CN110665486B - 一种磁性四氧化三铁-pamam-抗体复合体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁性Fe3O4‑PAMAM‑抗体复合体及其制备方法和处理四环素的方法。通过交联剂戊二醛将聚酰胺‑胺和磁性粒子连接起来制备可磁性分离的Fe3O4‑PAMAM复合载体，并在EDC‑NHS的活化下将抗四环素抗体固定于复合载体上，此Fe3O4‑PAMAM‑抗体复合物可高效、特异性处理水环境中的微量、痕量四环素，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于环境治理领域，具体涉及一种磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体及其制备方法和在处理水中残留抗生素中的应用。
技术背景
抗生素是目前为止改善人类健康的最成功的的药物，被广泛用于预防和治疗动植物感染及促进畜牧业的增长。但是近年来随着抗生素的广泛使用和滥用，造成了环境中抗生素的大量残留以及耐药性问题的出现，严重影响着生态环境和人类健康，因此对抗生素污染的治理迫在眉睫。
目前，国内外处理水体环境中抗生素的方法主要有以下四大类：物理处理法、化学处理法、生物处理法以及多种方法的混合处理。例如公开号为CN105540873A的专利所报道的方法是采用将含硝化螺旋菌液与需处理的四环类抗生素废水混合，并向其引入河道污泥进行曝气处理、静置、过滤，最后将滤液与聚丙烯酰胺混合的思路，这种方法比较麻烦，且对低浓度抗生素的处理不够灵敏。公开号为CN105999609A的专利所报道的方法是采用一种矿物降解四环素，主要是将矿物与四环素的盐酸溶液混合，在微波作用下对四环素进行降解。这种降解方法虽然简便易行，条件温和，易于控制，但是这种方法不能特异性处理抗生素。公开号为CN107159112A的专利报道的方法是使用一种磁性复合吸附剂去除废水中四环素的方法，这种方法的缺点是没有将抗生素抗体固定在磁性复合吸附剂上，不能特异性去除抗生素。基于以上问题，可以利用抗体-抗原的特异性结合原理，将抗体固定于磁性Fe3O4-PAMAM复合载体上来达到对抗生素的高效、特异性处理，且复合物可回收利用，为水体环境中抗生素的去除提供一种经济的、特异性、灵敏、无毒的处理方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的制备方法，利用该方法制备出来的复合体能够有效地去除水体环境中的四环素。
本发明制备的磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体，是利用交联剂戊二醛连接聚酰胺-胺和磁性粒子制备可磁性分离的Fe3O4-PAMAM复合载体，并在EDC-NHS的活化下将抗四环素抗体固定于复合载体上，从而实现对四环素的特异性处理。
一种磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）PAMAM的修饰：取PAMAM溶于甲醇中，再加入丁二酸酐，在室温下搅拌反应12h，得到部分末端羧基修饰的PAMAM；
（2）磁性Fe3O4的氨基化：取磁性Fe3O4溶于乙醇溶液，超声处理30min后加入APTES，室温下搅拌反应7.5h，经干燥得到氨基化的Fe3O4颗粒；
（3）Fe3O4-PAMAM复合载体的制备：将过量5wt%戊二醛溶液与步骤（2）得到的氨基化Fe3O4混合，在室温下搅拌反应5h后，用外加磁场将氨基化Fe3O4从戊二醛溶液中分离出来；然后将步骤（1）得到的部分羧基末端PAMAM溶于二甲基亚砜中得到PAMAM溶液，然后在PAMAM溶液中加入经过戊二醛处理的氨基化Fe3O4，在室温下搅拌反应4h后，利用外加磁场将合成物从PAMAM溶液中分离出来，即得Fe3O4-PAMAM复合载体；
（4）Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的制备：取步骤（3）中制得的Fe3O4-PAMAM复合载体溶于二甲基亚砜中，再加入EDC和NHS混合液，对复合载体上PAMAM的羧基末端进行活化，然后再投入抗四环素抗体，在室温下反应，然后利用外加磁场将合成物从混合物中分离出来即得到磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体。
进一步地，所述步骤（1）中丁二酸酐与PAMAM摩尔比为1:1。
