CN104569401B - 一种ca15-3检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种ca15-3检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CA15-3检测试剂盒，所述检测试剂盒包括测试条和检测液，所述测试条为镶嵌在支撑板内的金磁颗粒免疫层析测试条，所述的金磁颗粒免疫层析测试条由硝酸纤维素膜和吸水垫连接而成，所述的硝酸纤维素膜上依次设有点样区、包被有CA15-3抗体的检测条带和包被有兔抗鼠IgG抗体对照条带，并分别形成点样区、CA15-3检测条带和兔抗鼠IgG抗体对照条带；本发明试纸条的检测灵敏度比传统的免疫层析技术提高2倍；本发明操作简单，适合大规模生产，无需任何仪器；因此能广泛用于医院，血站防疫站，体检等大批量使用单位及一些采血现场、农村及基层诊所等小批量或单人份使用的单位使用，尤其适用于乳腺癌患者对乳腺癌转移情况的初检。

Description

一种CA15-3检测试剂盒及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种半定量检测血液中乳腺癌相关抗原CA15-3的基于金磁颗粒的免疫层析检测试剂盒及其应用。
(二)背景技术
CA15-3是一种乳腺癌相关抗原，分子量约为400kD。1984年Hikens等从人乳脂肪球膜上糖蛋白MAM-6制成的小鼠单克隆抗体(115-DB)以及1984年KuFu等自肝转移乳腺癌细胞膜制成单克隆抗体(DF-3)，这两种抗体均能识别同一种抗原，这种抗原即为抗原CA15-3。乳腺癌患者常常伴随CA15-3的升高，但在乳腺癌初期患者敏感性较低，转移性乳腺癌阳性率可达80％。发现癌症转移的敏感性比癌胚抗原和组织多肽抗原高，且早于临床发现转移。CA15-3可以作为原发性乳腺癌的辅助诊断指标，也可以作为手术后随访，检测肿瘤复发，转移的指标。血清中CA15-3水平增高，提示乳腺癌的局部或全身复发，且增高早于核素检查和临床检查。除乳腺癌以外，其他肿瘤如肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、良性乳腺疾病等均可出现血清CA15-3的增高，非恶性肿瘤一般阳性率低于10％。
目前的血液中CA15-3的诊断技术主要包括：放射性免疫分析(RIA)、酶联免疫分析(ELISA)、化学发光免疫分析(CLIA)、时间分辨荧光免疫分析、胶体金免疫层析等方法，但这些方法都有各自的特点及不足：放射性免疫分析是临床较为常用的方法，优点是结果较准确，线性范围较宽，缺点是操作繁琐，耗时长，且放射性标记物会对操作者产生危害，并且会产生环境污染，目前用的较少。ELISA和化学发光及时间分辨荧光免疫分析目前已经实现自动化、大批量、定量检测，但是方法见结果差异大，线性范围较窄。同时，目前自动化监测仪器被国外大厂商垄断，仪器设备昂贵，且不适合单人份和小批量检测用，基层医院及诊所应用受到限制。近年来发展较快的胶体金免疫层析技术检测CA15-3的试剂盒已经研制成功，其快速，便捷，单人份操作的优势促使其被广泛使用，但其缺点是由单纯的胶体金标记的免疫层析试纸条检测的结果灵敏度较低。由于在癌症发展或者转移初期，患者体内CA15-3含量较低，这就导致部分体内CA15-3含量高于正常值而低于检测线的患者出现假阴性的检测结果，因此实际上，该方法被应用于肿瘤临床检测并不广泛。
基于金磁颗粒的免疫层析技术，是近年来新出现的一门新的检测技术。其原理主要是由于其表面负载了大量的金颗粒，大大增加了金磁颗粒的比表面积，提高了金磁颗粒表面的抗体偶联量，进而达到降低检测线，提高其灵敏度的目的。同时，通过调节金颗粒本身粒径及其在单个微球上的负载量，可进一步调节抗原检测线。2009年，D.Tang等最早将该技术用于黄曲霉毒素B2的检测，其检测线比单纯金标记的试纸条降低了3倍。本发明主要通过制备这种基于金磁颗粒免疫层析诊断试剂盒，并应用于乳腺癌标记物CA15-3的检测，实现拓展该技术在肿瘤检测领域应用的目的。
