SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，以及
(3)使由此获得的式(VIIIα)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaα)的化合物。
这里可以使用的还原剂是本领域技术人员已知的用于将羰基立体选择性地还原为羟基的任何还原剂。作为实例，我们可以提到硼氢化钠。
这里可以使用的溶剂是任何溶剂，其使得可以具有反转羟基的立体化学的反应。作为实例，我们可以提到醇如甲醇和乙醇。
这里可以使用的碱是允许皂化以回到-OH基团的任何无机碱。作为实例，我们可以提到氢氧化钠和氢氧化钾。
如上文所述，式(Iaβ)或(Iaα)的化合物是制备本发明的其他睾酮衍生物的关键。因此，例如，在式(I)中，当Y表示–NH-(CH2)m-COOH时，则睾酮衍生物为以下式(Ibβ)或(Ibα)的化合物，取决于它们在3位分别为β或α异构体：
n和m如上文所定义，制备方法包括β异构体的前述步骤(1)和(2)及α异构体的(1)-(3)，以及以下3个步骤：
1.使由此获得的式(Iaβ)或(Iaα)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺在碳二亚胺衍生物的存在下反应以产生式(IV)的化合物：
2.使由此获得的式(IV)的化合物与式(V)：H2N-(CH2)m-COOR1的化合物反应，其中R1为烷基或芳基，以产生式(VI)的化合物：
3.使由此获得的式(VI)的化合物与碱在溶剂的存在下反应，以获得式(Ibβ)或(Ibα)的化合物。
因此，根据另一目的，本发明包括一种制备以下通式(Ibβ)的3位为β异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，m为1-10的整数，所述方法包括或由以下步骤组成：
(1)使睾酮与乙酸酐反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(IIβ)的化合物：
其中Ac表示-CO-CH3,
(2)使由此获得的式(IIβ)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaβ)的化合物：
(3)使由此获得的式(Iaβ)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺在碳二亚胺衍生物的存在下反应以产生式(IVβ)的化合物：
(4)使由此获得的式(IVβ)的化合物与式(V)：H2N-(CH2)m-COOR1的化合物反应，其中R1为烷基或芳基，以产生式(VIβ)的化合物：
(5)使由此获得的式(VIβ)的化合物与碱在溶剂的存在下反应，以获得式(Ibβ)的化合物。
根据另一目的，本发明包括一种制备以下通式(Ibα)的3位为α异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，m为1-10的整数，所述方法包括或由以下步骤组成：
(1)使睾酮与叔丁基二甲基氯硅烷反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(VIIIβ)的化合物：
其中–SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(2)使由此获得的式(VIIIβ)的化合物与三苯膦、苯甲酸和偶氮二羧酸二乙酯反应，然后在溶剂的存在下与碱反应，以将3位的β异构体转化为α异构体，从而获得式(VIIIα)的化合物：
其中–SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(3)使由此获得的式(VIIIα)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaα)的化合物：
(4)使由此获得的式(Iaα)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺在碳二亚胺衍生物的存在下反应以产生式(IVα)的化合物：
(5)使由此获得的式(IVα)的化合物与式(V)：H2N-(CH2)m-COOR1的化合物反应，其中R1为烷基或芳基，以产生式(VIα)的化合物：
(6)使由此获得的式(VIα)的化合物与碱在溶剂的存在下反应，以获得式(Ibα)的化合物。
在额外的步骤中使用的碱和溶剂如上文所述。
式的N-羟基琥珀酰亚胺，当失去羟基处的氢时变为活化的基团Y，其使得能在碳二亚胺衍生物的存在下将式(Ia)的化合物的待活化的基团Y＝-OH活化为活化的基团。所述碳二亚胺衍生物可以为例如二环己基碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺。
烷基和芳基是本领域技术人员已知的基团。作为烷基的非限制性实例，我们可以提到甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基。作为芳基的非限制性实例，我们可以提到苯基、苄基、甲苯基、二甲苯基、亚苄基、苯甲酰基和萘基。
当Y表示以下基团之一时：
睾酮衍生物为以下式(Iβ)或(Iα)的化合物，取决于它们在3位是否分别为β或α异构体：
n如上文所定义，制备方法包括β异构体的前述步骤(1)和(2)及α异构体的(1)-(3)，以及以下步骤：
1.使由此获得的式(Iaβ)或(Iaα)的化合物在碳二亚胺衍生物的存在下，取决于最终基团Y，与选自以下化合物的试剂反应，以获得式(Iβ)或(Iα)的化合物：
再次，在碳二亚胺衍生物的存在下，利用上述适当的7种化合物(当它们失去羟基的氢时变为活化的基团Y)之一进行化合物(Ia)的待活化的基团Y＝-OH的活化。
因此，本发明进一步涉及一种制备以下通式(Iβ)的3位为β异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，并且Y表示：
所述方法包括或由以下步骤组成：
(1)使睾酮与乙酸酐反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(IIβ)的化合物：
其中Ac表示-CO-CH3，
(2)使由此获得的式(IIβ)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaβ)的化合物：
(3)使由此获得的式(Iaβ)的化合物在碳二亚胺衍生物的存在下，取决于最终基团Y，与选自以下化合物的试剂反应，以获得式(Iβ)的化合物：
本发明的另一目的涉及一种制备以下通式(Iα)的3位为α异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，并且Y表示：
所述方法包括或由以下步骤组成：
(1)使睾酮与叔丁基二甲基氯硅烷反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(VIIIβ)的化合物：
其中–SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(2)使由此获得的式(VIIIβ)的化合物与三苯膦、苯甲酸和偶氮二羧酸二乙酯反应，然后在溶剂的存在下与碱反应，以将3位的β异构体转化为α异构体，从而获得式(VIIIα)的化合物：
其中–SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(3)使由此获得的式(VIIIα)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaα)的化合物：
(4)使由此获得的式(Iaα)的化合物在碳二亚胺衍生物的存在下，取决于最终基团Y，与选自以下化合物的试剂反应，以获得式(Iα)的化合物：
当Y表示：
m为如上文所定义的整数，然后根据它们在3位是否分别为β或α异构体，睾酮衍生物为式(Iβ)或(Iα)的化合物时，制备方法包括β异构体的前述步骤(1)和(2)及α异构体的(1)-(3)，以及β异构体的步骤(3)-(5)和α异构体的(4)-(6)，用于制备式(Ibβ)或(Ibα)的化合物，以及以下步骤：
1.使由此获得的式(Ibβ)或(Ibα)的化合物在碳二亚胺衍生物的存在下，取决于最终基团Y，与选自以下化合物的试剂反应，以获得式(Iβ)或(Iα)的化合物：
再次，在碳二亚胺衍生物的存在下，利用上述两种化合物(当它们失去羟基的氢时变为活化的基团Y)之一进行化合物(Ib)的待活化的基团Y＝-COOH的活化。
因此，本发明的另一目的由一种制备以下通式(Iβ)的3位为β异构体形式的睾酮衍生物的方法组成：
其中n为1-10的整数，并且Y表示：
m为1-10的整数，所述方法包括或由以下步骤组成：
(1)使睾酮与乙酸酐反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(IIβ)的化合物：
其中Ac表示-CO-CH3，
(2)使由此获得的式(IIβ)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaβ)的化合物：
(3)使由此获得的式(Iaβ)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺在碳二亚胺衍生物的存在下反应以产生式(IVβ)的化合物：
(4)使由此获得的式(IVβ)的化合物与式(V)：H2N-(CH2)m-COOR1的化合物反应，其中R1为烷基或芳基，以产生式(VIβ)的化合物：
