CN101696975B

CN101696975B - 检测真菌毒素的膜基质蛋白质芯片及制备方法

Info

Publication number: CN101696975B
Application number: CN 200910186333
Authority: CN
Inventors: 何庆华; 许杨; 王丹; 李燕萍; 黄志兵
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2009-10-27
Filing date: 2009-10-27
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2029-10-27
Also published as: CN101696975A

Abstract

检测真菌毒素的膜基质蛋白质芯片及制备方法，由聚偏二氟己烯膜基片以及黄曲霉毒素B₁、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马菌素B₁、伏马菌素B₂的牛血清白蛋白偶联物等六种点样物组成；将聚偏二氟乙烯膜置于甲醇中浸泡后，将膜平整放置于滤纸上端，用点样仪将点样物点于膜上，温育后再用杂蛋白封闭膜上没有结合点样物的多余位点，洗涤晾干后真空封装。本发明操作简单、方便快速、无需任何仪器设备就可一次性完成多种真菌毒素种类的测定，并可长期保存，兼具了ELISA灵敏度高的特点，胶体金免疫层析技术肉眼判别的特点以及生物芯片高通量检测的特点，制备工艺简单，可大规模化生产。

Description

检测真菌毒素的膜基质蛋白质芯片及制备方法

技术领域

本专利涉及生物技术领域，具体涉及一种可同时检测多种常见重要真菌毒素的膜基质蛋白质芯片，可用于谷物、饲料及食品中真菌毒素的快速检测。

背景技术

真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，目前已知有200多种不同的真菌毒素。由于真菌的寄生和真菌毒素的产生，严重影响农作物的产量，降低农产品和饲料品质，造成巨大经济损失。全世界每年由于真菌毒素引起的农产品和工业原料的损失达数百亿美元。据调查，除粮食、饲料以外，在油料作物种子、水果、干果、蔬菜、调味品、烟草、麻类、乳和乳制品、鱼虾、肉类、发酵产品等都发现了不同程度的真菌毒素污染。研究发现，人或动物摄入被真菌毒素污染的农、畜产品，或通过吸入及皮肤接触真菌毒素可引发多种中毒症状，如致幻、催吐、出血症、皮炎、中枢神经受损等。

目前，常见的真菌毒素检测方法有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用分析法、酶联免疫吸附检测法及胶体金免疫层析法等。高效液相色谱法和气相色谱-质谱联用分析法具有检测准确、重复性好等特点，但同时也有仪器价格昂贵、操作繁琐、样本检测耗时长、不能同时检测多个样品等缺点，因而其使用受到极大的限制，不适于基层广泛使用。酶联免疫吸附检测法是目前常用的大规模筛查方法，但是酶联免疫吸附检测法也需要仪器的配合，检测时间偏长，难以满足基层现场快速检测的需要，胶体金免疫层析法作为常见的免疫学诊断方法在农业、生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用，它具有操作简便、快速，不需要借助仪器检测来判读结果等特点，适宜于基层的检测。

以上方法均不能同时检测样品中的多种真菌毒素，然而真菌毒素常常是混合污染，样品中同时污染多种真菌毒素的情况较为普遍。开发出操作简单、检测准确、便捷快速且可肉眼直接判断的可同时检测多种真菌毒素的检测方法就显得颇为重要。

近年来新兴的生物芯片技术为解决这个问题提供了一个新的思路。蛋白质芯片技术采用基因芯片的微点阵技术将系列抗原或抗体密集点阵于介质载体形成免疫微阵列，沿用传统ELISA检测原理通过免疫反应产生检测信号，从而对实验结果进行定性或定量分析。与微点阵技术相对应的是宏阵列点阵技术，该技术是构建在载体面积相对较大的一种芯片形式，将抗原或者抗体以相对宽大的间距点阵于玻璃载体基质或者硝酸纤维素膜基质上面，加入抗体或者酶标记抗原，运用生物素-亲和素信号系统或者辣根过氧化物酶信号系统将信号放大，以不溶性四甲基联苯胺为显色底物，直接通过肉眼来判断结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可同时检测谷物、饲料及食品中重要真菌毒素(黄曲霉毒素B₁、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马菌素B₁、伏马菌素B₂)的膜基质蛋白质芯片。

本发明还涉及上述膜基质蛋白质芯片的制备方法。

本发明的技术方案如下：

本发明所述的膜基质蛋白质芯片由聚偏二氟己烯膜基片以及固定在该基片上的点样物组成。

所述的点样物为黄曲霉毒素B₁、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马菌素B₁、伏马菌素B₂的牛血清白蛋白偶联物(真菌毒素全抗原)，各真菌毒素与牛血清白蛋白的摩尔结合比为10-30∶1；