(三)发明内容
本发明目的是从提高检测灵敏度出发，提供一种既方便又快速的CA15-3基于金磁颗粒的免疫层析检测试剂盒，灵敏度提高了2倍。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种CA15-3检测试剂盒，所述检测试剂盒包括测试条和检测液，所述测试条为镶嵌在支撑板内的金磁颗粒免疫层析测试条，所述的金磁颗粒免疫层析测试条由硝酸纤维素膜和吸水垫连接而成，所述的硝酸纤维素膜上依次设有点样区、包被有CA15-3抗体的检测条带(T线，检测线)和包被有兔抗鼠IgG抗体对照条带(C线，质控线)，并分别形成点样区、CA15-3检测条带(T线，检测线)和兔抗鼠IgG抗体对照条带(C线，质控线)，所述吸水垫连接在硝酸纤维素膜远离检测条带的一端(即吸水垫连接在靠近硝酸纤维素膜对照条带的一端)；所述检测液为金磁颗粒混悬液，所述金磁颗粒混悬液是将包被有CA15-3单克隆抗体的金磁颗粒用牛血清白蛋白封闭后，混悬于含表面活性剂、蔗糖和氯化钠的缓冲液中而获得；所述缓冲液中表面活性剂的体积终浓度为0.1～10％(优选8％)，所述蔗糖的质量终浓度为0.1～2g/L缓冲液(优选1％)，所述氯化钠的质量终浓度为0.1～2g/L缓冲液(优选1.2g/L缓冲液)；所述金磁颗粒是由Fe3O4粉末和氯化金制备的粒径为50nm～1μm的颗粒(优选100nm～800nm)，所述缓冲液中金磁颗粒的OD520＝1-3。
进一步，所述金磁颗粒免疫层析测试条上方还覆盖有一开有加样孔和视窗的盖板，所述的视窗与检测条带和对照条带配合，所述加样孔与点样区配合，即硝酸纤维素膜点样区上方为加样孔，T线和C线上方为视窗，优选长方形视窗。所述支撑板上设有卡槽，所述盖板设有与卡槽配合连接的卡扣。
进一步，所述硝酸纤维素膜远离检测条带的一端置于吸水垫下方，部分重叠连接，所述重叠部分的长度为1-3mm(优选2mm)。本发明所述T线和C线间隔0.5cm。本发明所述测试条靠近T线的一端还可以跟吸水垫连接，并在吸水垫上设置点样区，即硝酸纤维素膜的靠近T线端和靠近C线端均可以连接有吸水垫。
进一步，所述表面活性剂为Tween-80。
进一步，本发明所述金磁颗粒混悬液按如下方法制备为：(1)磁性粒子的制备：将壳聚糖通过反相悬浮聚合法包裹纳米Fe3O4粒子；
(2)金磁颗粒的制备：取步骤(1)制备的磁性粒子超声分散于ddH2O中，再加入质量浓度1％氯化金水溶液和质量浓度1％柠檬酸三钠水溶液，煮沸10分钟，永磁铁分离，缓冲液洗涤，获得金磁颗粒；所述氯化金水溶液的体积用量以磁性粒子质量计为33.3ml/g，所述柠檬酸三钠水溶液的体积用量以磁性粒子质量计为33～84ml/g；
(3)金磁颗粒混悬液的制备：取步骤(2)制备的金磁颗粒用含蔗糖的pH＝9.0，0.05M硼酸-硼砂缓冲液悬浮，加入0.5mg/mL的CA15-3单克隆抗体，室温孵育30分钟，再加入1％的牛血清白蛋白封闭30分钟；然后加入质量浓度10％氯化钠水溶液和Tween-80的混合液，继续反应30分钟，充分混匀，然后加质量浓度为1％聚乙二醇水溶液，即获得金磁颗粒混悬液；所述金磁颗粒质量用量以缓冲液体积计为3mg/ml，所述缓冲液中Tween-80的体积终浓度为0.1～10％，所述蔗糖的质量终浓度为0.1～2g/L缓冲液，所述氯化钠水溶液中氯化钠的质量终浓度为0.1～2g/L缓冲液；所述CA15-3单克隆抗体与缓冲液体积比为0.03：1，所述牛血清白蛋白与缓冲液体积比为0.03:1，所述聚乙二醇水溶液与缓冲液体积比为0.01：1。
