CN104558185B

CN104558185B - 用于检测乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

Info

Publication number: CN104558185B
Application number: CN201410830096.4A
Authority: CN
Inventors: 袁宗辉; 何秀平; 彭大鹏; 潘源虎; 王玉莲; 陈冬梅; 陶燕飞; 刘振利
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: CN104558185A

Abstract

本发明公开了一种能识别乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的特异性单克隆抗体和一种用于检测乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的酶联免疫方法及试剂盒，本发明的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201496的杂交瘤细胞株DMEQ1A3所分泌的。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体可以同时识别脱二氧乙酰甲喹和脱二氧喹乙醇，具有较高的灵敏度和特异性。本发明建立的ELISA方法和试剂盒能同时检测乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物在肉类食品中的残留，具有检测效率和灵敏度高，精密度和准确度好等优点。

Description

用于检测乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，涉及一种能识别乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的单克隆抗体和一种用于检测乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的酶联免疫方法(ELISA)及试剂盒。

背景技术

脱二氧乙酰甲喹和脱二氧喹乙醇属于喹噁啉类药物，是原型药物乙酰甲喹和喹乙醇在动物体内脱氧代谢的产物，具有苯并吡嗪1,4-二氮萘的基本结构，乙酰甲喹和喹乙醇抗菌谱较广，抗革兰氏阴性菌的作用要强于阳性菌，在兽医临床和养殖业得到了广泛应用。人们为了追求经济利益而滥用药物，导致药物在动物食品中大量残留。喹噁啉类药物会对动物产生三致作用、光敏反应和肾上腺皮质损坏等毒副作用，部分文献报道，药物对动物机体还有一定程度的生殖毒性和细胞毒性。

现已发展了多种用于检测该类药物残留的方法，如微生物方法、仪器方法及酶联免疫方法。微生物法被用于大量样品的初步筛选，仪器方法常用于对阳性样品的确证，ELISA方法既可以定性也可以半定量。在这些残留分析方法中，仪器方法由于其所需仪器昂贵、操作复杂、检测费用高，而不利于大批量样品的筛选及现场检测。微生物法虽在残留筛选高通量上表现出良好的性能，但方法缺乏特异性，不能确证残留物的种类，且所用细菌对不同种类的抗菌药物敏感性存在差异，易导致假阴性和假阳性结果的产生。而ELISA方法操作简便、高通量、高灵敏度、低费用，能很好的克服仪器方法和微生物方法的缺陷。

但目前，针对喹噁啉类代谢物的检测方法鲜有报道，所以，建立一种特异性较好、灵敏度较高的单克隆抗体以检测动物体内或肉类食物中乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的残留显得十分必要。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能同时识别乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的单克隆抗体；

本发明的第二个目的是利用该单克隆抗体，制备一种用于乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物检测的酶联免疫试剂盒。

本发明的第三个目的是利用该试剂盒，建立一种能用于乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物非诊断目的检测的酶联免疫方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种能识别乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCCNO:C201496的杂交瘤细胞株DMEQ1A3所分泌的。

上述杂交瘤细胞株DMEQ1A3，保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO:C201496。

所用的免疫原是由结构如式(2)所示的化合物(羧基-脱二氧喹赛多，COOH-DCYX)和人血清白蛋白偶联制备的。

进一步，本发明提供了一种检测肉类食物中乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物残留的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：

(1)将结构如式(1)所示的化合物(脱二氧乙酰甲喹-羧甲基羟胺，DMEQ-AOAA)与卵清白蛋白(OVA)偶联得到包被原(DMEQ-AOAA-OVA)；

(2)用保藏号为CCTCC NO:C201496的杂交瘤细胞株DMEQ1A3制备单克隆抗体；

(3)用步骤(2)的包被原包被固相载体；

(4)将待测样品提取后进行酶联免疫检测，

优选地，所述待测样品的提取方法是：将待测样品用体积比为乙酸乙酯∶乙腈＝1∶1的混合溶剂振荡提取，再加入1mol/L的NaOH，静置，取有机层用氮气吹干，加入稀释液离心后取上清，