(5)使由此获得的式(VIβ)的化合物与碱在溶剂的存在下反应，以获得式(Ibβ)的化合物：
(6)使由此获得的式(Ibβ)的化合物在碳二亚胺衍生物的存在下，取决于最终基团Y，与选自以下化合物的试剂反应，以获得式(Iβ)的化合物：
本发明的另一目的由一种制备以下通式(Iα)的3位为α异构体形式的睾酮衍生物的方法组成：
其中n为1-10的整数，并且Y表示：
m为1-10的整数，所述方法包括或由以下步骤组成：
(1)使睾酮与叔丁基二甲基氯硅烷反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(VIIIβ)的化合物：
其中–SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(2)使由此获得的式(VIIIβ)的化合物与三苯膦、苯甲酸和偶氮二羧酸二乙酯反应，然后在溶剂的存在下与碱反应，以将3位的β异构体转化为α异构体，从而获得式(VIIIα)的化合物：
其中–SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(3)使由此获得的式(VIIIα)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaα)的化合物：
(4)使由此获得的式(Iaα)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺在碳二亚胺衍生物的存在下反应以产生式(IVα)的化合物：
(5)使由此获得的式(IVα)的化合物与式(V)：H2N-(CH2)m-COOR1的化合物反应，其中R1为烷基或芳基，以产生式(VIα)的化合物：
(6)使由此获得的式(VIα)的化合物与碱在溶剂的存在下反应，以获得式(Ibα)的化合物：
(7)使由此获得的式(Ibα)的化合物在碳二亚胺衍生物的存在下，取决于最终基团Y，与选自以下化合物的试剂反应，以获得式(Iα)的化合物：
最后，当Y表示N3时，则睾酮衍生物为以下式(Icβ)或(Icα)的化合物，取决于它们在3位是否分别为β或α异构体：
n如上文所定义，
制备方法包括β异构体的前述步骤(1)和(2)及α异构体的(1)-(3)，以及以下两个步骤：
(1)使由此获得的式(Iaβ)或(Iaα)的化合物与H2NNH2在碳二亚胺衍生物的存在下反应以获得式(VII)的化合物：
(2)使由此获得的式(VII)的化合物与HONO反应以获得式(Icβ)或(Icα)的化合物。
这个方法中使用的碳二亚胺的衍生物如上文所定义。
因此，本发明的另一目的由一种制备以下通式(Icβ)的3位为β异构体形式的睾酮衍生物的方法组成：
其中n为1-10的整数，所述方法包括或由以下步骤组成：
(1)使睾酮与乙酸酐反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(IIβ)的化合物：
其中Ac表示-CO-CH3，
(2)使由此获得的式(IIβ)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaβ)的化合物：
(3)使由此获得的式(Iaβ)的化合物与H2NNH2在碳二亚胺衍生物的存在下反应以获得式(VIIβ)的化合物：
(3)使由此获得的式(VIIβ)的化合物与HONO反应以获得式(Icβ)的化合物。
本发明最后涉及一种制备以下通式(Icα)的3位为α异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，所述方法包括或由以下步骤组成：
(1)使睾酮与叔丁基二甲基氯硅烷反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(VIIIβ)的化合物：
其中–SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(2)使由此获得的式(VIIIβ)的化合物与三苯膦、苯甲酸和偶氮二羧酸二乙酯反应，然后在溶剂的存在下与碱反应，以将3位的β异构体转化为α异构体，从而获得式(VIIIα)的化合物：
其中–SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(3)使由此获得的式(VIIIα)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaα)的化合物：
(4)使由此获得的式(Iaα)的化合物与H2NNH2在碳二亚胺衍生物的存在下反应以获得式(VIIα)的化合物：
(4)使由此获得的式(VIIα)的化合物与HONO反应以获得式(Icα)的化合物。
通过本领域技术人员已知的允许在式(I)的化合物和另一分子中的伯胺之间形成酰胺键的任何技术制备本发明的缀合物，特别如Wong S.S.,1991所述。
附图说明
从以下实施例(为了说明的目的给出，并且是非限制性的)以及从附图会更好地理解本发明，其中：
-图1示出给出为百分比的比例B/B0作为标准范围的点的浓度的函数(对数比例)的图，用于利用现有技术的缀合物的参考测定(REF)，利用现有技术的缀合物(Ab1+缀合物)的第二测定以及利用本发明的睾酮衍生物(Ab2+本发明的缀合物1，和Ab3+本发明的缀合物1)的两个测定。
-图2示出给出为百分比的比例B/B0作为标准范围的点的浓度的函数(对数比例)的图，用于利用Ab2+本发明的缀合物1的测定和利用Ab3+本发明的缀合物2的测定。
实施例
薄层色谱(TLC)中反应的分析和控制在Merck硅胶板(类型60，F254，厚度0.2mm)上进行，利用UV灯在254nm处可视化，并且在喷洒乙醇(95％)中的5％磷钼酸之后用加热显影。通过在Merck硅胶，40-63μm，pH 6.5-7.5上“快速色谱”来纯化产物。
在Bruker Avance 250装置上记录NMR谱。在参考的基础上以ppm表示化学位移δ：氘化氯仿CDCl3：对于1H，δ＝7.26ppm，而13C为77.14ppm；氘化甲醇CD3OD，对于1H，δ＝4.90ppm，而13C为49.0；四甲基硅烷(TMS)：对于1H和13C，δ＝0ppm。在Thermo-Nicolet FT-IR Avatar 360装置上记录IR谱，并且使用Golden Gate选项。用PE-Sciex API 100 LC-MS系统，柱C4进行LC-MS分析。
实施例1：式(Iaβ)的本发明的睾酮衍生物的制备
17β-羟基-3β-羧基甲氧基雄甾-4-烯或式(Iβ)的化合物，其中n＝1且Y＝-OH
1.1 3β-羟基-17β-乙酰氧基-4-雄甾烯(IIβ)的制备
在装有磁力搅拌的250-ml烧瓶中制备4.23g(14.7mmol)睾酮在8ml已在氢氧化钾(KOH)上干燥过夜的吡啶(5g的KOH至250ml的吡啶)中的溶液。用水/冰混合物将溶液冷却至0℃。向其逐滴添加4ml乙酸酐。让反应混合物回到室温。将溶液在室温下搅拌过夜。在分析TLC(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚，3/1，v/v)中不再发现起始产物。将30ml蒸馏水和30ml乙酸乙酯倒入烧瓶中，并且搅拌混合物。用分液漏斗分离相，并且用3x20ml乙酸乙酯萃取水相。合并有机相，将获得的溶液用20ml蒸馏水洗涤，在无水硫酸镁(MgSO4)上干燥并在旋转式蒸发器中蒸发。利用真空泵将由此获得的产物在减压下干燥4小时以去除所有溶剂。获得4.8g(收率＝99.0％)中间体17β-乙酰氧基-4-雄甾烯。
1H NMR(CDCl3):δ5.70(1H,H4),4.60(1H,Hl7),2.07(3H,s),1.16(3H,s),0.80(3H,s).13C NMR(CDCl3):δ199.5,171.0(2C),123.9,82.5,53.7,50.2,42.4,38.6,36.6,35.7,35.4,33.9,32.8,31.5,27.5,23.5,21.2,20.5,17.4,12.1.
在装有磁力搅拌的250-ml烧瓶中，将4.7g(14.2mmol)的17β-乙酰氧基-4-雄甾烯溶于20ml甲醇和3ml四氢呋喃(THF)中。然后用水/冰混合物将溶液冷却至0℃。将0.8g(21.1mmol)硼氢化钠(NaBH4)添加至溶液中。在TLC板(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚，1/1，v/v)上监测反应，查看起始产物的消失。一旦已消耗所有起始产物，添加10ml丙酮以终止反应。让溶液回到室温，并且将溶液在30℃下于蒸发器中蒸发。将30ml蒸馏水和30ml乙酸乙酯倒入烧瓶中。搅拌混合物并将相倒出。将水相用3x30ml乙酸乙酯萃取。合并有机相，用30ml蒸馏水洗涤，在无水MgSO4上干燥，最后在30℃下于减压下蒸发至干燥。通过硅胶色谱(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚，111，v/v)纯化之后获得4.6g(收率＝97.3％)产物(IIβ)。
1H NMR(CDCl3):δ5.30(1H,H4),4.61(lH,t,H17),4.18(lH,H3),2.04(3H,s),1.05(3H,s),0.80(3H,s).13C NMR(CDCl3):δ171.3,147.3,123.7,82.8,67.9,54.4,50.5,42.6,37.4,36.8,35.8,35.5,32.6,32.1,29.5,27.5,23.6,21.3,20.6,19.0,12.1.
