CN103509757A

CN103509757A - 杂交瘤细胞株15号及其产生的抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体

Info

Publication number: CN103509757A
Application number: CN201310276061.6A
Authority: CN
Inventors: 匡华; 陈秀金; 徐利广; 胥传来; 宋姗姗; 任国艳; 张勋; 马伟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-07-03
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2033-07-03
Also published as: CN103509757B

Abstract

杂交瘤细胞株15号及其产生的抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体，属于免疫化学技术领域。本发明通过常规的细胞融合技术制备了一株鼠源的杂交瘤细胞株15号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.7215。该细胞株分泌的单克隆抗体采用间接竞争酶联免疫法测定，和10种拟除虫菊酯存在交叉反应，分别为甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟胺氰菊酯、苯醚氰菊酯和顺式氯氰菊酯的单克隆抗体，IC₅₀范围在3.2-50ng/mL之间；其产生的抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体，可用于胶体金免疫层析试纸条和免疫传感器的研制，为农产品中拟除虫菊酯残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

杂交瘤细胞株15号及其产生的抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体

技术领域

本发明涉及一株鼠源的杂交瘤细胞株15号及其产生的能同时识别10种拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体，可用于胶体金免疫层析试纸条和免疫传感器的研制，属于免疫化学技术领域。

背景技术

据统计，目前世界上已有70多种拟除虫菊酯类杀虫剂，占全世界杀虫剂市场的20%；其杀虫活力比以前提高了十倍甚至百倍；再加上拟除虫菊酯类杀虫剂对于哺乳动物和鸟类的毒性非常低，因此，拟除虫菊酯类杀虫剂的应用得到了前所未有的发展，也使农业生产获得了巨大的经济效益。然而，随之也带来了拟除虫菊酯的残留问题。尽管拟除虫菊酯类农药属于环境友好型农药，但使用不当很容易造成残留超标；污染水源、大气和土壤；通过呼吸、食物和渗入等方式进入人体，危害人类健康。据报道，长期食用拟除虫菊酯残留超标的食品，很可能会引起人类的慢性中毒，导致疾病的发生如发生皮肤瘙痒，甚至会影响下一代的健康。另外，自我国加入世贸组织以来，由于我国农产品中农残标准与欧美国家的差距较大，造成了多种具有竞争潜力的农产品包括水果、蔬菜、蜂蜜、茶叶以及大米等，屡遭国际贸易绿色壁垒的阻碍而不能出口，如茶叶中拟除虫菊酯的最高残留限量参考值（20ppm）比国外实施的标准(1ppm)高出了20倍，严重地影响了我国的对外贸易声誉，造成了巨大的经济损失。

目前，拟除虫菊酯类农药的分析方法有比色法、色谱法、免疫分析法和传感检测技术。其中色谱法应用的最为广泛，包括薄层色谱法（TLC）、气相色谱法(GC)、高效液相色谱分析方法(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(LC-MS)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳(CE)等。然而这些方法（除了TLC外）需要昂贵的仪器、专业的操作人员和复杂的样品净化，不适用于农产品中拟除虫菊酯残留的日常快速检测。随着检测拟除虫菊酯免疫分析技术的发展，不仅可以解决上述问题，并且具有高通量和低成本的优势，适于现场的批量检测。建立拟除虫菊酯类农药的免疫检测技术，首先要获得拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是提供了杂交瘤细胞株15号及其产生的抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体。

本发明的技术方案：一株分泌抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体的杂交瘤细胞株15号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7215。

所述的杂交瘤细胞株15号产生的单克隆抗体，能够广谱性地识别10种拟除虫菊酯，且灵敏度好，半数抑制浓度（IC₅₀）在3.2-50 ng/mL之间；

10种拟除虫菊酯为：甲氰菊酯（CAS 39515-41-8）、氯氰菊酯（CAS 52315-07-8）、高效氯氰菊酯（CAS-65731-84-2）、氟氯氰菊酯（CAS 68359-37-5）、高效氯氟氰菊酯（CAS 91465-08-6）、氰戊菊酯（CAS 51630-58-1）、溴氰菊酯（CAS 52918-63-5）、氟胺氰菊酯（CAS 102851-06-9）、苯醚氰菊酯（CAS 39515-40-7），顺式氯氰菊酯（CAS 67375-30-8）。