所述稀释液的成分为：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，Tween20 0.5mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4。

本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的酶联免疫试剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的酶联免疫检测。

所述乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物是脱二氧乙酰甲喹、脱二氧喹乙醇。

本发明的主要优点是：

1、本发明在单克隆抗体制备时，采用COOH-DCYX作为半抗原，该半抗原具有脱二氧喹乙醇、脱二氧乙酰甲喹和脱二氧喹烯酮的共同母核结构，由该半抗原制备的单克隆抗体可同时识别脱二氧乙酰甲喹和脱二氧喹乙醇。

2、本发明制备的单克隆抗体对脱二氧乙酰甲喹和脱二氧喹乙醇的识别灵敏度高，IC₅₀分别为0.8μg/L和3μg/L；该抗体对其它多数喹噁啉类药物没有识别，显示出良好的特异性。

3、本发明在制备检测抗原时，采用脱二氧乙酰甲喹与羧甲基羟胺的连接物作为异源包被，与免疫原的半抗原有一定的差异，增加了抗原与抗体间的亲和力，相对于同源包被的结果，抗体灵敏度有显著的提高。

4、本发明建立的ELISA方法和试剂盒能同时检测乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物在肉类食物中的残留，从而防止药物蓄积对人体造成的毒副作用。方法准确度高，精密度好，一次测定即可完成，与现有的检测方法相比，在检测药物的种类和效率上具有明显的优势，可以节省大量的时间和成本，具有更好的市场价值。

5、方法中所涉及的样品处理简单，易操作，样品处理所用的有机试剂对操作者身体健康危害相对较小。

附图说明

图1为本发明所使用的半抗原COOH-DCYX、人血清白蛋白(HSA)和COOH-DCYX-HSA偶联物(免疫原)的紫外扫描图谱。

图2为本发明所使用的半抗原(DMEQ-AOAA)、卵清白蛋白(OVA)和DMEQ-AOAA-OVA偶联物(包被原)的紫外扫描图谱。

图3为本发明的单克隆抗体与脱二氧乙酰甲喹标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为脱二氧乙酰甲喹(DMEQ)标准溶液浓度对数值，Y轴为脱二氧乙酰甲喹标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1免疫原和包被原的制备

1.1羧基-脱二氧喹赛多(COOH-DCYX)与人血清白蛋白(HSA)偶联物(COOH-DCYX-HSA)的制备

取29.3mg COOH-DCYX，溶于1mL DMSO中，加入NHS 15.0mg和DCC 20.2mg，室温下反应活化12h，离心去除沉淀，得到A液；再取HSA 66.0mg，溶于6mL PBS(pH＝7.4)中，此为B液；将A液逐滴加入B液中，常温条件下避光反应12h。反应完毕后，将反应液转入透析袋中，4℃PBS中透析5d，每4～6h更换一次透析液，透析完后将样品冷冻干燥，即得偶联物COOH-DCYX-HSA，置－20℃保存。反应式如下：

1.2脱二氧乙酰甲喹-羧甲基羟胺与卵清蛋白偶联物(DMEQ-AOAA)和(DMEQ-AOAA-OVA)的制备

DMEQ-AOAA的制备：称取脱二氧乙酰甲喹200mg，加入6mL的吡啶使之溶解。加入羧甲基羟胺130mg，60℃反应6～8h，用薄层色谱板监测反应历程，展开剂用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。待反应完成后，用旋转蒸发仪除去吡啶，加入20mL饱和碳酸氢钠溶液。再加入乙酸乙酯50mL，摇晃均匀后弃有机层，水层用盐酸调pH＝3。再用乙酸乙酯萃取2次，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液蒸干即得灰白色固体DMEQ-AOAA，反应式如下：