1.2式(Iaβ)的本发明的睾酮衍生物的制备
通过在5g五氧化二磷(P2O5)上蒸馏250ml的CH2Cl2来制备无水反应溶剂二氯甲烷(CH2Cl2)。
将装有磁力搅拌的250-ml三颈烧瓶、滴液漏斗和惰性气体供应物用无水氮气通气10min。在氮气下引入2.2g(6.6mmol)的3β-羟基-17β-乙酰氧基-4-雄甾烯(IIβ)、10ml无水二氯甲烷和20mg(0.045mmol)乙酸铑(II)二聚体[Rh(OAc)2]2。将获得的混合物冷却至0℃。制备2.5ml(2.71g,23.8mmol)重氮基乙酸乙酯(N2CHCOOEt)在5ml无水二氯甲烷中的溶液，并且将其引入滴液漏斗。在氮气下于搅拌的同时在70min的时间中将溶液添加至三颈烧瓶中。让反应混合物回到室温，并且维持搅拌4小时。在TLC(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚，1/1，v/v)中仍然可以发现少量起始产物的存在。添加2.5mg(0.006mmol)的[Rh(OAc)2]2以反应完成。在室温下通过滴液漏斗在10min的时间中将0.5ml(4.8mmol)的N2CHCOOEt在2ml无水二氯甲烷中的溶液引入三颈烧瓶。倒入20ml蒸馏水和20ml二氯甲烷，并且将混合物搅拌10min。分离相，并且用2x20ml二氯甲烷萃取水相。收集有机相，在无水MgSO4上干燥并利用旋转式蒸发器在25℃下蒸发干燥，以给出黄色油形式的粗产物。通过硅胶色谱(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚，1/3，v/v)进行纯化。获得2.4g(收率＝86.6％)的产物3β-羧基甲氧基-17β-乙酰氧基-4-雄甾烯乙酯。
1H NMR(CDCl3):δ55.39(lH),4.54(1H,t),4.23(2H,q),4.13(1H),2.03(s),1.29(t),1.05(s),0.80(s).13C NMR(CDCl3):δ171.2,170.9,148.1,120.4,82.7,76.0,65.5,61.2,54.3,50.4,42.5,37.5,36.8,35.6,35.2,32.5,32.1,27.5,25.2,23.5,21.2,20.4,18.8,14.0,12.0.MS(LC-MS):347.0(M-H)-.
将2.0g(4.8mmol)的3β-羧基甲氧基-17β-乙酰氧基-4-雄甾烯乙酯和20ml甲醇放入装有磁力搅拌的250-ml烧瓶中。将混合物冷却至0℃。添加10ml(1.0M,10mmol)氢氧化钠溶液(NaOH)。在0℃下维持搅拌3小时。让反应混合物回到室温，并且在搅拌20小时之后完成皂化反应。然后用盐酸(HCl,l.0N)将反应混合物中和至pH 6，然后在25℃下用旋转式蒸发器蒸发。在硅胶柱上纯化残余物以给出1.3g(收率＝78.0％)产物(Iaβ)。
1H NMR(CD3OD):δ5.32(lH,H4),3.83(2H),3.50(lH,t),从2.40至1.10(m),1.01(3H,s),0.69(3H,s).13C NMR(CD3OD):δ174.5,148.9,119.8,81.9,76.3,64.8,54.5,50.7,42.9,37.6,36.6,35.9,35.2,32.6,32.2,30.3,25.2,23.4,20.6,18.9,11.1.IR(cm-1):3383,2928,2869,2847,1721,1529,1432,1377,1336,1243,1213,1110,1050.
实施例2：式(Iβ)的本发明的睾酮衍生物的制备
17β-羟基-3β-羧基甲氧基-雄甾-4-烯N-羟基琥珀酰亚胺酯或式(I)的化合物，其中n＝1且
重复实施例1中描述的方法，然后继续如下。
将10ml在氢化钙(CaH2)上蒸馏的1,2-二甲氧基乙烷(DME)、100mg(0.287mmol)实施例1中制备的式(Iaβ)的化合物和33mg(0.287mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)放入装有磁力搅拌的25-ml烧瓶中。将混合物冷却至0℃。添加59mg(0.287mmol)的1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)。在温度下维持搅拌15小时。TLC(洗脱液：氯仿/丙酮/乙酸，70/25/1，v/v/v)显示起始产物几乎完全消失。将反应混合物过滤，并且将滤液在减压下于室温下蒸发。将6.0ml无水二氯甲烷添加至残余物中，然后将由此获得的混合物过滤。将溶液在室温下用旋转式蒸发器蒸发干燥。将产物在真空下干燥4小时。获得64mg(50.0％)产物(IVβ,n＝1)。
1H NMR(CDCl3):δ5.38(lH,H4),4.47(2H),4.40(lH,t,Hl7),从4.20至3.40(4H,m),2.85(4H,s),从2.60至1.10(m),1.05(3H,s),0.74(3H,s).13CNMR(CDCl3):δ168.9,166.6,149.2,119.7,81.9,76.9,63.2,54.5,50.7,42.9,37.6,36.6,36.0,35.1,32.6,32.2,30.5,25.7,25.2,23.4,20.6,18.9,11.2.IR(cm-1):3537,3323,2929,2849,1784,1732,1203,1071.IR(cm-1):3536,3507,3322,2928,2849,1783,1731,1624,1573,1442,1426,1376,1203,1071.MS(LC-MS):446(M+H)+,908(2M+H2O)+.
实施例3：式(Ibβ)的本发明的睾酮衍生物的制备
式(Iβ)的化合物，其中n＝1且Y＝-NH-CH2-COOH
重复实施例1中描述的方法，然后继续如下。
3.1式(Viβ)的化合物的制备，其中m＝n＝1
将来自实施例1的产物(Iaβ)(500mg,1.43mmol)和30ml无水DME放入100-ml烧瓶中。添加N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu,247.7mg,2.15mmol)。搅拌混合物，然后添加1,3-二环己基碳二亚胺(DCC,440mg,2.15mmol)。在室温下维持搅拌过夜。将反应混合物过滤，并且将包含化合物(IVβ,n＝1)的滤液直接用于合成的剩余部分。
将碳酸氢钠溶液(NaHCO3,1.0N,10ml)和1.0ml产物甘氨酸叔丁酯(H2NCH2COOBut)添加至滤液中。将形成的混合物在室温下搅拌12小时。将70ml蒸馏水和50ml乙酸乙酯与反应混合物混合。将相倒出，并且将相用乙酸乙酯(3x50ml)萃取。将合并的有机溶液在无水MgSO4上干燥，然后利用旋转式蒸发器在30℃下蒸发。通过色谱(洗脱液：乙酸乙酯100％)纯化残余物。形成401mg(收率＝60.2％)白色晶体形式的产物(VIβ,m＝n＝1)。
1H NMR(CDCl3):δ7.19(lH),5.32(lH),4.35(1H),4.01(2H,s),3.94(2H,d),3.64(1H,t),从2.30至0.80(m),1.45(s),1.04(s),0.73(s).13C NMR(CDCl3):δ170.6,168.8,148.8,120.0,82.3,81.8,76.3,67.0,54.5,50.7,42.9,41.4,37.6,36.6,36.0,35.1,32.6,32.2,30.5,28.1,25.5,23.4,20.6,18.9,11.1.
