CN105137086A - 用于检测磺胺药物的试剂盒和试纸条及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测磺胺药物的试剂盒和试纸条及其应用。采用利用保藏菌株大肠埃希氏菌(Escherichia？coli)BL21(DE3)-pET28b-flop表达得到的蛋白质flop制备的试剂盒和胶体金试纸条能够用于检测磺胺药物。本发明的试剂盒和胶体金试纸条具有灵敏度高、准确度高、成本低、操作简单、保质期长的优点；能快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测，在磺胺药物的检测中将发挥重大作用。

Description

用于检测磺胺药物的试剂盒和试纸条及其应用
技术领域
本发明涉及免疫分析领域中用于检测磺胺药物的试剂盒和试纸条及其应用。
背景技术
磺胺药物是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的化学药物，其中应用较广并有确切疗效的有数十种，由于其价格便宜、使用方便，广泛应用于动物疾病防治和促生长。磺胺药物的不合理使用在畜牧产品中产生了严重的残留现象，食品中残留的磺胺药物会危害人们的身体健康，长期摄入含有磺胺药物残留的食物可引起细菌耐药性增加，产生肾脏毒性，影响造血系统等毒副作用。
随着人们对食品安全的日益重视，欧盟、中国、美国、日本等国家相继对动物源性食品中磺胺药物最大残留限量值作出了规定，其中欧盟和中国规定磺胺药物总量的最高残留限量为100ppb。
目前磺胺药物的检测方法主要有仪器法(包括高效气相色谱、高效液相色谱以及色质联用技术等)、微生物法、免疫分析方法以及受体分析方法等，这些方法各有特点：仪器法准确、可靠、灵敏度高，是一种确证方法，但是不适合现场快速检测；微生物法可同时检测多种抗生素，但灵敏度不高、检测时间长，且无法定量；免疫分析方法基于抗原抗体的特异结合，具有灵敏度高、特异性强、可定量检测等优势，但由于灵敏度高且可识别同一类药物的抗体难以获得，制约了其在兽药残留检测领域中的应用。如能开发出可同时检测多种磺胺药物的产品将有助于磺胺药物的检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测多种磺胺药物。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测磺胺药物的试剂盒。
本发明所提供的一种检测磺胺药物的试剂盒，包括包被原和酶标记物；所述包被原为蛋白质flop；所述酶标记物是将标记酶和4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸偶联在一起得到的偶联物；所述蛋白质flop为如下a)或b)的蛋白质：
a)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将SEQIDNo.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由a)衍生的蛋白质。
上述试剂盒中，所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶；辣根过氧化物酶可采用现有技术中的多种方法将其与4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸进行偶联，如二环己基碳二亚胺偶联法等。
上述试剂盒还包括如下中的至少一种：磺胺二甲基嘧啶标准溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、样品稀释液、包被缓冲液和封闭液。
上述试剂盒中，所述磺胺二甲基嘧啶标准溶液可以是一定浓度范围内的多种浓度的标准溶液，例如可以在0-100ng/mL之间，如磺胺二甲基嘧啶的浓度分别为50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL和1.6ng/mL。
当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由E液和F液组成，所述E液可为过氧化脲溶液或过氧化氢溶液(具体如质量百分含量为2％的过氧化脲溶液)，所述F液可为四甲基联苯胺溶液或邻苯二胺溶液(具体如质量百分含量为1％的四甲基联苯胺溶液)。所述终止液可为硫酸溶液，其浓度可为1-2M(如0.2M)。
上述试剂盒中，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液，在本发明的一个实施例中，所述洗涤液具体为含有吐温20和叠氮化钠的浓度为0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；吐温-20在所述洗涤液中的体积含量为0.05％，叠氮化钠在所述洗涤液中的浓度为5mg/mL。
上述试剂盒中，所述包被缓冲液的pH为8.0，由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度为：20mMTris、30mMMgCl2。
上述试剂盒中，所述封闭液为磷酸盐缓冲液；在本发明的一个实施例中，所述封闭液具体为pH7.4，含脱脂奶粉的浓度为0.02M的磷酸盐缓冲液；脱脂奶粉在所述封闭液中的浓度为20mg/mL。
所述包被缓冲液和所述封闭液也可以是本领域常用的其它包被缓冲液和封闭液。