所述的单克隆抗体的应用，在于在拟除虫菊酯总量检测中的应用。

本发明将半抗原1（hapten 1，结构a）通过活性酯法和血蓝蛋白偶联，用作免疫原；将半抗原2（hapten 2，结构b）通过羧基二咪唑法和鸡卵清蛋白偶联，用作包被原。通过小鼠免疫、抗血清测定、细胞融合、筛选和亚克隆技术得到稳定分泌抗拟除虫菊酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株15号，通过体内诱生法制备腹水，辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到相应的单克隆抗体。

半抗原1（hapten1，a）和半抗原2（hapten2，b）的结构：

。

本发明的有益效果：在于该单克隆抗体可以同时识别10种拟除虫菊酯，包括甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟胺氰菊酯、苯醚氰菊酯和顺式氯氰菊酯。该单克隆抗体对不同拟除虫菊酯的IC₅₀范围在3.2-50ng/mL之间；为研制农产品中拟除虫菊酯多残检测的免疫层析试纸条提供了原料。

生物材料样品保藏：本发明提供的杂交瘤细胞株15号，分类命名为单克隆细胞株，该细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2013年 1月23日，保藏编号为CGMCC No.7215。

附图说明

图1 拟除虫菊酯群选性单克隆抗体的亚型鉴定图

图2 拟除虫菊酯群选性单克隆抗体的亲和常数测定图。

具体实施方式

本发明提供了杂交瘤细胞株15号及其分泌的抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体。下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，实施例中如无特殊说明均为常规方法。

实施例1 杂交瘤细胞株15号的制备

1、动物免疫和血清筛选

选择半抗原1（H1）和血蓝蛋白（KLH）的偶联物（H1-KLH）为免疫原，采用快免佐剂和免疫原按照一定比例简单混合后，以肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠，免疫间隔时间2周，四免后7-10d，采用间接竞争酶联免疫法测定血清的效价和抑制，选择效价高并抑制好的小鼠进行融合。

2、细胞融合

第一步，培养和收集瘤细胞。融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640培养基在5% CO₂培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1-4*10⁷，同时保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，用0.4%的台盼蓝染色计数，备用。

第二步，收集脾细胞。融合前3天，采用腹腔注射方式对选出的融合小鼠进行冲免，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。融合当天，摘眼球取血，采用颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5 min左右，采用无菌操作取出BALB/c小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度用力地在筛网上研磨脾脏，脾细胞漏出筛网得到悬液，收集，离心（1200 rpm，6 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积后，计数，备用。

第三步，融合，将脾细胞和SP2/0 瘤细胞按照质量比5-10:1比例进行混合，离心（1200 rpm，6 min），弃上清。融合过程大概约7 min。第 1 min 内，将1 mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2 min，用手握住管底，静置。第3 min和第4 min，在1 min 内滴加1 mL的RPMI-1640培养基；第5 min 和第6 min，在1 min 内滴加2 mL 的RPMI-1640培养基。第7 min，在1 min 内滴加3-4 mL的RPMI-1640 培养基。然后用RPMI-1640培养基将体积增加到15 mL。在37℃，5% CO₂培养箱中，静置5 min。离心（800 rpm，6 min），弃上清，在棉球上轻轻地弹散细胞，然后用HAT培养基重悬细胞，按照200μL/孔注入到96孔细胞板。最后，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养。

3、筛选和亚克隆

融合按第1天计，第4天进行HAT培养基半换液，第6天进行HAT培养基全换液；并且每天观察96孔细胞板中杂交瘤细胞的生长情况。第8天进行融合后细胞上清的第一次检测。在拟除虫菊酯群选性抗体的筛选过程中，同时用五种标准品氯氰菊酯、甲氰菊酯、苯醚氰菊酯、溴氰菊酯和高效氯氟氰菊酯筛选细胞上清。筛选细胞上清的方法仍然是间接竞争酶联免疫法，通常先将细胞上清稀释3倍，测定效价。然后再测每个阳性孔的抑制。因为空白值大小，对抗体灵敏度的影响很大，所以，在测定细胞上清抑制时，往往需要对细胞上清进行多个不同倍数的稀释。最后根据检测结果，选择阳性强，抑制好并且生长状态良好的细胞通过有限稀释法进行亚克隆。第一次亚克隆以后，第6天就可以取细胞上清进行测定。按照和融合后细胞检测一样的方法和原理，筛选亚克隆后细胞上清的效价和抑制。通常经过第二、三次亚克隆以后，根据阳性率98%并且整块板的抑制效果相近，选出细胞扩培和冻存。