3.2式(Ibβ)的睾酮衍生物的制备，其中m＝n＝1
将制备的400mg(0.87mmol)叔丁基酯(VIβ,n＝1)溶于30ml甲醇中。添加2.0ml氢氧化钠溶液(NaOH,1.0N)。在室温下维持搅拌15小时。将反应混合物用盐酸(HCl,1.0N)中和至pH＝6。将由此形成的溶液在30℃下于减压下蒸发。通过色谱用甲醇/氯仿洗脱液(20/80,v/v)纯化获得的粗产物。获得340mg(收率＝96.8％)白色晶体形式的式(Ibβ,m＝n＝1)的衍生物。
1H NMR(CD3OD):δ5.35(lH),3.96(2H,s),3.86(2H,s),3.50(lH,t),3.25(lH),从2.30至0.70(m),1.02(3H,s),0.69(3H,s).13C NMR(CD3OD):δ173.5,173.4,149.5,121.5,82.3,77.5,67.7,56.1,52.0,44.0,42.0,38.6,37.9,37.3,36.4,34.7,33.9,33.2,30.5,24.3,21.7,19.3,11.6.IR(cm-1):3371,3322,2922,2848,1714,1622,1537,1437,1420,1230,1077.MS(LC-MS):406.6(M+H)+,405.4(M-H)-.
实施例4：式(Iβ)的本发明的睾酮衍生物的制备
式(I)的化合物Iβ，其中m＝n＝1且
重复实施例3中描述的方法，然后继续如下。
在装有磁力搅拌的烧瓶中将实施例3中获得的式(Ibβ)的产物(220mg,0.54mmol)溶于15ml无水四氢呋喃(THF)中。引入62.5mg(0.54mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)并形成透明溶液。添加112mg(0.54mmol)的1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)。将混合物在室温下搅拌4小时30分钟。将反应混合物过滤，并且利用旋转式蒸发器不加热蒸发滤液。将获得的残余物用6.0ml无水二氯甲烷洗涤，然后真空干燥。产生190mg(收率＝70.1％)酯(Iβ)。1H NMR(CDCl3):δ7.20(IH),5.35(lH),4.45(H,d),4.05(2H),3.98(lH),3.64(lH,t),2.84(4H,m),从2.60至0.80(m),1.04(3H,s),0.73(3H,s).13CNMR(CDCl3):δ171.0,168.7,165.6,149.1,119.8,81.8,76.5,66.8,54.5,50.7,42.9,38.3,37.6,36.6,36.0,35.0,33.8,32.6,32.3,30.4,25.6,23.4,20.6,18.9,11.1.MS(Fab,Na):501(M-1)+,525(M+Na)+.
实施例5：式(Iaα)的本发明的睾酮衍生物的制备
17β-羟基-3α-羧基甲氧基-雄甾-4-烯或式(Iα)的化合物，其中n＝1且Y＝-OH
5.1 3β-羟基-17β-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-4-雄甾烯(VIIIβ)的制备
在氮气下将2.88g(10mmol)睾酮、12ml无水N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)和1.0g(14.7mmol)咪唑倒入250-ml烧瓶中。添加2.26g(15mmol)的叔丁基二甲基氯硅烷(ClTBDMS)。将混合物在氮气下于室温下搅拌4小时30分钟。将100ml蒸馏水和100ml乙酸乙酯倒入反应混合物中，并且搅拌混合物。分离相，并且将水相用乙酸乙酯(3x70ml)萃取。将合并的有机相用100ml蒸馏水洗涤，在无水MgSO4上干燥并蒸发。通过硅胶色谱(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚，1/5，v/v)纯化残余物以给出3.67g白色晶体形式的反应产物。
在装有磁力搅拌的250-ml烧瓶中将3.66g获得的这种产物与40ml甲醇、10mg水合氯化铈(III)(CeCl3.7H2O)混合。形成悬浮液。在5min的时间中分3批添加0.40g(10.6mmol)硼氢化钠(NaBH4,98％)。在温度下维持搅拌10min。利用旋转式蒸发器在减压下于30℃下蒸发反应混合物。将残余物与50ml乙酸乙酯和50ml蒸馏水混合。倒出相，并且将水相用乙酸乙酯(2x50ml)萃取。将收集的有机溶液在无水MgSO4上干燥并蒸发以给出粗产物，然后通过硅胶色谱(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚，1/4，v/v)将其纯化。形成3.5g(收率＝86.5％)白色晶体形式的产物(VIIIβ)。
1H NMR(CDCl3):δ5.29(1H,H4),4.18(lH,H3),3.56(1H,t,H17),从2.40至0.80(m),1.08(3H,s,H19),0.89(9H,s,t-Bu),0.74(3H,s,H18),0.02(6H,s,Me2Si).13C NMR(CDCl3):δ147.8,123.5,81.8,68.0,54.8,50.5,43.3,37.2,37.1,36.1,35.5,32.8,32.2,31.0,29.6,25.9,23.6,20.8,19.1,18.9,11.4,-4.3,-4.6.
5.2 3α-羟基-17β-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-4-雄甾烯(IXα)的制备
在氮气下向500-ml烧瓶装入4.46g(11.0mmol)制备的产物(VIIIβ)、50ml无水苯、5.78g(22.0mmol)三苯膦和2.69g(22.0mmol)苯甲酸。将3.84g(22.0mmol)偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)溶于10ml无水苯中，并且在氮气保护下于10min中将获得的溶液逐滴添加至烧瓶中。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将50ml碳酸氢钠溶液(NaHCO3,1.0M)倒入混合物中，并且分离相。将水相用乙酸乙酯(3x30ml)萃取，将合并的有机溶液用50ml的NaHCO3溶液(1.0M)洗涤，然后用50ml蒸馏水洗涤，在无水MgSO4上干燥并蒸发。在150ml乙醇中拿起残余物，并且添加30ml氢氧化钠溶液(NaOH,1.0N)。将混合物在室温下搅拌过夜，并且在70℃下搅拌3小时。在分析TLC(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚，1/9，v/v)上不再有任何起始产物。用旋转式蒸发器将反应混合物蒸发至50ml。添加50ml蒸馏水和100ml乙酸乙酯。搅拌之后分离相。将水相用乙酸乙酯(2x70ml)萃取。将获得的有机溶液用蒸馏水(70ml)洗涤，在无水MgSO4上干燥并在减压下蒸发以给出粗产物。通过硅胶柱色谱(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚，1/7，v/v)进行纯化。获得2.19g(收率＝47.1％)产物(Ixα)。
1H NMR(CDCl3):δ5.45(1H,H4),4.07(1H,H3),3.52(1H,t,H17),从2.40至0.80(m),0.97(3H,s,H19),0.86(9H,s,t-Bu),0.71(3H,s,H18),0.00(6H,s,Me2Si).13C NMR(CDCl3):δ150.2,120.8,81.7,64.2,54.3,50.4,43.3,37.6,37.1,35.9,32.4(2C),31.7,30.9,27.9,25.9,23.6,21.2,18.2,18.1,11.4,-4.3,-4.7.