DMEQ-AOAA-OVA的制备：取25.0mg DMEQ-AOAA，溶于1mL DMF中，加入NHS 15.0mg和DCC 20.2mg，室温下反应活化12h，离心去除沉淀，得到A液；再取OVA 44.0mg，溶于6mL PBS(pH＝7.4)中，此为B液；将A液逐滴加入B液中，4℃条件下避光反应12h。反应完毕后，将反应液转入透析袋中，4℃PBS中透析5d，每4～6h更换一次透析液，透析完后将样品冷冻干燥，即得偶联物DMEQ-AOAA-OVA，置-20℃保存。合成路线如下：

实施例2单克隆抗体的制备

杂交瘤细胞的制备：参照杨汉春《动物免疫学》，以实施例1制备的免疫原羧基-脱二氧喹赛多(COOH-DCYX)-人血清白蛋白偶联物(COOH-DCYX-HSA)免疫Balb/C小鼠(购自湖北省医学科学院实验动物中心)。免疫程序为：基础免疫用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下；以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液进行加强免疫。从免疫三次起，每次免疫后第8天采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价。免疫合格的小鼠(效价高、灵敏度好)停止免疫以备融合。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1～2×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫脾细胞(1:10～1:15)的比例于50mL离心管，用15mLRPMI-1640基础液重悬细胞，1500r/min离心5min，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的聚乙二醇(PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。打开计时器，用1mL吸管吸取0.8mLPEG，手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将PEG缓慢的滴加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，1min内加完，持续搅拌30s。用吸管取10mL基础液，沿管壁缓慢加到融合细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打)，5min内分别加1mL，2mL，3mL，4mL，最后补加基础液到40mL，加完后，盖上盖子，反复颠倒几次，使细胞混匀。800r/min5min离心，弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基，用吸管将离心管中的融合细胞轻轻搅拌起来，液面附近逐滴滴入到含饲养细胞的血清瓶中，搅拌混匀，动作要轻将细胞轻轻搅拌起来，千万不要吹打。颠倒混匀。然后将细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融合可接种4～6块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含10⁴左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

融合的当天计为0d，前3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基；第5d每孔吸出l/2培养上清(100μL)，再加入1滴HT完全培养基；以后每隔2d同上法吸去l/2～3/4培养上清，在7d后换入HT完全培养基。

待融合细胞集落长至培养孔1/10～1/5，同时用建立的间接ELISA方法进行筛选。与零药物孔相比，药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择2～6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。

经过5～6次克隆，最终筛选出分泌抗脱二氧乙酰甲喹抗体的单克隆杂交瘤细胞株，经染色体计数，该杂交瘤细胞的染色体数目为101.4。申请人将其命名为DMEQ1A3，并于2014年05月20日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201496。

腹水单抗制备与鉴定：将该细胞株1A3经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。Thermo Scientific公司鼠单克隆抗体快速ELISA同型检测试剂盒的操作要求，对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG₁亚型。

实施例3脱二氧乙酰甲喹和脱二氧喹乙醇间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)

磷酸盐缓冲液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；

包被液：取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加三蒸水至1000mL，调节pH值至9.6；

洗涤液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，Tween200.5mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；

封闭液：卵清蛋白1g溶于100mL磷酸盐缓冲液中；

底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；

底物液B：Na₂HPO₄14.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢脲6.4mL，加双蒸水至1000mL；

底物混合液：将A液和B液按体积比1∶1混合即得，现配现用；

终止液：2mol/L硫酸溶液。

3.2包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

选择上述合成的DMEQ-AOAA-OVA作为包被原，用包被液稀释成64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L等8个浓度，在96孔酶标板，从第一至第六列依次加入，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液250μL，37℃封闭120min；洗涤3次，拍干，在酶标板的每个孔加入50μL磷酸盐缓冲液(PBS)，然后第一行至第六行再依次加入50μL磷酸盐缓冲液稀释的稀释倍数为2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000、256000的单克隆抗体，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干；各孔加入1:5000倍磷酸盐缓冲液稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(简称二抗，以下所指二抗均为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞弈生物技术有限公司)100μL，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干；各孔加入100μL底物混合液，避光显色15min，加入50μL终止液，用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值(OD值)，结果见表1。