所述的用于固定点样物的稳定物由蔗糖、甲醇及防腐剂组成，其中真菌毒素全抗原总量与防腐剂的重量比为1∶0.01-0.5、与蔗糖的重量比为：1∶50-200、与甲醇的重量比为1∶0.01-0.1。

本发明所述防腐剂为苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸丁脂、苯甲酸钠中的任意一种。

本发明所述的黄曲霉毒素B₁、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马菌素B₁、伏马菌素B₂的牛血清白蛋白偶联物(真菌毒素全抗原)用于捕获结合各自对应的真菌毒素抗体；稳定物用于稳定固相结合于聚偏二氟乙烯膜基质上的真菌毒素全抗原。

本发明所述的膜基质蛋白质芯片的制备方法是：先将聚偏二氟乙烯膜置于甲醇中浸泡后，将膜平整放置于滤纸上端，用点样仪将点样物点于膜上，温育后再用杂蛋白封闭膜上没有结合点样物的多余位点，洗涤晾干后真空封装。

更具体地说，本发明所述的膜基质蛋白质芯片的制备方法是：

1)膜的前处理，将聚偏二氟乙烯膜置于甲醇中浸泡5-20分钟，用蒸馏水将膜上甲醇洗涤干净；2)点样，将处理过的膜平整置于滤纸上端，用玻棒去除气泡，点样仪将点样物点于膜上，置于25-37℃中温育2-3小时；3)封闭，将膜置于3-10％(m/v％)的脱脂奶粉中，25-37℃中温育2-3小时；4)洗涤，用pH为7.2-8.0的磷酸盐缓冲液洗涤封闭后的膜，晾干后真空封装于铝箔袋中可长期保存待用。

目前的蛋白质芯片通常用的基质都是玻璃载体或是氨基化、酰基化修饰后的玻璃载体、硝酸纤维素膜等材料，为了更好的实现肉眼辨别且适合基层大规模使用，本发明选用了聚偏二氟乙烯作为膜基质，该膜具有很强的蛋白质吸附能力，物理化学性能较好，耐酸碱有机溶剂等优点，但该膜由于很强的疏水性，一般条件下很难将蛋白质均匀的点样于膜上，本发明通过甲醇活化后，用水洗涤，直接将膜铺于滤纸上，通过毛细渗透作用，将蛋白质均匀且牢固的点样于膜上，无需额外的点样缓冲液，方便而且快捷，同时选用了普通的脱脂奶粉进行封闭，降低了制作成本，封闭完成后的干燥及抽真空步骤都可大大增加蛋白质芯片的长期保存。

本发明由于将6种(黄曲霉毒素B₁、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马菌素B₁、伏马菌素B₂)真菌毒素全抗原同时点样于一张膜上，借鉴间接竞争ELISA原理，从而可达到在一张膜上可同时检测6种不同的真菌毒素，只需要提取一次样品就可知该样品中含有的真菌毒素种类，样品提取完成后与6种真菌毒素抗体混匀，真菌毒素膜基质蛋白质芯片浸泡在混有真菌毒素抗体和待检样品的液体中反应2-5分钟后，用磷酸缓冲液洗涤未结合及游离的真菌毒素抗体，然后再将真菌毒素膜基质蛋白质芯片浸泡于辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG二抗工作液中反应2-5分钟，用磷酸缓冲液洗涤未结合及游离的二抗，加入沉淀型的四甲基联苯胺(TMB)显色液进行显色，显色完毕后用水终止显色，肉眼判断结果。若样品中不含有该项真菌毒素，则点样有该真菌毒素全抗原的位置将显色，表明为阴性；反之，则不显色，表明为阳性。

本发明操作简单、方便快速、无需任何仪器设备就可一次性完成多种真菌毒素种类的测定，并可长期保存，兼具了ELISA灵敏度高的特点，胶体金免疫层析技术肉眼判别的特点以及生物芯片高通量检测的特点，制备工艺简单，可大规模化生产。