5.3式(Iaα)的睾酮衍生物的制备
在装有磁力搅拌的250-ml三颈烧瓶中，在氮气下将3.95g(9.8mmol)产物(Ixα)溶于65ml无水二氯甲烷中。添加100mg乙酸铑(II)二聚体。将溶液物冷却至0℃。制备4.0g(35mmol)重氮基乙酸乙酯在25ml无水二氯甲烷中的溶液，并且在氮气下于1小时中将其逐滴添加至三颈烧瓶中。让反应混合物回到室温，并且维持搅拌4小时。添加100ml蒸馏水并分离相。将水相用乙醚(3x100ml)萃取。将合并的有机溶液在无水MgSO4上干燥并蒸发。在硅胶色谱柱(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚，1/6，v/v)上纯化获得的残余物以给出3.2g产物，将其直接用于合成的剩余部分。
将由此获得的3.0g产物溶于20ml无水四氢呋喃(THF)中，并且将溶液冷却至0℃。在氮气下添加15ml的四-正丁基氟化铵(Bn4NF、THF中1.0M)溶液。让反应混合物回到室温，并且维持搅拌22小时。利用旋转式蒸发器蒸发反应混合物。将100ml蒸馏水和100ml乙醚与残余物混合。将相倒出，并且将相用乙醚(3x50ml)萃取。将有机溶液在无水MgSO4上干燥并蒸发。通过硅胶色谱(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚，1/1，v/v)纯化形成的残余物，给出1.0g产物(透明的油)，然后将其溶于30ml乙醇中。在室温下将6.0ml氢氧化钠溶液(NaOH,1.0N)添加至溶液中，并且将混合物搅拌30min。TLC(洗脱液：氯仿/丙酮/乙酸，70/25/2，v/v/v)用于监测皂化的评价。用盐酸(HCl,1.0N)将反应混合物中和至pH 6，并且在室温下于减压下将其蒸发干燥。在硅胶色谱柱(洗脱液：氯仿/甲醇，4/1，v/v)上纯化由此形成的粗产物。获得950mg产物(Iaα)。
1H NMR(CDCl3):δ5.44(lH,H4),4.11(2H,s),3.84(lH,H3),3.63(lH,t,H17),从2.40至0.80(m),1.01(3H,s,H19),0.78(3H,s,H18).13C NMR(CD3OD):δ175.8,152.2,119.2,82.4,73.5,66.7,55.3,52.0,44.0,38.7,37.9,37.2,33.6,33.4,33.1,30.5,25.0,24.2,22.2,18.7,11.6.IR(cm-1):3375,2925,2869,2846,1725,1589,1434,1213,1105,1072.MS(LC-MS):347.2(M-H)-.
实施例6：式(Iα)的本发明的睾酮衍生物的制备
17β-羟基-3α-羧基甲氧基-雄甾-4-烯N-羟基琥珀酰亚胺酯或式(Iα)的化合物，其中n＝1且
重复实施例5中描述的方法，然后继续如下。
将100mg(0.29mmol)实施例5中合成的产物(Iaα)、34.1mg(0.29mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)和18ml无水四氢呋喃(THF)放入装有磁力搅拌的50-ml烧瓶中。获得悬浮液。添加59.8mg(0.29mmol)的1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物过滤，并且在25℃下蒸发滤液。添加5ml无水二甲氧基甲烷，并且将混合物过滤。利用旋转式蒸发器在25℃下蒸发滤液。利用真空泵干燥残余物，用5ml无水己烷洗涤并在减压下干燥。获得86mg(66.5％，纯度：HPLC中90％)睾酮衍生物(Iα)。
1H NMR(CDCl3):δ5.50(lH,H4),4.44(2H,s),3.85(lH,H3),3.61(1H,t,H17),2.84(4H,s),从2.40至0.80(m),0.97(3H,s,H19),0.74(3H,s,H18).13CNMR(CDCl3):δ169.0,166.7,152.2,117.2,81.9,73.3,63.6,53.9,50.6,43.0,37.7,36.6,35.8,32.4,32.2,31.9,30.4,25.6,24.2,23.4,21.1,18.1,11.1.IR(cm-1):3517,3324,2917,2848,1780,1729,1703,1427,1379,1204,1066.MS(LC-MS):447.2(M+H)+.
实施例7：式(Ibα)的睾酮衍生物的制备
式(Iα)的化合物，其中n＝1且Y＝-NH-CH2-COOH
重复实施例5中描述的方法，然后继续如下。
7.1化合物(VIα)的制备，其中m＝n＝1
将380mg(1.09mmol)产物(Iaα)、125.5mg(1.09mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)和30ml无水四氢呋喃(THF)在氮气保护下于100-ml烧瓶中混合。添加225mg(1.09mmol)的1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)。将混合物在室温下搅拌4小时。TLC(洗脱液：氯仿/甲醇，5/1，v/v)用于监测反应。将包含产物(IVα,n＝1)的混合物过滤。
将6ml碳酸氢钠溶液(NaHCO3,1.0M)和142mg(1.09mmol)甘氨酸叔丁酯快速添加至滤液中。将混合物在25℃下搅拌30min，然后在减压下浓缩至10ml。添加50ml蒸馏水和50ml乙酸乙酯。将相倒出，并且将水相用乙酸乙酯(3x50ml)萃取。收集有机溶液，在MgSO4上干燥并蒸发。然后在硅胶色谱柱(洗脱液：乙酸乙酯100％)上纯化粗产物以给出440mg产物(VIα,m＝n＝1)。
1H NMR(CDCl3):δ7.12(lH,NH),5.48(lH,H4),4.01(2H,m),3.80(lH,H3),3.66(lH,t,H17),从2.40至0.70(m),1.48(s,t-Bu),0.99(3H,s,H19),0.76(3H,s,H18).13C NMR(CDCl3):δ170.8,168.6,151.6,117.5,82.2,81.6,72.8,67.6,53.8,50.5,42.9,41.3,37.6,36.6,35.8,32.3,32.2,32.0,30.3,28.0,24.3,23.3,21.0,18.1,11.1.
7.2式(Ibα)的睾酮衍生物的制备
将440mg(0.95mmol)合成的产物(VIα,m＝n＝1)溶于30ml甲醇中，形成透明溶液。在室温下添加3ml氢氧化钠溶液(NaOH,1.0N)。维持搅拌4小时。在TLC(洗脱液：氯仿/甲醇，4/1，v/v)中不再存在起始产物(VIα)。用盐酸(HCl,1.0N)将反应混合物中和至pH 6，并且在25℃下于减压下蒸发。用硅胶色谱柱(洗脱液：氯仿/甲醇，2.5/1，v/v)纯化残余物。获得380mg(收率＝98.6％)产物(Iα)。
1H NMR(CD3OD):δ7.88(lH,t,2J＝3.13Hz,NH),5.50(lH,d,2J＝4.06Hz,H4),4.00(2H,d,2J＝3.13Hz),3.90(2H,s),3.80(lH,t,H3),3.56(lH,t,Hl7),从2.40至0.70(m),1.02(3H,s,H19),0.76(3H,s,H18).13C NMR(CD3OD):δ174.2,173.5,152.5,119.0,82.4,74.0,68.3,55.4,52.0,44.0,42.5,38.7,37.9,37.2,33.7,33.4,33.2,30.6,25.3,24.3,22.2,18.6,11.6.IR(cm-1):3369,2921,2847,1715,1624,1538,1436,1422,1233,1078.MS(LC-MS):404.4(M-H)-,809.9(2M-H)-.
实施例8：式(Iα)的本发明的睾酮衍生物的制备
式(Iα)的化合物，其中m＝n＝1且
重复实施例7中描述的方法，然后继续如下。
在装有磁力搅拌的烧瓶中将实施例7中制备的式(Ibα)的产物(120mg,0.295mmol)溶于10ml无水1,2-二甲氧基乙烷(DME)中。添加35.1mg(0.295mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)并形成透明溶液。添加61.7mg(0.295mmol)的1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)。将混合物在室温下搅拌4小时30分钟。将反应混合物过滤，并且利用旋转式蒸发器不加热蒸发滤液。将获得的残余物用6.0ml无水二氯甲烷洗涤，然后真空干燥。获得90.4mg(收率＝61.0％，纯度：HPLC中85％)产物(Iα)。在氮气下将产物储存于-20℃下。
1H NMR(CDCl3):δ7.17(lH,NH),5.42(lH,H4),4.45(2H,d),4.03(2H,s),3.76(lH,H3),3.62(lH,t,H17),2.84(4H,s),从2.30至0.80(m),1.05(3H,s,H19),0.75(3H,s,H18).13C NMR(CDCl3):δ171.2,168.7,165.7,152.0,117.4,81.9,73.1,67.5,53.9,50.6,43.0,38.3,37.7,36.6,35.8,32.4,32.3,32.1,30.5,25.6,24.3,23.4,21.1,18.2,11.1.
