CN104569405A - 同时检测谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素b1金花纳米颗粒免疫层析试纸条的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种同时检测谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素B1金花纳米颗粒免疫层析试纸条的制备方法，包括(1)？DON单克隆抗体-金花纳米颗粒标记物和FB1单克隆抗体-金花纳米颗粒标记物的制备；？(2)？金标结合物释放垫的处理；(3)？硝酸纤维素膜的包被；（4）试纸条的制作等步骤。本发明特异性，灵敏度高；检测结果形象、直观；操作简便、快速；易于大范围推广应用。广泛适用于粮食收购现场检测、食品安全检测、海关检疫等需求。

Description

同时检测谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素B1金花纳米颗粒免疫层析试纸条的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及真菌毒素的快速检测试纸条的制备。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON）是镰刀菌产生的有毒次级代谢产物—单端孢霉烯族化合物中的一种，属于B型单端孢霉烯族化合物。伏马菌素B1 (Fumonisin FB1) 是另外一种霉菌毒素，是由串珠镰刀菌产生的水溶性代谢产物。上述两种真菌毒素广泛存在于谷物粮食及其制品中，具有致畸、致癌、免疫抑制毒性、神经毒性等作用，它们不仅造成农作物减产、质量下降等巨大的经济损失，而且对人、畜的健康构成潜在的威胁。
目前有关DON和FB1的检测方法主要有：薄层层析法、气相色谱法、气相色谱法-质谱法和液相色谱法、液相色谱法-质谱或液相色谱法-质谱-质谱法等；而有关FB1的检测方法主要有：薄层层析法、液相色谱法、液相色谱法-质谱等。上述方法一般只适合实验室检测，耗时，费用昂贵，需要复杂的仪器和复杂的样品前处理，且需要专业人员操作，难于在基层普及和推广，更不适合现场和野外大规模的快速检测。
虽然目前国内有酶联免疫吸附法（ELISA）的DON和FB1的ELISA试剂盒出售，可检测多个样品，可定性也可定量检测，但ELISA也需要专业人员完成，其操作过程比较复杂，检测时间比较长，不同的人员操作可能会出现不同的结果，且还必须配套酶标仪读数，也无法实施现场检测。
基于在NC膜上的抗原与抗体反应的胶体金免疫快速检测法具有操作简单、适合现场检测、快速、不需复杂仪器而只需眼睛观测和检测成本低等特点。该法已经成功用于医学和食品安全等领域的快速检测，例如早早孕检测试纸、乙肝表面抗原检测试
纸、瘦肉精检测试纸等。现已有利用胶体金免疫层析试制条分别检测DON的报道：公开专利CN101158685A一种呕吐毒素半定量试纸条的制备与使用方法；公开专利CN101482566快速检测粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇试纸条制备及其应用；公开号CN101650368A用胶体金免疫层析试纸检测玉米赤霉烯酮毒素的方法。
目前，商品化的胶体金免疫层析试纸条检测绝大多数为单一检测（即每次只能检测一种目标物），而采用金花状纳米颗粒作为标记探针制备同时检测谷物及其制品中DON和FB1的胶体金免疫层析试纸条尚未见报道。此外，我国尚未建立用免疫层析试纸条测定谷物及其制品中DON和FB1的标准方法。因此从食品安全的要求出发，鉴于目前我国经济发展状况，在国内建立切实可推广快速、准确、可靠的适用于粮食收购现场同时检测谷物及其制品中DON和FB1的胶体金免疫层析试纸条越来越显得日益重要和迫切。
到目前为止，尚未见采用金花纳米颗粒作为抗体标记物用于同时检测DON和FB1的报道，而采用金花作为抗体标记物用于真菌毒素的快速检测也未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供快速、同时检测粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和伏马菌素B1（FB1）试纸条的制备及其应用的方法，以适应DON和FB1的快速检测。