具体实施方式

本发明将通过以下实施例作进一步的说明。

实施例1。制作可同时检测多种真菌毒素的膜基质蛋白质芯片

(一)膜的前处理

1、将聚偏二氟乙烯膜浸没于分析纯甲醇溶液中，浸泡10分钟；

2、将膜取出，用蒸馏水冲洗5次；

3、用吹风机将膜上水分晾干。

(二)点样

1、将6种真菌毒素全抗原用磷酸缓冲液(pH＝7.4)稀释成0.5mg/mL，待用；

2、分别取6种真菌毒素全抗原1mg，混合加入0.5mg苯甲酸、50mg蔗糖、100μL分析纯甲醇，混匀，置于96孔酶标板中，制备完成6种真菌毒素点样物待用；

3、将处理好的膜平铺置于滤纸上端，用玻璃棒赶走中间气泡；

4、用点样仪各取6种真菌毒素点样物3μL，依次点样于膜上，置于37℃温箱中孵育2小时。

(三)封闭

1、称取7.5克脱脂奶粉，加入100mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，混匀待用；

2、将上述点样完毕的膜取出，置入配好的脱脂奶粉溶液中，37℃温育2小时；

3、温育完毕后，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)冲洗4次，晾干。

(四)真空保存

1、将封闭完毕的膜置于超净工作台中，开启最大风速，吹2小时；

2、取出膜，置于铝箔袋中，抽真空去除袋中空气，热封口，长期保存。

实施例2。采用可同时检测多种真菌毒素的膜基质蛋白质芯片检测玉米样品

(一)真菌毒素蛋白质芯片的制备

同实施例1

(二)玉米样品的提取

1、称取5克有代表性的玉米样品，充分粉碎后置入250 mL的三角烧瓶中，往瓶中加入25 mL 60％甲醇/水溶液，充分振荡3分钟；

2、静置2分钟，取上层液体2 mL，加入6 mL 20％甲醇/水，混匀，过滤，滤液即为样品提取液。

(三)样品检测

1、取出2张膜芯片，打开真空包装，待用；

2、取1.5 mL样品提取液，加入1.5 mL内含6种真菌毒素抗体的工作液，混匀，作为待检工作液；

3、取1.5 mL 30％甲醇/水，加入1.5 mL内含6种真菌毒素抗体的工作液，混匀，作为阴性对照液；

4、2张膜芯片分别投入含有待检工作液和阴性对照液的反应盒中，浸没，室温反应5分钟；

5、反应完毕后，取出膜芯片，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)冲洗4次；

6、将2张膜分别投入含有辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG二抗工作液中，浸泡室温反应5分钟；

7、反应完毕后，取出膜芯片，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)冲洗4次；

8、将2张膜分别投入沉淀型的四甲基联苯胺(TMB)显色液进行显色1分钟，显色完毕后，用蒸馏水冲洗，终止显色。

(四)结果判断

1、若样品中不含有该项真菌毒素，则点样有该真菌毒素全抗原的位置将显色，表明为阴性；

2、若样品中含有该项真菌毒素，则点样有该真菌毒素全抗原的位置将不显色，表明为阳性；

3、投入阴性对照液中的膜芯片，膜上各点均应显色，表明反应体系正常。

Claims

1.一种检测真菌毒素的膜基质蛋白质芯片，其特征是由聚偏二氟已烯膜基片以及固定在该基片上的点样物组成；

所述的点样物一共6种，分别为6种真菌毒素与牛血清白蛋白的偶联物，所述6种真菌毒素为黄曲霉毒素B₁、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马菌素B₁、伏马菌素B₂，依次点阵于基片上，真菌毒素与牛血清白蛋白的摩尔结合比为10-30∶1；

所述的用于固定所述的点样物的稳定物由蔗糖、甲醇及防腐剂组成，其中真菌毒素与防腐剂∶蔗糖∶甲醇的重量比为1∶0.5∶50∶0.1。

2.根据权利要求1所述的膜基质蛋白质芯片，其特征是所述防腐剂为苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸丁脂、苯甲酸钠中的任意一种。

3.权利要求1所述的膜基质蛋白质芯片的制备方法，其特征是先将聚偏二氟乙烯膜置于甲醇中浸泡后，将膜平整放置于滤纸上端，用点样仪将点样物点于膜上，温育后再用杂蛋白封闭膜上没有结合点样物的多余位点，洗涤晾干后真空封装。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：1)将聚偏二氟乙烯膜置于甲醇中浸泡5-20分钟，用蒸馏水将膜上甲醇洗涤干净；2)将处理过的膜平整置于滤纸上端，用玻棒去除气泡，点样仪将点样物点于膜上，置于25-37℃中温育2-3小时；3)将膜置于质量体积比为3-10％的脱脂奶粉中，25-37℃中温育2-3小时；4)用pH为7.2-8.0的磷酸盐缓冲液洗涤封闭后的膜，晾干后真空封装于铝箔袋中。