实施例9：本发明的缀合物1 17β-羟基-3β-羧基甲氧基雄甾-4-烯/碱性磷酸酶的制备
在2-8℃下于磁力搅拌的同时将0.3ml的20mg/ml重组碱性磷酸酶(ALP)溶液在管(截止阈值6000-8000Da,Spectrum Laboratories,USA)中对300ml硼酸盐缓冲液50mM pH 7.6透析过夜。在透析结束时，通过读取在280nm处的光密度来确定蛋白的浓度，并且将这个浓度调整至8mg/ml。
将实施例2中获得的酯17-β-羟基-3-β-羧基甲氧基雄甾-4-烯-N-羟基琥珀酰亚胺(或NHS)以1mg/ml的浓度溶于二甲基甲酰胺(DMF)。
对于类型(1-3)的偶联(1摩尔碱性磷酸酶-3摩尔睾酮)，将312.5μl的ALP溶液与30μl的酯17-β-羟基-3-β-羧基甲氧基雄甾-4-烯-NHS溶液混合。对于类型(1-5)的偶联，将312.5μl的ALP溶液与50μl的酯溶液混合。将混合物在30℃的水浴上温育1h，同时温和地磁力搅拌。
然后，通过添加在水中稀释的1mM赖氨酸来阻断反应。添加的赖氨酸的量与用于偶联的酯的量是等摩尔的。因此对于类型(1-3)的偶联，添加68μl赖氨酸溶液，而对于类型(1-5)的偶联，添加112μl。将混合物在18/25℃下于轮上温育20min。
终止反应之后，在磁力搅拌的同时将缀合物在管(截止阈值约7000Da)中于18/25℃下对250ml的Tris缓冲液50mM pH 7.4、NaCl9g/l、MgCl2 5mM、ZnCl2 0.1mM、叠氮化物0.9g/l透析1h。1h之后，将管转移至新浴中，通常包含250ml相同缓冲液。在磁力搅拌的同时于2/8℃下继续透析过夜。
在透析结束时，用透析缓冲液将缀合物的体积补足至1ml。然后通过疏水-相互作用色谱利用色谱链中安装的RESOURCE苯基柱(Cat No.17-1186-01,GE Healthcare Lifesciences)纯化缀合物。将泵流速设置在0.5ml/min。缓冲液TA为Tris 50mM pH 7.4、NaCl 9g/l、MgCl2 5mM、ZnCl20.1mM、叠氮化物0.9g/l、(NH4)2SO4 0.8M。缓冲液TB为Tris 50mM pH 7.4、NaCl 9g/l、MgCl2 5mM、ZnCl2 0.1mM、叠氮化物0.9g/l，这是透析缓冲液。
将RESOURCE苯基柱在缓冲液TA中平衡。将待纯化的缀合物与缓冲液Tris 50mM pH 7.4、NaCl 9g/l、MgCl2 5mM、ZnCl2 0.1mM、叠氮化物0.9g/l、(NH4)2SO4 1.6M等体积(475μl缀合物和475μl缓冲液)混合。这个步骤给出缓冲液TA中的缀合物。进样缀合物之后在30ml缓冲液TA中洗涤。然后应用0-100％的TB梯度30ml，然后在缓冲液TB中洗涤10ml并在水中洗涤10ml。通过测量280nm处的光密度监测色谱的进程。将从洗脱的42ml开始直到51ml(即总计10ml)的级分回收，合并，然后利用Amicon cell(Amicon stirred cells,Millipore)、具有10000Da的截止阈值的Amicon PM膜和缓冲液TB通过渗滤进行浓缩。在这个步骤期间，缀合物溶液的体积减少至约1ml。将缀合物储存在2/8℃下直至它们用于免疫测定。
实施例10：利用本发明的缀合物1 17-β-羟基-3-β-羧基甲氧基雄甾-4-烯/碱性磷酸酶测定睾酮以及与利用现有技术的缀合物的测定的比较
用于睾酮测定的试剂盒(bioMérieux)(Cat.No 30418)用作参考免疫测定，其是具有CE标记的商业试剂盒。这个测定描述于盒子ref.09345F-fr-2010/08中的说明书中，并且其利用自动化免疫分析仪进行。
一次性圆锥体用作反应的固相和移液系统。筒由覆盖有密封和标记铝箔的10个孔组成。第一个孔包含预制部分以促进样品的引入。最后一个孔为光学比色杯，其中测量底物的荧光。中间孔中包含分析所需的各种试剂。
用于睾酮测定的试剂盒(bioMérieux Cat.No 30418)中包含的圆锥体已用绵羊抗兔IgG多克隆抗体敏化，然后用兔抗睾酮多克隆抗体敏化。将表面钝化并且其准备好使用。
将待测定的样品放入筒的第一个孔中。然后测定反应的所有步骤通过分析仪自动进行。将待测定的样品与缀合物混合，所述缀合物是用碱性磷酸酶标记的睾酮衍生物，但是其中3位未如本发明进行修饰。这种缀合物称为“缀合物”或现有技术的缀合物。
样品中存在的睾酮和缀合物的睾酮衍生物之间发生竞争，竞争圆锥体上固定的抗睾酮抗体的位点。用缓冲液Tris-NaCl(0.05mol/l)pH 7.4或用二乙醇胺(1.1mol/l)pH 9.8进行洗涤步骤，使得可以去除未固定的化合物。在最后的显影步骤期间，吸出底物4-甲基伞形酮基磷酸酯，然后引入圆锥体中；缀合物的酶催化4-甲基伞形酮中这种底物的水解反应，并且在450nm处测量从后者发射的荧光。荧光信号的值与样品中存在的睾酮的浓度成反比。相对于校准曲线技术这个浓度。
对于其他测定，我们使用睾酮试剂盒(Cat.No 30418)的试剂和随试剂盒的说明书中给出的测定方案，进行以下修改：
·将圆锥体用其他抗睾酮抗体敏化：2种小鼠单克隆免疫球蛋白G(IgG)，克隆19E10H6和15H9H10(bioMérieux)，分别称作Ab1和Ab2，以及1种绵羊单克隆IgG，克隆testo3.6A3(Bioventix)，其称作Ab3。在参考测定形式的圆柱体中时，抗睾酮抗体被事先吸附在圆锥体上的抗物种多克隆抗体捕获。对于Ab1和Ab2，其为绵羊抗小鼠IgG多克隆抗体，而对于Ab3，其为驴抗绵羊IgG多克隆抗体。将抗物种抗体在敏化溶液中稀释至1-12μg/ml的浓度。在+18/25℃下温育6h之后，用盐水溶液进行洗涤。然后添加包含蛋白或肽类型的饱和剂的抗睾酮抗体溶液(抗体的浓度：0.01-0.2μg/ml)。在+18/25℃下继续敏化/钝化过夜。然后将圆锥体倒空并干燥。
·对于用单克隆抗体的测试，用稀释至1/2.5的缀合物测试用抗体Ab1敏化的圆锥体。用实施例9中制备的本发明的缀合物1测试用抗体Ab2和Ab3敏化的圆锥体。对于用抗体Ab2敏化的圆锥体的测试，以3ng/ml的浓度使用这种最后提到的缀合物。
·基于通过向女性血清补充乙醇溶液中的睾酮产生的标准10-点范围来转化为剂量。每个点的标称浓度为：0.001ng/ml–0.03ng/ml–0.18ng/ml-0.41ng/ml–0.76ng/ml–1.29ng/ml–1.91ng/ml–3.82ng/ml–7.48ng/ml–11.55ng/ml。
·每个测定采用的样品体积为200μl。
用每种测定形式测量标准范围。下文表1总结了对于标准范围的稀释，获得为RFV信号(＝相对荧光值)和B/B0％比例的结果。比例B/B0是对测试的范围点获得的信号除以对范围点0.001ng/ml睾酮获得的信号，乘以100。
表1
B/B0％比例值在图1中示出，该图给出这些值作为每种形式的标准范围的点的浓度的算法的函数，即利用现有技术的缀合物的两种形式((i)REF，其为现有技术的参考测定，对应于睾酮测定的商业试剂盒(bioMérieux,Cat.No 30418)，和(ii)Ab1+缀合物)，以及利用本发明的缀合物1的两种形式(Ab2+本发明的缀合物1，和Ab3+本发明的缀合物1)。
图1中的图显示最灵敏的两种测定形式是利用本发明的缀合物的两种测定形式。事实上，最灵敏的测定形式是结合抗体Ab3和本发明的缀合物1的形式。从约0.2ng/ml睾酮开始观察到信号的50％减少。对于结合抗体Ab2和本发明的缀合物1的形式，以及上的参考测定，达到50％的B/B0比例需要约1ng/ml睾酮。形式Ab2+本发明的缀合物1比参考形式稍微更灵敏。最后，用形式Ab1+缀合物，达到50％需要3.82ng/ml睾酮。它是最不灵敏的形式。
第二，为了证实形式Ab2+本发明的缀合物1比参考形式REF，睾酮试剂盒(说明书中推荐的测量范围为0.1-13ng/ml)要灵敏得多，针对获得自Etablissementsdu Sang(the French National BloodService)的血清样品比较这两种形式。这些是采集自女性的4个样品(用F编码)，其血清睾酮水平低于1ng/ml，以及采集自男性的2个样品(用M编码)。结果在表2中示出。由第三方实验室通过给出低于1ng/ml的浓度的准确测量的技术如ID/GC-MS质谱确定理论浓度。表2中示出的每个测定的比例测量的[c]/理论[c]X 100提供每个测定的准确性的评价，[c]表示浓度。这个比例越接近100％，则测量越准确。
表2
表2中的结果显示使用本发明的缀合物的形式比上的参考测定更准确，特别是对于女性中发现的低水平血清睾酮的测定。
实施例11：本发明的缀合物2 17-β-羟基-3-β-羧基甲氧基雄甾-4-烯/生物素的制备
这里该分子缩写为睾酮-3β-EMC-DAP-生物素，DAP为二氨基丙基，并且该分子具有下式。