本发明提供的快速、同时检测粮食中DON和FB1的试纸条包括硝酸纤维素膜(NC膜)、结合物释放垫、样品垫、底板和吸水垫，NC膜具有包被DON-MBSA和FB1-BSA偶联物的测试区（T线）和包被羊抗鼠IgG的质控区（C线），所述结合物释放垫包被了DON单克隆抗体和FB1单克隆抗体-金花纳米颗粒（60-70 nm）标记物。
本发明所述的制备方法，包括如下步骤。
(1) DON单克隆抗体-金花纳米颗粒标记物和FB1单克隆抗体-金花纳米颗粒标记物的制备。
a.向两个锥型瓶中分别加入5-10 mL的60-70 nm的金花纳米颗粒溶液，然后分别加入适量K2CO3溶液调节溶液的pH为5.5-7.5。
b.分别取0.1-20 μL的浓度为5 mg/mL DON抗体和2 mg/mL FB1抗体，稀释30-50倍后，然后分别逐渐加入到步骤（a）的金花纳米颗粒溶液中，快速搅拌反应60 min。
c.分别加入BSA，终浓度为1.0%，反应30 min。
d.分别加入PEG-20000，终浓度为0.1%，反应30 min。
e.反应后分别采用10000 rpm离心60 min。
f.弃去上清，沉淀分别采用含5%蔗糖、1%BSA、0.5%PEG-20000、2%海藻糖PBS溶液的金子稀释液复溶。
 (2) 金标结合物释放垫的处理。
将金标结合物释放垫放入含0.5%BSA、5%蔗糖、0.5%PEG-20000 的浓度为0.01 M的PBS溶液中浸泡30 min，37℃真空干燥。将步骤（1）制备的DON单克隆抗体-金花纳米颗粒标记物和FB1单克隆抗体-金花纳米颗粒标记物混合均匀，然后采用喷金机均匀的喷入到金标结合物释放垫上，喷量为10-15 μL/cm，37℃真空干燥。
(3) 硝酸纤维素膜的包被。
将浓度为0.1-1.0 mg/mL的DON-MBSA和浓度为0.1-1.0 mg/mL的偶联的检测抗原喷在硝酸纤维素膜上，喷量为0.5-1.0 μL/cm，分别作为DON和FB1的检测线，两者间距为4-7 mm；在距离DON检测线4-7 mm处喷浓度为1-2 mg/mL羊抗鼠Ig G，作为质控线，喷量为0.5 -1.0 μL/cm。37℃真空干燥，密封。
所述的DON-MBSA和FB1-BSA的制备分别参照邓舜洲. DON无毒phage-ELISA检测方法的建立及展青霉素免疫学检测初探，博士论文，南昌大学，2006； 邹龙. 抗伏马菌素B1单链抗体的制备及其免疫学检测初步应用研究，硕士论文，南昌大学，2013。
（4）试纸条的制作。
将上述喷有DON检测抗原、FB1检测抗原和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜（NC膜）粘贴在PVP底板上；在底板的质控线一端为吸附垫，另一端为样品垫，NC膜两端分别与样品吸附垫和金标垫相互交叠连接（连接部分可在1-2 mm范围），金标垫上压有样品垫。以宽度为3-4 mm/条切条后即为同时检测DON和FB1的试纸条。
本发明所制备的快速、同时检测DON和FB1的试纸条的应用。
同时检测稻谷、小麦和玉米中的DON和FB1：称取1.0 g粉碎的样品于锥形瓶中，加入100 mL的蒸馏水，充分摇匀3-5 min，以定性滤纸过滤，收集滤液；再取0.5 mL的滤液加入到1 mL的蒸馏水中，充分混匀，作为待检测溶液。
上样液的制备：取上述待检测溶液，加入2-6滴含0.01-0.5%的阴离子表面活性剂、0.5%-5% Tween-20 的PBS（0.05-0.1M）溶液，作为上样液。
取上述上样液滴于试纸条的加样孔中，5 min后即可观察到检测结果。
本发明所述的百分浓度（%）除特别指出的之外，均是指g/ml。
本发明所述的快速、同时检测粮食中DON和FB1试纸条具有如下特点。
（1）特异性，灵敏度高。本发明制备的同时检测粮食中DON和FB1试纸条，对DON和FB1的检测灵敏度均为5 ng/mL，相应的Cut-off值均为1000 μg/kg，且对AFB、OTA、α-Zearalenol、3-AC-DON、β- Zearalenol 、Nivalenol、Citrinin、T-2、和HT-2等真菌毒素无明显的交叉反应性。