结果表明，初步确定包被原DMEQ-AOAA-OVA的包被浓度为4mg/L，抗体工作浓度为1∶32000。

表1包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

3.3最佳包被原浓度和抗体工作浓度的确定

以初步确定的包被原DMEQ-AOAA-OVA包被浓度，以4mg/L包被酶标板。将脱二氧乙酰甲喹用磷酸盐缓冲液稀释成3.2μg/L、1.6μg/L、0.8μg/L、0.4μg/L、0.2μg/L、0μg/L 6个浓度，抗体以1∶25000为中间浓度，按等差设计一系列浓度梯度，其0孔与IC₅₀值见表2。选择OD值在2.0左右，IC₅₀值较低所对应的抗体稀释度为最佳一抗稀释度。结果表明，选择1∶35000为最佳抗体稀释度。

表2最佳抗体稀释度优化

抗体稀释倍数(1:X)	0孔OD值	IC₅₀(μg/L)
			15000	2.520	1.59
20000	2.312	1.25
			25000	2.016	0.94
35000	2.002	0.81
			45000	1.853	0.89

3.4标准曲线的建立

将脱二氧乙酰甲喹用磷酸盐缓冲液配制成3.2μg/L、1.6μg/L、0.8μg/L、0.4μg/L、0.2μg/L、0μg/L 6个系列浓度，每个浓度重复5孔，按照间接竞争ELISA方法测定，重复测定5次。以脱二氧乙酰甲喹溶液浓度的对数值为横坐标，B/B0为纵坐标绘制标准曲线，求出IC₅₀。本试剂盒的IC₅₀值为0.8±0.05μg/L。

3.5交叉反应试验

将脱二氧乙酰甲喹等喹噁啉类药物用磷酸盐缓冲液配制成适当浓度，用建立的ELISA方法测定各药物的IC₅₀值，每个药物3个复孔，以单克隆抗体对脱二氧乙酰甲喹的交叉反应率为100％，利用公式1计算单克隆抗体对各药物的交叉反应率。结果(表3)表明，本发明建立的间接ELISA及试剂盒对脱二氧乙酰甲喹、4-(3甲基喹噁啉-2-甲酰胺)苯甲酸和脱二氧喹乙醇的交叉反应率分别为100％、44％和27％，与3-甲基喹噁啉-2-羧酸、脱二氧喹烯酮和喹噁啉-2-羧酸药物交叉反应较低。

公式1：

表3抗体对各种喹噁啉类药物的交叉反应率

实施例4本发明脱二氧乙酰甲喹、脱二氧喹乙醇多残留检测ELISA试剂盒的组装

4.1本发明ELISA试剂盒由下述部分组成：

1)包被有包被原(DMEQ-AOAA-OVA)的固相载体(酶标板)；

2)脱二氧乙酰甲喹标准溶液6瓶，浓度分别为3.2μg/L、1.6μg/L、0.8μg/L、0.4μg/L、0.2μg/L、0μg/L；

3)保藏号为CCTCC NO:C201496的杂交瘤细胞株DMEQ1A3分泌的单克隆抗体；

4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，加双蒸水至1000mL；

6)浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，Tween205mL，加双蒸水至1000mL；

7)底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；

8)底物液B：Na₂HPO₄ 14.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至5.0～5.4；

9)终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2酶标板的制备

用包被液将DMEQ-AOAA-OVA稀释成4mg/L，每孔加入100μL，4℃过夜，倾去包被液，每孔加入250μL洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250μL，37℃孵育120min，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。

实施例5本发明的酶联免疫方法的测定程序

5.1试剂的配制

1)样品稀释液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，Tween200.5mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4。

2)洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水稀释10倍后使用。

3)底物混合液：根据每次所需用量，将配制的底物液A和底物液B按体积1∶1混匀，现配现用。

5.2样品前处理

将猪、鸡、牛肌肉样品用体积比为乙酸乙酯∶乙腈＝1∶1的混合溶剂振荡提取，再加入1mol/L的NaOH振荡，静置，取有机层用氮气吹干，加入稀释液离心后取上清。

5.3测定步骤

1)加样：向酶标板微孔中加入脱二氧乙酰甲喹系列浓度标准溶液或样品溶液50μL，然后加入单克隆抗体工作液50μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；