更进一步，所述金磁颗粒悬浮液按如下方法制备：(1)磁性粒子的制备：将Fe3O4粉末(优选粒径为1～20nm)超声分散到体积浓度2％乙酸水溶液中，加入壳聚糖粉末，充分搅拌制成水相；取span-80(山梨糖醇酐油酸酯)加入到液体石蜡中，在1000～3000rpm条件下机械搅拌形成油相；将水相缓慢加入油相中，继续搅拌形成油包水小液滴后滴加体积浓度为10％戊二醛水溶液，40℃进行交联(通常反应2h)，反应完全后再用质量浓度10％NaOH水溶液调整pH至pH＝10，继续搅拌均匀(优选2h)，反应液加入2倍体积的石油醚，抽滤，滤饼用石油醚和70℃无水乙醇各洗涤3次，冷冻干燥，获得磁性粒子，粒径为100～800nm；所述乙酸水溶液的体积用量以Fe3O4粉末质量计为100ml/mg，所述Fe3O4粉末与壳聚糖质量比:1：2，所述山梨糖醇酐油酸酯与液体石蜡体积比为1：1500，所述油相体积以Fe3O4粉末质量计为50ml/mg，所述戊二醛溶液的体积用量以Fe3O4粉末质量计为0.67ml/mg；
(2)金磁颗粒的制备：取步骤(1)制备的磁性粒子，加入ddH2O，超声分散5min，加入质量浓度1％氯化金水溶液，加热至沸腾后，迅速加入质量浓度1％柠檬酸三钠水溶液，煮沸10分钟，永磁铁分离，pH＝9.0、0.05M硼酸-硼砂缓冲液洗涤三次，去除洗涤液，获得金磁颗粒，粒径为10～30nm；所述氯化金水溶液的体积用量以磁性粒子质量计为33.3ml/g，所述柠檬酸三钠水溶液的体积用量以磁性粒子质量计为33～84ml/g；
(3)金磁颗粒混悬液的制备：取步骤(2)制备的金磁颗粒用含蔗糖的pH＝9.0，0.05M硼酸-硼砂缓冲液悬浮，加入0.5mg/mL的CA15-3单克隆抗体，室温(25℃)放100rpm缓慢旋转孵育30分钟，再加入蛋白终浓度为1％的牛血清白蛋白，封闭(指的是旋转过程中牛血清白蛋白与金磁颗粒表面被单克隆抗体结合后剩余的结合位点发生结合，可避免假阳性)30分钟；然后加入质量浓度10％氯化钠水溶液和Tween-80的混合液，继续缓慢旋转30分钟，充分混匀，再加浓度为1％PEG(MW＝2×104)，即获得金磁颗粒混悬液；所述金磁颗粒质量用量以缓冲液体积计为3mg/ml，所述缓冲液中Tween-80的体积终浓度为0.1～10％，所述蔗糖的质量终浓度为0.1～2g/L缓冲液，所述氯化钠水溶液中氯化钠的质量终浓度为0.1～2g/L缓冲液；所述单克隆抗体与缓冲液体积比为0.03：1，所述牛血清白蛋白与缓冲液体积比为0.03:1，所述聚乙二醇水溶液与缓冲液体积比为0.01：1。
本发明还提供一种所述CA15-3检测试剂盒的应用，具体所述的应用为：将待测血液与金磁悬浮液混合后，加入测试条的加样孔，所述的测试条在加入待测血液后，若CA15-3检测条带和兔抗鼠IgG抗体对照条带均呈现肉眼可见的紫红色时，说明待测样品中CA15-3为阴性(即待测血液正常)，若CA15-3检测条带不显色，兔抗鼠IgG抗体对照条带呈现肉眼可见的紫红色时，说明待测样品中CA15-3为阳性(即待测血液异常，CA15-3含量增高)，若兔抗鼠IgG抗体对照条带不呈色，不管CA15-3检测条带是否呈色，均判定为该测试条失效。
本发明所采用的CA15-3配对抗体为单克隆抗体技术制备的单抗。利用竞争法检测CA15-3抗原的原理检测标本，当待测标本中含有CA15-3抗原时，且含量小于金磁颗粒上包被的抗体可参与反应的抗原结合位点时，抗原会先和部分金磁颗粒上偶联的抗体结合，随着层析作用的进行，剩余的金磁颗粒及结合物向前移动到达CA15-3抗原包被处的T线，剩余的金磁颗粒会与T线上的抗原结合，从而在T线处发生聚集，呈紫红色，而已经被样品中抗原结合的金磁颗粒结合物则继续层析，到达质控线C时，抗鼠的二抗会与CA15-3抗体结合，即在C线处同样出现金磁颗粒聚集，呈现紫红色，该结果为阴性(-)。假如样品中的含量高于金磁颗粒上抗体的结合位点所能参与反应的数量时，则抗原先与金磁颗粒结合，然后随着层析试纸条前行，越过T线，在C线处抗体与抗鼠二抗发生反应，从而聚集呈现紫红色，该结果被判定为阳性(+)。不管样品是阳性还是阴性，测试条的C线都应该呈现颜色，假如C线不显示颜色，则该试纸条无效。