（2）检测结果形象、直观。当试纸条显示三条红色线表示：DON的含量低于1000μg/kg，且FB1的含量低于1000 μg/kg；当只有质控线显示红线表示：样品中DON的含量高于1000μg/kg，且FB1的含量高于1000 μg/kg；当质控线和 DON的检测线显红色表示：样品中DON的含量低于1000 μg/kg，而FB1的含量高于1000 μg/kg；当质控线和FB1的检测线显红色表示：样品中DON的含量高于1000 μg/kg，而FB1的含量低于1000 μg/kg；质控线不显色表示：试纸条无效。
（3）操作简便、快速。不需专业人员操作，5 min内可出检测结果。
（4）易于大范围推广应用。快速检测试纸条操作简单，不需其他仪器和设备，只需按说明书即可完成检测，易于普及，广泛适用于粮食收购现场检测、食品安全检测、海关检疫等需求，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
实施例1。同时快速检测DON和FB1试制条的制备。
1、DON和FB1单克隆抗体-胶体金标记物的制备。
（1）金花纳米颗粒的制备。
75 μL浓度为100 mM（1g氯金酸融入25毫升去离子水）的氯金酸溶液放入含有30 mL去离子水的三角瓶中，剧烈搅拌并加热至沸腾，加入900 μL质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液并保持沸腾直至溶液中颜色变成红色，加热10 min。放至室温待用。
对于一个典型的合成的海胆状纳米粒子，25 μL含水氯金酸（100 mM）在剧烈搅拌下放入9.6 mL的去离子水中，接着，加入50 μL金种子，22 μL、 1％的柠檬酸钠，和1000 μL的30 mM对苯二酚（33 mg加入10 mL的去离子水)，该溶液在保持在室温下搅拌10 min，得到金花纳米颗粒。
（2）DON和FB1单克隆抗体-金花纳米颗粒标记物的制备。
磁力搅拌下，用1 ％ 碳酸钾将两个盛有5 mL胶体金溶液调整为最适pH值为6.5，分别1μL的5 mg/mL DON单克隆抗体和2 mg/mL FB1单克隆抗体，稀释50倍后，分别逐滴加入金花纳米颗粒溶液，继续搅拌60 min。然后加入原体积10 % 的BSA，继续搅拌30 min。将已经标记好的探针10000 g、4 ℃离心30 min，吸取上清，将沉淀的金花纳米颗粒探针用金子稀释液复溶分别得到DON和FB1单克隆抗体金花纳米颗粒标记物，4 ℃保存.
2、结合物释放垫的包被。
将结合物释放垫放入含0.1%BSA和3%蔗糖的PBS溶液中浸泡10 min，37℃烘干。将（2）中得到的DON和FB1单克隆抗体-胶体金标记物混合均匀，然后用Biodot点膜仪将其均匀的喷入到结合物释放垫上，每1cm长的结合垫喷15 μL DON和FB1单克隆抗体-胶体金标记物混合物，真空干燥，置4 ℃备用。
3、硝酸纤维素膜的包被。
采用Biodot点膜仪分别将浓度为1.0 mg/mL MBSA偶联DON的检测抗原和浓度为1.0 mg/mL的FB1-BSA检测抗原喷在硝酸纤维素膜上，分别作为DON检测线和FB1检测线，喷量为0.74 μL/cm，在靠近吸水纸一端，且距离DON检测抗原为3 mm处喷浓度为1.5 mg/mL羊抗鼠Ig G，作为质控线(C线)，喷量为0.74 μL /cm。真空干燥，密封。
4、胶体金试纸条的组装。
试纸条的组装包括：底板一端端头为吸水垫，另一端端头为样品垫，硝酸纤维素膜两端分别与吸水垫和结合物释放垫相互交叠连接，在结合物释放垫上压有样品垫。
实施例2。样本中DON和FB1的同时检测。
稻谷、小麦和玉米中DON和FB1的同时检测。
（1）样品前处理及检测。
称取1.0 g粉碎的待检样品（如稻谷、小麦和玉米）于三角瓶中，加入100 mL的蒸馏水溶液，充分摇匀3-5 min，以定性滤纸过滤，收集滤液；再取0.5 mL的滤液加入到1 mL的蒸馏水中，充分混匀，作为待检测溶液。
取上述待检测溶液，加入2滴阴离子表面活性剂、0.5% Tween-20 的PBS（0.05M）溶液，作为上样液。
取上述上样液滴于试纸条的加样孔中，5 min后即可观察到检测结果。
（2）结果分析。
当试纸条显示三条红色线表示：DON的含量低于1000 μg/kg，且FB1的含量低于1000 μg/kg；当只有质控线显示红线表示：样品中DON的含量高于1000 μg/kg，且FB1的含量高于1000 μg/kg；当质控线和 DON的检测线显红色表示：样品中DON的含量低于1000 μg/kg，而FB1的含量高于1000 μg/kg；当质控线和FB1的检测线显红色表示：样品中DON的含量高于1000 μg/kg，而FB1的含量低于1000 μg/kg；质控线不显色表示：试纸条无效。
