CN102539739A - 定量检测食品和中药中速灭威含量试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫学分析技术领域的一种定量检测农药速灭威含量的试剂盒及其检测方法，适用于食品和中药中速灭威残留的检测。本试剂盒以高特异性速灭威多抗为检测抗体，采用直接竞争ELISA技术，测定的基础是标记免疫反应。试剂盒由试剂组和包被板组成，并且配套了快速前处理方法。本发明灵敏度高，准确性好，结果稳定，检测方法操作简单，价格低廉，具有良好的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于免疫学分析技术领域的一种定量检测农药速灭威含量的试剂盒及其检测方法，涉及到有机化学合成、免疫化学、生物化学等技术，适用于食品和中药中速灭威残留的快速检测。
背景技术
速灭威(Metolcarb)是一种氨基甲酸酯类杀虫剂，主要起触杀和熏杀作用，抑制了虫体胆碱酯酶活性，使之乙酰胆碱堆积中毒而死亡，为中等毒性的杀虫剂，无慢性毒性，无致癌、致畸、致突变作用，对鱼有毒，对蜜蜂高毒。纯品对雄性小白鼠口服毒性LD50为268mg/kg，大鼠口服毒性LD50为498-500mg/ml，大鼠经皮LD50为6000mg/kg。主要用于防治棉花、水稻、茶树、柑橘等作物的作物的害虫，具有杀虫广谱、残效长、杀死率高的特点。但是由于国家禁用一些高毒性如甲胺磷等农药，因而导致了速灭威的用量大大增加，已对食品、蔬菜、水源和环境造成了污染，对人类的健康存在着潜在的威胁。速灭威的大量使用和残留期较长等特点使得速灭威残留量的检测监控十分迫切。传统的检测速灭威残留的方法是分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱/质谱等仪器分析方法。仪器检测虽然可靠有效，但是仪器昂贵，对技术人员要求高，并且需要烦琐的前处理技术，从而造成分析时间加长，同时检测样品量有限。
小分子化合物免疫分析技术为复杂样本中痕量农药残留的快速分析开辟了新的道路，已成为现今国际上农药残留分析很活跃的研究领域之一，尤其酶联免疫分析(ELISA)应用方面取得较大进展。酶联免疫法克服了仪器检测的缺点，方法简便快捷、特异性强、灵敏度高，样品容量大，分析成本低廉。
酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是将农药小分子作为半抗原，通过一定途径与生物大分子(如蛋白质等)载体以共价键相偶联制备人工抗原，用制备的人工抗原免疫动物，连接在载体上的农药分子便成为抗原决定簇，被免疫动物产生对该农药分子具有特异性的抗体，在此抗体上连接上标记物(酶、荧光物质、放射性同位素等)，利用抗原抗体特异性反应和抗体上标记物的放大作用，对样本中微量农药残留物进行定性、定量检测。
发明内容
本发明的目的就是要克服现有技术的不足，提供一个可以定量检测食品以及中药中的速灭威含量的试剂盒及检测方法。该检测方法的灵敏度可达μg/kg级别。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种采用直接ELISA法技术定量检测食品及中药中速灭威含量的试剂盒，其特征在于：该试剂盒由试剂组和96孔包被板构成。
所述的试剂组包括：
(1)浓缩PBS缓冲液：40mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4，使用时用双蒸水5倍稀释；
(2)底物A：含过氧化氢脲的乙酸钠缓冲溶液；
(3)底物B：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)的二甲基亚砜溶液；
(4)浓缩洗涤液：含1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，使用时用双蒸水5倍稀释；
(5)终止液：1.25M的硫酸；
(6)速灭威标准溶液：其速灭威标准溶液母液为1mg/mL，使用时用PBS缓冲溶液稀释到2000μg/L后，再按1∶5稀释6个梯度；
(7)酶标记的速灭威抗原溶液：速灭威半抗原与辣根过氧化物酶(HRP)的偶联物，使用时用PBS缓冲液稀释1万倍。
上述的包被板为96孔或48孔酶标板，是由多克隆速灭威抗体包被于酶标板上。抗体是用pH为9.6的Na2CO3-NaHCO3包被缓冲溶液稀释到1μg/100μL，然后以每孔100μL包被于酶标板中，4℃过夜或者37℃恒温温育3小时，弃去包被溶液后用洗涤液洗板三次，加入200μL冻干液封闭1小时，洗涤液洗板四次后冻干真空包装，于4℃保存。冻干液为含质量浓度为1％BSA的Tris-HCl缓冲溶液。
使用上述试剂盒进行样品检测包括以下几个步骤：
(1)室温下样品的前处理，包括中药的前处理；