在装有磁力搅拌的50-ml烧瓶中，将100mg(0.287mmol)实施例1中获得的17-β-羟基-3β-羧基甲氧基雄甾-4-烯酸溶于7ml二甲氧基乙烷(DME)酐中。添加50mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，并且在室温下维持搅拌3min。添加69mg(0.334mmol)的N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)并获得透明溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。
将反应混合物过滤，并且将由此获得的滤液直接使用。将100mg(0.241mmol)的N-(+)-生物素基-3-氨基丙基三氟乙酸铵(生物素-NH-DAP，TFA盐，Sigma-Aldrich Cat.No.71776)与1.5ml的1N NaHCO3溶液混合，然后添加至滤液中。在室温下维持搅拌14h。
将反应混合物在室温下于减压下干燥。通过硅胶60(0.040-0.063mm,Merck Cat.No.109385)上的色谱纯化获得的残余物，用洗脱液：二氯甲烷/甲醇，8/1，v/v开始，并且二氯甲烷甲醇，5/1，v/v完成纯化。获得125mg产物，其对应于82％的收率。睾酮-3β-EMC-DAP-生物素为白色粉末。
通过高效液相色谱(HPLC)分析产物。使用的柱为Thermokromasil C18,150x4.6mm，并且洗脱液为梯度的乙腈、水(0.1％三氟乙酸)的混合物。通过测量在214nm处的吸光度来监测色谱。以这种方式确定的产物纯度为90.1％。
实施例12：利用本发明的缀合物2睾酮-3β-EMC-DAP/生物素测定睾酮
将在PBS缓冲液1x中稀释至10μg/ml的100μl/孔的小鼠抗山羊Fc IgG单克隆抗体(克隆9A4A5,bioMérieux)分布于96-孔微孔板(Nunc MaxisorpF96)中。将微孔板在室温下温育过夜以获得抗体的吸附。将微孔板清空，然后添加300μl/孔的包含蛋白或肽类型的饱和剂的钝化缓冲液(缓冲液Tris0.2M pH 6.2)，以及稀释至0.2μg/ml的绵羊抗睾酮单克隆抗体克隆3.6A3(Ab3-bioVentix)。将微孔板在37℃下温育1h。用TBS(Tris缓冲盐水)--200.05％进行3次洗涤。将实施例10中使用的范围点在Tris缓冲液中稀释至1/2；将100μl的这些稀释液分布于板的孔中。在37℃下温育1h之后，将孔清空，并且添加0.2ng/孔的Tris缓冲液中的本发明的缀合物2睾酮-3β-EMC-DAP-生物素。与缀合物的反应在37℃下进行15分钟，然后是3次洗涤。添加100μl/孔的在TBS--20 0.05％，BSA 2％中稀释至1/20 000的链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液(Jackson ImmunoresearchCat.No.016-30-084)，并且将微孔板在37℃下温育30min。3次洗涤之后，添加100μl/孔的1-步Ultra TMB底物(Thermo Scientific,Cat.No.34028)，并且将微孔板在室温下避光温育5min。然后通过添加100μl的2M硫酸来终止反应。在酶标仪中测量在450nm和630nm处的光密度(OD)。对于每个孔，在450nm处的光密度减去在630nm处的光密度。应用这个方案获得的结果在表3中示出。
表3
来自表3的B/B0％比例值在图2中显示为给出这些值作为标准范围的点的浓度的算法的函数的图。图2给出使用Ab2+本发明的缀合物1的形式的实施例10中获得的值。
这个图显示在微孔板上用抗体Ab3+本发明的缀合物2睾酮-3β-EMC-DAP-生物素获得的睾酮测定范围的特征与实施例10中在上用形式Ab2+本发明的缀合物1获得的相当。因此这种用本发明的缀合物的微孔板测定比使用缀合物的测定更灵敏。
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Claims (23)

1.以下通式(I)的睾酮衍生物：
其中
n为1-10的整数，并且
Y表示活化或待活化的基团，其允许与分子的伯胺形成酰胺键。
2.权利要求1的睾酮衍生物，其特征在于n为1-5。
3.权利要求1或2的睾酮衍生物，其特征在于Y选自-OH、-NH-(CH2)m-COOH、-N3、
其中m为1-10的整数。
4.权利要求3的睾酮衍生物，其特征在于m为1-5。
5.权利要求1或2的睾酮衍生物，其特征在于Y选自-OH和-NH-(CH2)m-COOH和其中m为1-10，并且优选m等于1。
6.权利要求1-5中任一项要求保护的睾酮衍生物，其特征在于在3位的碳处其为β衍生物的形式。
7.权利要求1-5中任一项要求保护的睾酮衍生物，其特征在于在3位的碳处其为α衍生物的形式。
8.一种缀合物，其由权利要求1-7中任一项的睾酮衍生物和标记物组成。
9.权利要求1-7中任一项的睾酮衍生物或权利要求8的缀合物在确定生物学样品中的睾酮浓度中的用途。
10.一种通过竞争性免疫测定确定生物学样品中的睾酮浓度的方法，所述方法包括由以下组成的步骤：
a)在所述样品内使(i)睾酮结合配对物与(ii)选自权利要求1-7中任一项的睾酮衍生物和权利要求8的缀合物的化合物接触，所述组分(i)和(ii)之一适合发射信号，
b)任选地等待足够的时间以允许竞争反应，以及
c)测量信号的强度，并且通过与建立测量的信号强度和睾酮浓度之间关系的校准曲线进行比较来由其推断睾酮的浓度。
11.权利要求10的确定睾酮浓度的方法，其特征在于化合物(ii)是权利要求8的缀合物。
12.一种用于实施权利要求10或11的方法的诊断试剂盒，其包含权利要求1-7中任一项的睾酮衍生物或权利要求8的缀合物。
13.式(Ia)的化合物在制备权利要求1-7中任一项的式(I)的睾酮衍生物中的用途，式(Ia)为：
其中n为1-10的整数。
14.一种制备以下通式(Iaβ)的3位为β异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，
所述方法包括由以下组成的步骤：
(1)使睾酮与乙酸酐反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(Iiβ)的化合物：
其中Ac表示-CO-CH3，
(2)使由此获得的式(Iiβ)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaβ)的化合物。
15.一种制备以下通式(Ibβ)的3位为β异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，m为1-10的整数，
所述方法包括由以下组成的步骤：
(1)使睾酮与乙酸酐反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(Iiβ)的化合物：
其中Ac表示-CO-CH3，
(2)使由此获得的式(Iiβ)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaβ)的化合物：
(3)使由此获得的式(Iaβ)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺在碳二亚胺衍生物的存在下反应以产生式(Ivβ)的化合物：
(4)使由此获得的式(Ivβ)的化合物与式(V)：H2N-(CH2)m-COOR1的化合物反应，其中R1为烷基或芳基，以产生式(Viβ)的化合物：
(5)使由此获得的式(Viβ)的化合物与碱在溶剂的存在下反应，以获得式(Ibβ)的化合物。
16.一种制备以下通式(Iβ)的3位为β异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，并且Y表示：
所述方法包括由以下组成的步骤：
(1)使睾酮与乙酸酐反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(Iiβ)的化合物：
其中Ac表示-CO-CH3
(2)使由此获得的式(Iiβ)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaβ)的化合物：
(3)使由此获得的式(Iaβ)的化合物在碳二亚胺衍生物的存在下，取决于最终基团Y，与选自以下化合物的试剂反应，以获得式(Iβ)的化合物：
17.一种制备以下通式(Iβ)的3位为β异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，并且Y表示：
其中m为1-10的整数，
所述方法包括由以下组成的步骤：