进一步地，步骤（4）EDC-NHS活化剂的浓度为1.5mg/mL，pH为6.5，活化时间为4h。
通过研究抗体固定化过程中活化剂浓度、溶液pH、时间等来考察研究影响抗体固定化的因素，并不断进行优化，确定抗体共价偶联固定的最适宜条件。用在最佳条件下制备的Fe3O4-PAMAM-抗体复合体处理含有盐酸四环素的水溶液，并用高效液相色谱对盐酸四环素的含量进行测定，计算得出复合体对盐酸四环素的去除效率。
利用傅里叶红外光谱仪、核磁共振分析、X射线衍射仪、紫外分光光度计对磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体进行表征分析。
本发明的显著优点是：此方法制备的Fe3O4-PAMAM-抗体复合体可以处理特定的抗生素，实现用固定化抗体对抗生素进行安全专一的特异性处理；并且可以用磁性纳米复合材料做固定载体，通过磁性对抗生素进行分离去除，可以用于各种水体或废液。
附图说明
图1为Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的制备及其处理四环素流程图；
图2为Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的紫外光谱分析：A，Fe3O4-PAMAM-抗体；B,抗体；C，PAMAM的紫外吸收光谱图。
具体实施方式
为便于理解本发明，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的制备方法，包括以下步骤：
聚酰胺-胺(PAMAM)的修饰：称取适量的PAMAM溶于2ml甲醇中，然后将丁二酸酐按照与PAMAM1:1的摩尔比加入，在室温下搅拌反应12h,除去过量丁二酸酐和溶剂甲醇后即可得到部分末端羧基修饰的PAMAM。
磁性Fe3O4纳米粒子的制备与修饰：称取3gFeCl2·4H2O和7.8gFeCl3·6H2O的混合物溶解到250mL去离子水中，滴加NaOH溶液，待出现黑色物质时将反应温度升至80℃，再恒温搅拌反应50min；然后将所得沉淀分离出来，对产物进行干燥，即可得到磁性Fe3O4。称量125mg溶于150mL乙醇溶液中，超声处理30min，再滴加0.4mL APTES于上述混合溶液中，室温下搅拌反应7.5h，分离修饰后的磁性粒子，最后干燥即可得到氨基化的Fe3O4颗粒。
Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的制备：将过量5%的戊二醛与氨基化Fe3O4混合室温下搅拌反应5h后，将氨基化Fe3O4分离出来；将部分羧基末端PAMAM溶于二甲基亚砜(DMSO)中，加入经过戊二醛处理的氨基化Fe3O4，在室温下搅拌反应4h后，将合成物从过量DMSO中分离出来，得Fe3O4-PAMAM复合载体；将其溶于DMSO中，然后将EDC-NHS活化剂加入溶液中，随即将抗四环素抗体投入反应体系中反应，将合成物从溶剂中分离出来即得Fe3O4-PAMAM-抗体。
其中，抗体固定于Fe3O4-PAMAM复合载体的最适条件：EDC-NHS活化剂浓度为1.5mg/mL，pH为6.5，时间为4h。
实施例2
一种磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的制备方法，包括以下步骤：
聚酰胺-胺(PAMAM)的修饰和磁性Fe3O4纳米粒子的制备与修饰如实施例1。
Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的制备：将过量5%的戊二醛与氨基化Fe3O4混合室温下搅拌反应5h后，将氨基化Fe3O4分离出来；将部分羧基末端PAMAM溶于二甲基亚砜(DMSO)中，加入经过戊二醛处理的氨基化Fe3O4，在室温下搅拌反应3h后，将合成物从过量DMSO中分离出来，得Fe3O4-PAMAM复合载体；将其溶于DMSO中，然后将1.0mg/mL EDC-NHS活化剂加入溶液中，随即将抗四环素抗体投入反应体系中反应，将合成物从溶剂中分离出来即得Fe3O4-PAMAM-抗体。
应用实施步聚如下：
Fe3O4-PAMAM-抗体复合体处理水体环境中的四环素：将四环素溶液加入到25mL的三角瓶中，再加入适量的Fe3O4-PAMAM-抗体复合体，室温条件下搅拌反应90min，然后利用外加磁场将复合体从溶液中磁性分离，用定量去离子水反复冲洗复合体以去除未被复合体结合的四环素，用HPLC法测定四环素浓度。根据公式η= (1-CS/C0)×100%；计算四环素的去除率（η：四环素的去除率； CS：反应后溶液中的四环素浓度；C0：反应前溶液中的四环素浓度）。