(2)检测前，将试剂盒打开，所有试剂和标本都必须在室温下平衡1-2小时；
(3)酶标抗原用PBS缓冲溶液稀释1万倍，在包被板上对速灭威标准溶液及待测样品进行双孔平行加样(各50μL/孔)，同时加入稀释后的酶标抗原(50μL/孔)，空白加100μL PBS，摇床上混匀1分钟，37℃温育1小时；
(4)洗板4次后，每孔中加入体积比为14.6∶0.45的底物显色液A液和B液混合液，37℃显色20分钟；
(5)加终止液，混匀，在双波长方式(450-650nm)下用酶标仪读取OD值。
本发明的优点是：
1.本发明具有高特异性、灵敏、准确、快速、简单、廉价，适用范围广。可适用于大多数谷物、蔬菜、水果以及中药的检测，特别是对于成分复杂的中药，前处理简单，重复性好。并且抗体灵敏度高，制备的抗体和酶标抗原稳定，具有保藏时间长的优点。
2.本发明提供的快速检测方法简便、高效，完成全部检测工作只需1.5-2小时，而且精确度能达到90％以上，适合目前现场快速检测的要求。由于抗体和酶标的稳定性好，为大规模样品的集中检测提供了极大的方便。
3.本发明成本低、检测效率高、可信度好、操作简便，具有极大的社会效益和经济效益，是一种新型的具有良好应用前景的食品及中药中速灭威残留检测的试剂盒。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本食品和中药中速灭威检测试剂盒由盒体、包被板构成。
一种采用直接ELISA法技术定量检测食品及中药中速灭威含量的试剂盒的检测方法包括以下步骤：
1.室温下样品的前处理。
对于食品——即谷物、蔬菜和水果(包含果汁)，固体样品称取10g(精确到0.01g)均质样品到离心管中，加入10mL甲醇提取溶液，剧烈混匀2min，离心(4℃，3500r/min，5min)，吸取上清液用PBS稀释后加掩蔽剂进行测定。液体样品：直接稀释后加掩蔽剂进行检测。本发明所有谷物、果蔬样品经稀释20倍后添加0.5％鱼皮胶做掩蔽剂即能消除基质对标准曲线的影响。
对于中药，直接称取烘干的固体样品1g，用10mL甲醇分两次提取。涡旋振荡5min，5000转离心5min，吸取上清液。合并两次提取的上清液，旋干后用总体积为1mL等体积的甲醇和PBS复溶。稀释100-400倍后添加0.5％的明胶和0.05％吐温-20或0.1％的BSA和0.05％吐温-20做掩蔽剂即能消除基质影响；
2.所有试剂和标本都必须在室温下平衡1-2小时；
3.酶标抗原用PBS缓冲溶液稀释1万倍，在包被板上对速灭威标准溶液及待测样品进行双孔平行加样(各50μL/孔)，同时加入稀释后的酶标抗原(50μL/孔)，空白加100μL PBS，摇床上混匀1分钟，37℃温育1小时；
4.洗板4次后，每孔中加入体积比14.6∶0.45为底物显色液A液和B液混合液，37℃显色20分钟；
5.加终止液，混匀，在双波长方式(450-650nm)下用酶标仪读取OD值。
下面通过两例来对本发明的效果进行叙述。
(1)检测黄瓜中速灭威的含量：
1.样品的前处理：称取10g(精确到0.01g)均质的黄瓜到离心管中，加入10mL甲醇提取溶液，剧烈混匀2min，离心(4℃，3500r/min，5min)，上清液用PBS稀释20倍后添加0.5％鱼皮胶做掩蔽剂进行测定；
2.打开试剂盒取出包被板，分别将50μL速灭威梯度稀释的标准溶液和50μL样本提取液双孔平行加入到包被板中，然后再在标准溶液和样品提取液中均加入50μL10万倍稀释的酶标抗原溶液，37℃反应1h；
3.用洗涤液洗板三次，在每孔中加入底物A和B液的混合液100μL，37℃显色20min；
4.向各微孔中加入50μL终止液进行终止反应。在双波长方式下(450-650nm)用酶标仪读取OD值，绘制标准曲线图，对照速灭威标准曲线图得到样品提取液中速灭威的含量。
5.结果计算
1)抑制率计算公式(A)
IC(％)＝[1-(A样品-A空白)/(A对照-A空白)]×100 (A)
式中：
IC(％)——速灭威对抗原抗体结合反应的抑制率；
A——450nm吸光值与650nm吸光值的差值；
A样品——速灭威标准溶液或样液的平均吸光度值；
A空白——不加入酶标及速灭威标准液的平均吸光度值。
2)绘制标准曲线
以抑制率为纵坐标，速灭威浓度对数为横坐标绘制标准曲线。每次试验均应重新绘制标准曲线。
3)结果计算
从图1绘制的标准曲线上读取样液抑制率所对应的速灭威浓度(C)，按公式(B)计算试样中的速灭威残留量：
X＝C*R (B)
X——试样中速灭威残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
C——根据样品孔的抑制率查得试样中速灭威浓度，单位为微克每升(μg/L)；
R——换算系数，在谷物、蔬菜水果中均为20。
加标实验：