(1)使睾酮与乙酸酐反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(Iiβ)的化合物：
其中Ac表示-CO-CH3，
(2)使由此获得的式(Iiβ)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaβ)的化合物：
(3)使由此获得的式(Iaβ)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺在碳二亚胺衍生物的存在下反应以产生式(Ivβ)的化合物：
(4)使由此获得的式(Ivβ)的化合物与式(V)：H2N-(CH2)m-COOR1的化合物反应，其中R1为烷基或芳基，以产生式(Viβ)的化合物：
(5)使由此获得的式(Viβ)的化合物与碱在溶剂的存在下反应，以获得式(Ibβ)的化合物：
(6)使由此获得的式(Ibβ)的化合物在碳二亚胺衍生物的存在下，取决于最终基团Y，与选自以下化合物的试剂反应，以获得式(Iβ)的化合物：
18.一种制备以下通式(Icβ)的3位为β异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，
所述方法包括由以下组成的步骤：
(1)使睾酮与乙酸酐反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(Iiβ)的化合物：
其中Ac表示-CO-CH3，
(2)使由此获得的式(Iiβ)的化合物与式(III)：N2-CH-(CH)n-1COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaβ)的化合物：
(3)使由此获得的式(Iaβ)的化合物与H2NNH2在碳二亚胺衍生物的存在下反应以获得式(VIIβ)的化合物：
(4)使由此获得的式(VIIβ)的化合物与HONO反应以获得式(Icβ)的化合物。
19.一种制备以下通式(Iaα)的3位为α异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，
所述方法包括由以下组成的步骤：
(1)使睾酮与叔丁基二甲基氯硅烷反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(VIIIβ)的化合物：
其中–SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(2)使由此获得的式(VIIIβ)的化合物与三苯膦、苯甲酸和偶氮二羧酸二乙酯反应，然后在溶剂的存在下与碱反应，以将3位的β异构体转化为α异构体，从而获得式(VIIIα)的化合物：
其中-SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(3)使由此获得的式(VIIIα)的化合物与式(III)：N2CH-(CH)n-1COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaα)的化合物。
20.一种制备以下通式(Ibα)的3位为α异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，m为1-10的整数，
所述方法包括由以下组成的步骤：
(1)使睾酮与叔丁基二甲基氯硅烷反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(VIIIβ)的化合物：
其中–SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(2)使由此获得的式(VIIIβ)的化合物与三苯膦、苯甲酸和偶氮二羧酸二乙酯反应，然后在溶剂的存在下与碱反应，以将3位的β异构体转化为α异构体，从而获得式(VIIIα)的化合物：
其中-SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(3)使由此获得的式(VIIIα)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaα)的化合物：
(4)使由此获得的式(Iaα)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺在碳二亚胺衍生物的存在下反应以产生式(Ivα)的化合物：
(5)使由此获得的式(Ivα)的化合物与式(V)：H2N-(CH2)m-COOR1的化合物反应，其中R1为烷基或芳基，以产生式(Viα)的化合物：
(6)使由此获得的式(Viα)的化合物与碱在溶剂的存在下反应，以获得式(Ibα)的化合物。
21.一种制备以下通式(Iα)的3位为α异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，并且Y表示：
所述方法包括由以下组成的步骤：
(1)使睾酮与叔丁基二甲基氯硅烷反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(VIIIβ)的化合物：
其中-SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(2)使由此获得的式(VIIIβ)的化合物与三苯膦、苯甲酸和偶氮二羧酸二乙酯反应，然后在溶剂的存在下与碱反应，以将3位的β异构体转化为α异构体，从而获得式(VIIIα)的化合物：
其中-SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(3)使由此获得的式(VIIIα)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaα)的化合物：
(4)使由此获得的式(Iaα)的化合物在碳二亚胺衍生物的存在下，取决于最终基团Y，与选自以下化合物的试剂反应，以获得式(Iα)的化合物：
22.一种制备以下通式(Iα)的3位为α异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，并且Y表示：
其中m为1-10的整数，
所述方法包括由以下组成的步骤：
(1)使睾酮与叔丁基二甲基氯硅烷反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(VIIIβ)的化合物：
其中-SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(2)使由此获得的式(VIIIβ)的化合物与三苯膦、苯甲酸和偶氮二羧酸二乙酯反应，然后在溶剂的存在下与碱反应，以将3位的β异构体转化为α异构体，从而获得式(VIIIα)的化合物：
其中-SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(3)使由此获得的式(VIIIα)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaα)的化合物：
(4)使由此获得的式(Iaα)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺在碳二亚胺衍生物的存在下反应以产生式(IVα)的化合物：
(5)使由此获得的式(IVα)的化合物与式(V)：H2N-(CH2)m-COOR1的化合物反应，其中R1为烷基或芳基，以产生式(VIα)的化合物：
(6)使由此获得的式(VIα)的化合物与碱在溶剂的存在下反应，以获得式(Ibα)的化合物：
(7)使由此获得的式(Ibα)的化合物在碳二亚胺衍生物的存在下，取决于最终基团Y，与选自以下化合物的试剂反应，以获得式(Iα)的化合物：
23.一种制备以下通式(Icα)的3位为α异构体形式的睾酮衍生物的方法：
其中n为1-10的整数，
所述方法包括由以下组成的步骤：
(1)使睾酮与叔丁基二甲基氯硅烷反应以保护17位的OH官能团，然后在溶剂的存在下与还原剂反应以还原3位的羰基并获得式(VIIIβ)的化合物：
其中-SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(2)使由此获得的式(VIIIβ)的化合物与三苯膦、苯甲酸和偶氮二羧酸二乙酯反应，然后在溶剂的存在下与碱反应，以将3位的β异构体转化为α异构体，从而获得式(VIIIα)的化合物：
其中-SiMe2Bu-t表示叔丁基二甲基硅烷基，
(3)使由此获得的式(VIIIα)的化合物与式(III)：N2CH-(CH2)n-1-COOC2H5的化合物反应，然后在溶剂的存在下与碱反应以获得式(Iaα)的化合物：
(4)使由此获得的式(Iaα)的化合物与H2NNH2在碳二亚胺衍生物的存在下反应以获得式(VIIα)的化合物：
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