应用例1
将100mg/L的四环素加入25mL三角瓶中，在加入Fe3O4-PAMAM-抗体复合体，于30℃下搅拌反应60min，用外加磁场将复合体从溶液中磁性分离，用去离子水反复冲洗复合体以去除未被复合体结合的四环素，测定四环素浓度。实验结果表明：当四环素浓度为100mg/L时，四环素几乎可以被全部去除。
应用例2
将200mg/L的四环素加入25mL三角瓶中，同应用例1相同的方法，四环素的pH相同，所用抗体复合体的量也相同，最后测定四环素浓度。实验结果表明：当四环素浓度为200mg/L时，其去除率在90%左右。
应用例3
将300mg/L的四环素加入25mL三角瓶中，同应用例1相同的方法，四环素的pH相同，所用抗体复合体的量也相同，最后测定四环素浓度。实验结果表明：随着处理时间的增加，四环素的浓度逐渐降低，当四环素浓度为300mg/L时，其去除率大约为70%。
应用例4
将300mg/L的四环素加入25mL三角瓶中，同应用例1相同的方法，四环素的pH相同，所用抗体复合体的量也相同，将复合体分离后测定四环素浓度。实验结果表明：随着处理时间的增加，四环素的浓度逐渐降低，当四环素浓度为400mg/L时，其去除率不到50%。
应用例5
将300mg/L的四环素加入25mL三角瓶中，同应用例1相同的方法，四环素的pH相同，所用抗体复合体的量也相同，将复合体分离后测定四环素浓度。实验结果表明，当四环素浓度为500mg/L时，其去除率低于50%。可能是复合体上的全部抗体都已与四环素相结合而处于饱和状态，不能继续连接新的四环素，致使其去除率低下。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.一种磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）PAMAM的修饰：取PAMAM溶于甲醇中，再加入丁二酸酐，在室温下搅拌反应12h，得到部分羧基末端修饰的PAMAM；
（2）磁性Fe3O4的氨基化：取磁性Fe3O4溶于乙醇溶液，超声处理30min后加入APTES，室温下搅拌反应7.5h，经干燥得到氨基化的Fe3O4颗粒；
（3）Fe3O4-PAMAM复合载体的制备：将过量5wt%戊二醛溶液与步骤（2）得到的氨基化Fe3O4混合，在室温下搅拌反应5h后，用外加磁场将氨基化Fe3O4从戊二醛溶液中分离出来；然后将步骤（1）得到的部分羧基末端PAMAM溶于二甲基亚砜中得到PAMAM溶液，然后在PAMAM溶液中加入经过戊二醛处理的氨基化Fe3O4，在室温下搅拌反应4h后，利用外加磁场将合成物从PAMAM溶液中分离出来，即得Fe3O4-PAMAM复合载体；
（4）Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的制备：取步骤（3）中制得的Fe3O4-PAMAM复合载体溶于二甲基亚砜中，再加入EDC-NHS活化剂，对复合载体上PAMAM的羧基末端进行活化，然后再投入抗四环素抗体，在室温下反应，然后利用外加磁场将合成物从混合物中分离出来即得到磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体。
2.根据权利要求1所述的磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中丁二酸酐与PAMAM摩尔比为1:1。
3.根据权利要求1所述的磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体的制备方法，其特征在于：步骤（4）EDC-NHS活化剂的浓度为1.5mg/mL，pH为6.5，活化时间为4h。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的制备方法得到的磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体。
5.一种如权利要求4所述的磁性Fe3O4-PAMAM-抗体复合体在去除水体环境中的四环素方面的应用。
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