本发明所述的硝酸纤维素膜上检测条带和对照条带按如下方法制备：分别将CA15-3抗体和兔抗鼠IgG抗体以BIODOT平台上的BIRJET气压喷头喷到硝酸纤维膜对应的条带上，冷冻干燥制备而成。
本发明所述测试条盖上塑料盖板(塑料盖板在硝酸纤维素膜点样区位置有加样孔，在相应的T线和C线处有视窗，见图3)，并与3包干燥剂密封于铝箔袋中，50个测试条为一个包装，置于一个包装盒内，一盒一份说明书，一瓶5mL装的金磁颗粒混悬液，50个Eppenddorf管，室温避光保存，保质期为12个月。
与现有胶体金检测试剂条相比，本发明具有以下优点：
1)本发明通过对试纸条的改进，在普通胶体金试纸条中引入磁性颗粒，使得试纸条的检测灵敏度比传统的免疫层析技术提高2倍。
2)本发明操作简单，适合大规模生产，无需任何仪器。因此能广泛用于医院，血站防疫站，体检等大批量使用单位及一些采血现场、农村及基层诊所等小批量或单人份使用的单位使用，尤其适用于乳腺癌患者对乳腺癌转移情况的初检。
(四)附图说明
图1为本发明试纸条结构示意图：1-硝酸纤维素膜，2-检测条带(T线)，3-对照条带(C线)，4-吸水垫，5-支撑板。
图2为本发明试剂盒结果的判定图。
图3为本发明试纸条外形图，T为CA15-3抗原检测条带，C为兔抗鼠抗体对照条带，1为加样孔，2为视窗。
图4为本发明金磁颗粒透射图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1半定量检测血液中CA15-3的金磁颗粒免疫层析测试条及试剂盒
(1)测试条
A、抗体制备：选用商品化的CA15-3配对抗体及抗原，购自美国Calbioreagents。
B、硝酸纤维素膜及吸水垫的制备：选用商品化的常用硝酸纤维素膜和吸水垫，购自上海杰一生物。
C、试纸条的组装与切割：
下述操作必须在湿度小于20％，温度20-25℃的房间内进行。
测试条的组装：在20cm长的PVC支撑板(6.0cm*30cm，设有卡槽)上组装(可以事先组装好备用)20cm长的硝酸纤维素膜，并使用BioDotdispensingapparatus(AUTOKUNHGS101)上的BIRJET气压喷头将2μl/cm，1.0mg/mL兔抗鼠IgG和2μl/cm，0.06mg/mLCA15-3抗原标准品分别喷到硝酸纤维膜对应的条带上作为T线和C线(T线在点样区与C线之间)，37℃，12小时烘干。然后在硝酸纤维素膜T线的一边组装上20cm长的吸水垫并设置点样区或者直接在硝酸纤维素膜上设置点样区，T线位于点样区和C线之间，多余的支撑板可以用剪刀剪掉。硝酸纤维素膜一端(远离T线的一端)置于吸水垫的上方，重叠放置，重叠部分的长度为2mm，T线和C线的间隔为0.5cm，硝酸纤维素膜上T线和C线各一条(见图1)。
试纸条的裁切：使用Biodotdispensingapparatus(AUTOKUNHGS201)选择与T线与C线垂直的方向，将该试纸条的大小剪成宽度为4mm，长度6cm。
试剂盒成品包装：将切好的试纸条盖上塑料盖板(塑料盖板在点样区位置有加样孔，在相应的T线和C线处有视窗，盖板上设有与支撑板卡槽配合的卡扣，见图3)，并与3包干燥剂密封于铝箔袋中。50个测试条为一个包装，置于一个包装盒内，一盒一份说明书，一瓶5mL装的金磁颗粒混悬液，50个Eppenddorf管，室温避光保存，保质期为12个月。
(2)金磁颗粒悬浮液