在黄瓜样品中分别添加3种不同浓度速灭威标准溶液，将加标样品充分混勾，其余处理过程同上，然后进行直接酶联免疫方法检测样品中的速灭威含量。在对黄瓜样品的检测中，分别在1、5和10ng水平进行加标回收试验，其回收率为90％和105％和110％。
食品中各种谷物、蔬菜、水果(含果汁)的加标试验如表一，每个浓度设三个平行。
表一 不同食品样品中速灭威的加标回收率
(2)检测枸杞中速灭威的含量：
1.样品的前处理：称取1g(精确到0.01g)烘干的枸杞到离心管中，加入甲醇10mL分两次提取。涡旋振荡5min，5000转离心10min，吸取上清液。合并两次提取的上清液，旋干后用总体积为1mL等体积的甲醇和PBS复溶。复溶液用PBS稀释200倍后添加0.5％明胶和0.05的吐温-20做掩蔽剂进行测定；
2.打开试剂盒取出包被板，分别将50μL速灭威梯度稀释的标准溶液和50μL样本提取液双孔平行加入到包被板中，然后再在标准溶液和样品提取液中均加入50μL 1万倍稀释的酶标抗原溶液，37℃反应1h；
3.用洗涤液洗板三次，在每孔中加入底物A和B液的混合液100μL，37℃显色20min；
4.向各微孔中加入50μL终止液进行终止反应。在双波长方式下(450-650nm)用酶标仪读取OD值，绘制标准曲线图，对照速灭威标准曲线图得到样品提取液中速灭威的含量。
加标实验：
在枸杞样品中分别添加3种不同浓度速灭威标准溶液，将加标样品充分混勾，其余处理过程同上，然后进行直接酶联免疫方法检测样品中的速灭威含量。在对枸杞样品的检测中，分别在0.05、0.1和0.2μg水平进行加标回收试验，其回收率为85.6％和88.5％和91.0％。
中药的加标试验如表二，每个浓度设三个平行。金银花、大青叶、人参、元胡止痛片、板蓝根、枸杞分别稀释200倍、400倍、300倍、400倍、300倍、100倍后用于检测。由于目前各国还没有对中药中速灭威残留量的严格限定，在参考其它食品中速灭威的最高残留限量后，本发明的稀释倍数是可信的。
表二 不同中药样品中速灭威的加标回收率
Claims (7)
1.一种采用直接竞争酶联免疫技术定量检测食品及其中药中速灭威含量的试剂盒，其特征在于：由试剂组和包被板构成；
2.根据权利要求1所述的定量检测食品及中药中速灭威含量的试剂盒，其特征在于试剂组为：
1)浓缩PBS缓冲液为40mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4，使用时用双蒸水5倍稀释，
2)底物A为含过氧化氢脲的乙酸钠缓冲溶液，
3)底物B为3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)的二甲基亚砜溶液，
4)浓缩洗涤液为含1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，使用时用双蒸水5倍稀释，
5)终止液为1.25M的硫酸，
6)速灭威标准溶液为其速灭威标准溶液母液为1mg/mL，使用时用PBS缓冲溶液稀释到2000μg/L后，再按1∶5稀释6个梯度，
7)酶标记的速灭威抗原溶液为速灭威半抗原与辣根过氧化物酶(HRP)的偶联物，使用时用PBS缓冲液稀释10000倍；
3.根据权利要求1所述的定量检测食品及中药中速灭威含量的试剂盒，其特征在于：包被板是用多克隆速灭威抗体包被经过低温冻干的96孔酶标板；
4.根据权利要求3所述的定量检测食品及中药中速灭威含量的试剂盒，其特征在于：用于96孔酶标板的冻干液为含质量浓度为1.5％BSA的Tris-HCl缓冲溶液；
5.根据权利要求1所述的定量检测食品及中药中速灭威含量的试剂盒的检测方法，其特征在于：在进行检测时，底物A和底物B的混合液配比是14.6∶0.45；
6.根据权利要求1所述的定量检测食品及中药中速灭威含量的试剂盒的检测方法室温下样品的前处理其特征在于：
1)谷物、蔬菜和水果和果汁样品匀质后加甲醇提取，剧烈混匀2min，4℃ 3500转/分钟离心10分钟，吸取上清液用PBS稀释后加掩蔽剂进行测定；
2)中药材用10mL甲醇涡旋振荡5分钟，5000转/分钟离心5分钟，提取两次，合并两次提取的上清液，旋干后用总体积为1mL等体积的甲醇和PBS复溶；
7.根据权利要求1所述的定量检测食品及中药中速灭威含量的试剂盒的检测方法其特征在于；
1)检测前，将试剂盒打开，所有试剂和标本都必须在室温下平衡1-2小时，
2)酶标抗原用PBS缓冲溶液稀释1万倍，在包被板上对速灭威标准溶液及待测样品进行双孔平行加样(各50μL/孔)，同时加入稀释后的酶标抗原(50μL/孔)，空白加100μLPBS，摇床上混匀1分钟，37℃温育1小时，
3)洗板4次后，每孔中加入100μL显色液A液和B液混合液，37℃显色20min，
4)加终止液，混匀，在双波长方式(450-650nm)下用酶标仪读取OD值。
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