2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL洗涤3次并拍干；

3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液：每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；

4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL，洗涤3次并拍干；

5)加底物：每孔中加入底物混合液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育15min；

6)加终止液：每孔中加入终止液50μL；

7)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(OD值)。

5.4结果判断

标准曲线：以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B0)为纵坐标，脱二氧乙酰甲喹浓度的对数值为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，给出回归方程。

实施例6本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度、重复性试验

6.1本发明试剂盒的灵敏度试验

以标准曲线的IC₅₀值和组织最低检测限(LOD)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指标。将脱二氧乙酰甲喹标准品稀释成为3.2μg/L、1.6μg/L、0.8μg/L、0.4μg/L、0.2μg/L、0μg/L 6个浓度，每个浓度5个复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，取5次测定的IC₅₀的平均值。LOD通过以下步骤决定，测定20份空白样品的OD值，根据标准曲线的回归方程计算出相应的脱二氧乙酰甲喹浓度，然后计算出乙酰甲喹浓度的平均值和标准差(SD)，根据公式计算出最低检测限。

表4猪肌肉和猪肝脏中喹噁啉类药物的最低检测限

6.2本发明试剂盒的精密度试验

将脱二氧乙酰甲喹标准品稀释成3.2μg/L、1.6μg/L、0.8μg/L、0.4μg/L、0.2μg/L、0μg/L 6个浓度，每浓度5个复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，应用标准曲线的回归方程计算出各浓度脱二氧乙酰甲喹标准溶液的测定值，计算板内和板间变异系数，结果见表5。

表5标准曲线的板内及板间误差

6.3本发明试剂盒的准确度、重复性试验

在2g匀浆猪肌肉或猪肝脏组织中加入脱二氧乙酰甲喹、脱二氧喹乙醇的标准溶液，使脱二氧乙酰甲喹药物在组织中的浓度为0.4μg/kg、0.8μg/kg、1.6μg/kg，使脱二氧喹乙醇药物在组织中的浓度为1.5μg/kg、3μg/kg、6μg/kg每个浓度重复五次，重复测定3次。测定添加组织中的脱二氧乙酰甲喹、脱二氧喹乙醇的浓度，按照公式计算回收率，考核试剂盒的准确度；计算批内和批间变异系数，考察试剂盒的重复性。结果见表6、7，其添加回收率在80～96％之间，批内与批间变异系数≤6.8％，表明试剂盒具有可靠的准确度和良好的重现性。

表6猪肌肉中的添加回收率

表7猪肝脏中的添加回收率

Claims

1.一种能识别乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201496的杂交瘤细胞株DMEQ1A3所分泌的，所述乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物是脱二氧乙酰甲喹、脱二氧喹乙醇。

2.一株杂交瘤细胞株DMEQ1A3，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO:C201496，所述杂交瘤细胞株DMEQ1A3分泌的单克隆抗体能识别乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物，所述乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物是脱二氧乙酰甲喹、脱二氧喹乙醇。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的酶联免疫试剂盒中的应用。

4.包含权利要求1所述的单克隆抗体的试剂盒，该试剂盒是检测乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物的酶联免疫试剂盒。

5.权利要求4所述的试剂盒在乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物非诊断目的检测中的应用。

6.一种用于非诊断目的检测肉类食物中乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物残留的酶联免疫方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将结构如式(1)所示的化合物与卵清白蛋白偶联得到包被原；

(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；

(4)将待测样品提取后进行酶联免疫检测，

7.根据权利要求6所述的用于非诊断目的检测肉类食物中乙酰甲喹和喹乙醇代谢产物残留的酶联免疫方法，其特征在于：所述待测样品的提取方法是：将待测样品用体积比为乙酸乙酯∶乙腈＝1∶1的混合溶剂振荡提取，再加入1mol/L的NaOH，静置，取有机层用氮气吹干，加入稀释液离心后取上清，