磁性纳米粒子的制备：将0.5mg粒径为1-20nm的Fe3O4粉末超声分散到50ml体积浓度2％乙酸水溶液中，加入1mg壳聚糖粉末，充分搅拌溶解获得均一的水相。取0.1ml山梨糖醇酐油酸酯(span-80)加入到盛有150ml液体石蜡的三口烧瓶中，机械搅拌速度为2000rpm条件下搅拌形成油相。将水相缓慢加入油相中，继续搅拌一段时间形成油包水小液滴后滴加质量浓度为10％的戊二醛水溶液，40℃交联反应2h，反应完全后再用质量浓度10％NaOH水溶液调整pH至pH＝10，40℃继续搅拌2h，反应液加入2倍体积的石油醚，抽滤，滤饼用石油醚和70℃无水乙醇各洗涤3次，冷冻干燥，获得磁性纳米粒子30mg，粒径为100-800nm，室温(25℃)保存。
金磁颗粒的制备：取30mg磁性纳米粒子，加入100mlddH2O，超声分散5min，加入1ml质量浓度1％氯化金水溶液，加热至沸腾后，迅速加入2ml质量浓度1％柠檬酸三钠水溶液，煮沸10分钟，永磁铁分离，pH＝9.0、0.05M硼酸-硼砂缓冲液洗涤三次，去除洗涤液，获得金磁颗粒45mg，粒径为500nm-1.3μm，通过能谱分析，测得金颗粒占金磁颗粒重量的40.73％，4℃保存备用。
金磁颗粒混悬液的制备：取30mg的金磁颗粒用10mL含终浓度1wt％蔗糖的pH＝9.0，0.05M硼酸-硼砂缓冲液悬浮，使OD270＝1.3。加入0.3mL0.5mg/mL的CA15-3单克隆抗体(购自美国Calbioreagents)，室温、100rpm缓慢旋转孵育30分钟。再加入0.3mL、1％(w/v)的牛血清白蛋白(购自阿拉丁试剂)室温封闭(指的是旋转过程中牛血清白蛋白与金磁颗粒表面被单克隆抗体结合后剩余的结合位点发生结合，可避免假阳性)30分钟。然后加入总体积2mL，1.2ml、1g/L的氯化钠水溶液和800μLTween-80的混合液，继续缓慢旋转30分钟，充分混匀，再加0.02ml、0.1g/LPEG(MW＝2×104)水溶液，即获得金磁颗粒混悬液，4℃保存。
实施例2
将实施例1金磁颗粒制备过程中1％的柠檬酸三钠水溶液的添加量改为1.5mL，其它操作同实施例1，获得金磁颗粒33.3mg，4℃保存备用。
实施例3
将实施例1金磁颗粒制备过程中1％的柠檬酸三钠水溶液的添加量改为2.5mL，其它操作同实施例1，获得金磁颗粒35.2mg，4℃保存备用。
实施例4试剂盒的使用方法(取1个)
1.加样
从包装盒中取出一个测试条，撕开铝箔袋包装，将测试条置于平整洁净桌面上，用微量移液器取出100μL金磁混悬液，加入Eppenddorf管中，再加入3μL的待测血清，混合均匀，制成反应液，静置10分钟。再将反应液加入测试条的加样孔内，继续静置10分钟。
测量结果判定
结果判定按照图2，T和C线均呈现紫红色为阴性，T线不显色，C线呈紫红色为阳性，若C线不呈色，不管T线是否呈色，均判定为该试纸条失效(见图2)。

Claims (5)

1.一种CA15-3检测试剂盒，所述检测试剂盒包括测试条和检测液，其特征在于所述测试条为镶嵌在支撑板内的金磁颗粒免疫层析测试条，所述的金磁颗粒免疫层析测试条由硝酸纤维素膜和吸水垫连接而成，所述的硝酸纤维素膜上依次设有点样区、包被有CA15-3抗体的检测条带和包被有兔抗鼠IgG抗体的对照条带，所述吸水垫连接在硝酸纤维素膜远离检测条带的一端；所述检测液为金磁颗粒混悬液，所述金磁颗粒混悬液按如下方法制备：(1)磁性粒子的制备：将壳聚糖通过反相悬浮聚合法包裹纳米Fe3O4粒子；
(2)金磁颗粒的制备：取步骤(1)制备的磁性粒子超声分散于ddH2O中，再加入质量浓度1％氯化金水溶液和质量浓度1％柠檬酸三钠水溶液，煮沸10分钟，永磁铁分离，缓冲液洗涤，获得金磁颗粒；所述氯化金水溶液的体积用量以磁性粒子质量计为33.3ml/g，所述柠檬酸三钠水溶液的体积用量以磁性粒子质量计为33～84ml/g；