实施例3。(应用实施例) 。
1、特异性实验。
按实施例2所述的方法进行实验，将3-AC-DON、Nivalenol、T-2、HT-2、AFB、OTA、Citrinin、α-Zearalenol和β- Zearalenol等真菌毒素用本专利试纸条检测，均出现三条红线，结果该检测试纸条与3-AC-DON、Nivalenol、T-2、HT-2、AFB、OTA、Citrinin、α-Zearalenol和β- Zearalenol等真菌毒素等无交叉性反应。
2、灵敏度实验。
采用实施2所述的方法，用试纸条分别检测浓度分别为0、0；2、2；5、5；10、10；和20、20 ng/mL的DON和FB1混合标准品，重复10次，其中当DON浓度等于或高于5 ng/mL时，DON检测线不显红色；而当FB1浓度等于或高于5 ng/mL时，FB1检测线不显红色。因此，本专利制备的试纸条的对DON和FB1检测灵敏度均为5 ng/mL。
3、均一性实验。
采用实施2所述的方法，对DON和FB1浓度分别为0、0 ng/mL；5、5 ng/mL 的混合液分别进行10次平行检测，反应5 min后观察结果，0、0 ng/mL 出现三条红线，5、5 ng/mL则只出现一条红线，检测显色深度均一，反应结果一致。
4、稳定性实验。
将真空包装好的试纸条放置37℃烘箱中进行破坏性实验，时间为10天，各项指标均符合以上1-3项指标，即检测其他毒素无交叉性反应、对DON和FB1检测灵敏度均为5 ng/mL，检测显色深度均一，反映结果一致。

Claims (1)

1.一种同时检测谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素B1金花纳米颗粒免疫层析试纸条的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1) DON单克隆抗体-金花纳米颗粒标记物和FB1单克隆抗体-金花纳米颗粒标记物的制备：
a.向两个锥型瓶中分别加入5-10 mL的60-70 nm的金花纳米颗粒溶液，然后分别加入适量K2CO3溶液调节溶液的pH为5.5-7.5；
b.分别取0.1-20 μL的浓度为5 mg/mL DON抗体和2 mg/mL FB1抗体，稀释30-50倍后，然后分别逐渐加入到步骤（a）的金花纳米颗粒溶液中，快速搅拌反应60 min；
c.分别加入BSA，终浓度为1.0%，反应30 min；
d.分别加入PEG-20000，终浓度为0.1%，反应30 min；
e.反应后分别采用10000 rpm离心60 min；
f.弃去上清，沉淀分别采用含5%蔗糖、1%BSA、0.5%PEG-20000、2%海藻糖PBS溶液的金子稀释液复溶；
 (2) 金标结合物释放垫的处理：
将金标结合物释放垫放入含0.5%BSA、5%蔗糖、0.5%PEG-20000 的浓度为0.01 M的PBS溶液中浸泡30 min，37℃真空干燥；将步骤（1）制备的DON单克隆抗体-金花纳米颗粒标记物和FB1单克隆抗体-金花纳米颗粒标记物混合均匀，然后采用喷金机均匀的喷入到金标结合物释放垫上，喷量为10-15 μL/cm，37℃真空干燥；
(3) 硝酸纤维素膜的包被：
将浓度为0.1-1.0 mg/mL的DON-MBSA和浓度为0.1-1.0 mg/mL的偶联的检测抗原喷在硝酸纤维素膜上，喷量为0.5-1.0 μL/cm，分别作为DON和FB1的检测线，两者间距为4-7 mm；在距离DON检测线4-7 mm处喷浓度为1-2 mg/mL羊抗鼠Ig G，作为质控线，喷量为0.5 -1.0 μL/cm；37℃真空干燥，密封；
（4）试纸条的制作：
将上述喷有DON检测抗原、FB1检测抗原和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜粘贴在PVP底板上；在底板的质控线一端为吸附垫，另一端为样品垫，NC膜两端分别与样品吸附垫和金标垫相互交叠连接，金标垫上压有样品垫；以宽度为3-4 mm/条切条后即为同时检测DON和FB1的试纸条。
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