实施例2 由杂交瘤细胞株15号分泌的抗拟除虫菊酯单克隆抗体的制备、纯化、亚型和特性鉴定

1、单克隆抗体的制备

选择健康的BALB/c 小鼠，按照0.6 mL/只小鼠的量注射无菌石蜡油。10天后，每只小鼠腹腔注射1*10⁶杂交瘤细胞。第6天后，每天观察小鼠的状态，如果小鼠的腹部明显增大，用手触摸有紧绷感，并且不愿活动时，可以收集腹水；然后离心（6000 rpm，12 min），除去红细胞等杂质，分装，-20℃冻存。

2、单克隆抗体纯化

采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用一定饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液（pH 7.0）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的抗拟除虫菊酯单克隆抗体。

3、亚型鉴定

采用美国的EnviroLogix公司的单抗亚型鉴定的快速检测试纸条测定细胞上清，根据亚型鉴定的标准图谱，判断单克隆抗体重链和轻链的类型。测定时，取0.5 mL细胞上清于1.5 mL的离心管中，将鉴定重链和轻链的试纸条分别插入细胞上清，3-5 min内显色，将检测试纸条结果和亚型鉴定的标准图谱对照，得出单克隆抗体的重链为IgG₁型，轻链为Kappa 链。

4、亲和常数的测定

将包被原从1μg/mL 开始倍比稀释六个不同的浓度进行包被，每个孔做三个平行。单克隆抗体从10μg/mL开始倍比稀释8个浓度，采用间接竞争酶联免疫方法测定单克隆抗体（mAb）的效价。然后以mAb浓度（μg/mL）的对数值为横坐标，以吸光度值Abs（450nm）为纵坐标在origin 8.5软件中绘制出4条曲线，根据绘制曲线计算出Abs（450nm）抑制50%时对应的抗体浓度，换算抗体浓度的单位mol/L，然后两两一组，根据下式计算亲和常数（Ka）

Ka=(n-1)/2{n[Ab’]t-[Ab]t}

其中，n为2个包被浓度的比值（大于1）；[Ab’]t为Abs’（450nm）降低一半时对应的抗体浓度（mol/L）。[Ab]t为Abs（450nm）降低一半时对应的抗体浓度（mol/L）。根据图2的结果，计算出抗体的亲和常数为 3*10⁸ L/mol。

5、灵敏度的测定

抗体灵敏度通常采用半数抑制浓度（IC₅₀）来表示。纯化的腹水通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）来测定单克隆抗体对10种菊酯浓度在0-1000 ng/mL之间的抑制效果，选择包被原H2-OVA（H2-OVA，半抗原2和鸡卵清蛋白OVA 的偶联物）浓度为0.4μg/mL，抗体的蛋白浓度为0.05μg/mL，测定结果用origin 8.5软件进行四参数回归拟合，根据拟合的回归方程，计算抗体对各种菊酯的IC₅₀，结果见表1。

表1 不同拟除虫菊酯灵敏度的测定结果

拟除虫菊酯名称	半数抑制浓度（ng/mL）
		甲氰菊酯	3.6
苯醚氰菊酯	4.8
		氯氰菊酯	6.8
高效氯氰菊酯	8.5
		顺式氯氰菊酯	10
溴氰菊酯	10
		高效氯氟氰菊酯	20
氟氯氰菊酯	21
		氟胺氰菊酯	32
氰戊菊酯	50

Claims

1.一株分泌抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体的杂交瘤细胞株15号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7215。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株15号产生的单克隆抗体，其特征在于能够广谱性识别10种拟除虫菊酯，且灵敏度好，半数抑制浓度IC₅₀在3.2-50 ng/mL之间；

10种拟除虫菊酯为：甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟胺氰菊酯、苯醚氰菊酯，顺式氯氰菊酯。

3.权利要求2所述的单克隆抗体的应用，其特征在于在拟除虫菊酯总量检测中的应用。