(3)金磁颗粒混悬液的制备：取步骤(2)制备的金磁颗粒用含蔗糖的pH＝9.0，0.05M硼酸-硼砂缓冲液悬浮，加入0.5mg/mL的CA15-3单克隆抗体，室温孵育30分钟，再加入1％的牛血清白蛋白封闭30分钟；然后加入质量浓度10％氯化钠水溶液和Tween-80的混合液，继续反应30分钟，充分混匀，然后加质量浓度为1％聚乙二醇水溶液，即获得金磁颗粒混悬液；所述金磁颗粒质量用量以缓冲液体积计为3mg/ml，所述缓冲液中Tween-80的体积终浓度为0.1～10％，所述蔗糖的质量终浓度为0.1～2g/L缓冲液，所述氯化钠水溶液中氯化钠的质量终浓度为0.1～2g/L缓冲液；所述CA15-3单克隆抗体与缓冲液体积比为0.03：1，所述牛血清白蛋白与缓冲液体积比为0.03:1，所述聚乙二醇水溶液与缓冲液体积比为0.01：1。
2.如权利要求1所述CA15-3检测试剂盒，其特征在于所述金磁颗粒免疫层析测试条上方还覆盖有一开有加样孔和视窗的盖板，所述的视窗与检测条带和对照条带配合，所述加样孔与点样区配合。
3.如权利要求2所述CA15-3检测试剂盒，其特征在于所述支撑板上设有卡槽，所述盖板设有与卡槽配合连接的卡扣。
4.如权利要求1所述CA15-3检测试剂盒，其特征在于所述硝酸纤维素膜远离检测条带的一端置于吸水垫下方，部分重叠连接，重叠部分的长度为1-3mm。
5.如权利要求1所述CA15-3检测试剂盒，其特征在于所述金磁颗粒混悬液按如下方法制备：(1)磁性粒子的制备：将Fe3O4粉末超声分散到体积浓度2％乙酸水溶液中，加入壳聚糖粉末，充分搅拌制成水相；取山梨糖醇酐油酸酯加入到液体石蜡中，在1000～3000rpm条件下机械搅拌形成油相；将水相缓慢加入油相中，继续搅拌形成油包水小液滴后滴加体积浓度为10％戊二醛水溶液，40℃进行交联，反应完全后再用质量浓度10％NaOH水溶液调整pH至pH＝10，继续搅拌均匀，反应液加入2倍体积的石油醚，抽滤，滤饼用石油醚和70℃无水乙醇依次洗涤，冷冻干燥，获得磁性粒子；所述乙酸水溶液的体积用量以Fe3O4粉末质量计为100ml/mg，所述Fe3O4粉末与壳聚糖质量比为1：2，所述山梨糖醇酐油酸酯与液体石蜡体积比为1：1500，所述油相体积以Fe3O4粉末质量计为16.7ml/mg，所述戊二醛水溶液的体积用量以Fe3O4粉末质量计为0.67ml/mg；
(2)金磁颗粒的制备：取步骤(1)制备的磁性粒子，加入ddH2O，超声分散5min，加入质量浓度1％氯化金水溶液，加热至沸腾后，迅速加入质量浓度1％柠檬酸三钠水溶液，煮沸10分钟，永磁铁分离，pH＝9.0、0.05M硼酸-硼砂缓冲液洗涤三次，去除洗涤液，获得金磁颗粒；所述氯化金水溶液的体积用量以磁性粒子质量计为33.3ml/g，所述柠檬酸三钠水溶液的体积用量以磁性粒子质量计为33～84ml/g；
(3)金磁颗粒混悬液的制备：取步骤(2)制备的金磁颗粒用含蔗糖的pH＝9.0，0.05M硼酸-硼砂缓冲液悬浮，加入0.5mg/mL的CA15-3单克隆抗体，室温孵育30分钟，再加入1％的牛血清白蛋白封闭30分钟；然后加入质量浓度10％氯化钠水溶液和Tween-80的混合液，继续反应30分钟，充分混匀，然后加质量浓度为1％聚乙二醇水溶液，即获得金磁颗粒混悬液；所述金磁颗粒质量用量以缓冲液体积计为3mg/ml，所述缓冲液中Tween-80的体积终浓度为0.1～10％，所述蔗糖的质量终浓度为0.1～2g/L缓冲液，所述氯化钠水溶液中氯化钠的质量终浓度为0.1～2g/L缓冲液；所述单克隆抗体与缓冲液体积比为0.03：1，所述牛血清白蛋白与缓冲液体积比为0.03:1，所述聚乙二醇水溶液与缓冲液体积比为0.01：1。
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