上述试剂盒中，所述样品稀释液具体为pH值为8.0，由溶剂和溶质组成；溶剂为水，溶质及其浓度为：20mMTris、5mMMgCl2、2％(质量百分含量)脱脂奶粉、1:1500(v/v)的6-羟甲基-7,8二氢蝶呤焦磷酸盐(DHPPP)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述试剂盒的制备方法。
本发明所提供的所述试剂盒的制备方法，包括如下(1)或(2)的步骤：
(1)将所述包被原和所述酶标记物分别单独包装的步骤；
(2)将所述包被原、所述酶标记物、所述磺胺二甲基嘧啶标准溶液、所述底物显色液、所述终止液、所述洗涤液、所述样品稀释液、所述包被缓冲液和所述封闭液分别单独包装的步骤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测磺胺药物的胶体金试纸。
本发明所提供的一种检测磺胺药物的胶体金试纸，包括相互连接的样品垫、胶体金垫、反应膜和吸收垫；所述反应膜位于所述胶体金垫和所述吸收垫之间；所述胶体金垫包被有胶体金标记的带有HIS标签的所述的蛋白质flop；所述反应膜上含有检测线和质检线，所述检测线包被有4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸和载体蛋白，所述质检线包被有抗所述HIS标签的单克隆抗体；所述蛋白质flop为如下a)或b)的蛋白质：
a)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将SEQIDNo.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由a)衍生的蛋白质。
上述胶体金试纸中，所述样品垫的末端与所述胶体金垫的始端相连，所述胶体金垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸收垫的始端相连。
上述胶体金试纸中，所述反应膜上的检测线(T线)和质检线(C线)均是与所述胶体金试纸的长相垂直的条带状；所述检测线位于近于所述胶体金垫末端的一侧；所述质检线位于远离所述胶体金垫末端的一侧。
上述胶体金试纸中，所述载体蛋白可为卵清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、鼠血清白蛋白、甲状腺球蛋白或兔血清白蛋白，具体可为卵清白蛋白。
上述胶体金试纸中，所述抗所述HIS标签的单克隆抗体具体可为鼠抗HIS标签单克隆抗体。
上述胶体金试纸中，所述样品垫可为纤维素滤膜；所述反应膜可为硝酸纤维素膜；所述吸收垫可为吸水纸；所述胶体金垫可为包被有胶体金标记的蛋白质flop的玻璃纤维膜；样品孔位于所述胶体金试纸顶端，所述样品垫的始端为所述胶体金试纸顶端。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述胶体金试纸的制备方法。
本发明所提供的所述胶体金试纸的制备方法，包括如下(1)或(2)的步骤：
(1)分别制备所述的检测磺胺药物的胶体金试纸中所述样品垫、所述胶体金垫和所述反应膜；
(2)将步骤(1)得到的所述样品垫、所述胶体金垫、所述反应膜和所述吸收垫相互连接，得到所述反应膜位于所述胶体金垫和所述吸收垫之间的检测磺胺药物的胶体金试纸。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测样品中磺胺药物的方法。
本发明所提供的一种检测样品中磺胺药物的方法，为如下Ⅰ或Ⅱ所示的方法：
Ⅰ、检测样品中磺胺药物的方法包括如下步骤：
1)将待测样品进行前处理，得到待测样品溶液；
2)用所述试剂盒对所述待测样品溶液进行检测；
所述待测样品为牛奶：将牛奶用上述的样品稀释液按1:5的体积比进行稀释，4℃、10000rpm离心，取上清液，作为待测样品溶液；
所述待测样品为奶粉：称取1g奶粉，溶于5mL上述的样品稀释液中，混合均匀，作为待测样品溶液。
所述待测样品为尿液：将尿液直接作为待测样品溶液；
所述待测样品为鸡肉、鱼、虾或蛋：将所述待测样品匀浆处理，得到均质样品，将每5g所述均质样品加入10mL乙腈水溶液中，上下颠倒震荡10min，5000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，用1mL上述的样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样品溶液；乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为9:1；
所述待测样品为蜂蜜：将每5g所述待测样品加入到15mL去离子水中，混合，得到混合液；将所述混合溶液用Oasis固相萃取柱进行纯化，用甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用1mL上述的样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样品溶液。
Ⅱ、检测样品中磺胺药物的方法包括如下步骤：
1)将待测样品进行前处理，得到待测样品溶液；
2)用所述胶体金试纸对所述待测样品溶液进行检测；
所述胶体金试纸检测结果的判断：
阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性。
阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性。
无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸卡均判为无效。
上述检测样品中磺胺药物的方法中，所述方法为非疾病诊断目的的方法和/或非治疗目的的方法。
上述的试剂盒，或上述的胶体金试纸，或上述的方法中，所述磺胺药物为下述中的至少一种：磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺间甲氧哒嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑。
本发明所提供的蛋白质flop在制备试剂盒和/或胶体金试纸中的应用也属于本发明保护的范围。
上文中，SEQIDNo.1由314个氨基酸残基组成。
上文中，所述蛋白质flop的编码基因为如下1)或2)或3)的核酸分子：
1)其编码序列是SEQIDNo.2的DNA分子或cDNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质flop的DNA分子或cDNA分子；
3)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质flop的DNA分子或cDNA分子。
其中，SEQIDNo.2由945个核苷酸组成，其编码序列是第1-945位。
这里使用的术语“同一性”指核酸序列间的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQIDNo.2所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上文中，所述蛋白质flop的制备方法，包括培养大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)-pET28b-flop，得到所述蛋白质flop。
实验证明，采用利用保藏菌株大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)-pET28b-flop表达得到的蛋白质flop制备的试剂盒和胶体金试纸条能够用于检测磺胺药物。本发明的试剂盒样品中的磺胺二甲基嘧啶的添加回收率在72.2％-97.5％，批内变异系数在6.4％-9.9％，批间变异系数在9.8％-13.0％，测定结果稳定，准确度高；对于多种磺胺药物的最低检测限的范围是0.92-16.44ng/mL，对于磺胺吡啶的最低检测限为0.92ng/mL，具有很高的灵敏度。胶体金试纸条检测磺胺二甲基嘧啶的假阳性率为5-6.67％，假阴性率为0％，具有很高的准确度。本发明的试剂盒和胶体金试纸条具有灵敏度高、准确度高、成本低、操作简单、保质期长的优点；能快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测，在磺胺药物的检测中将发挥重大作用。
保藏说明
菌种名称：大肠埃希氏菌
拉丁名：Escherichiacoli
菌株编号：BL21(DE3)-pET28b-flop
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2014年11月27日
保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.10068
附图说明
图1为磺胺二甲基嘧啶浓度测定的标准品曲线。
图2为不同菌株产蛋白质flop验证的10％SDS-PAGE电泳图。其中，图2中A为未诱导菌体的菌液的10％SDS-PAGE电泳图；图2中B为各菌株的上清液的10％SDS-PAGE电泳图；图2中C为各菌株的纯化后的蛋白质溶液的10％SDS-PAGE电泳图；图2中A和图2中B中1-3号泳道分别代表BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株，M代表蛋白质分子量Marker；图2中C中1-3号泳道分别代表BL21-CK菌株、BL21菌株和BL21-pET28b-flop-7菌株，M代表蛋白质分子量Marker。
图3为不同菌株产蛋白质flop验证的Westernblot图。其中，图3中A为未诱导菌体的菌液的Westernblot图；图3中B为各菌株的上清液的Westernblot图；图3中C为各菌株的纯化后的蛋白质溶液的Westernblot图；图3中A、图3中B和图3中C中1-3号泳道分别代表BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株，M代表蛋白质分子量Marker。
图4为胶体金试纸条结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大肠杆菌BL21(DE3)为德国Merk(Novagen)公司的产品，产品目录号为69387；表达载体pET-28b(+)为德国Merk(Novagen)公司的产品，产品目录号为69865；磺胺二甲基嘧啶为美国Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为S6256；辣根过氧化物酶(HRP)为美国Sigma公司的产品；His-tag单克隆抗体为天根生化科技(北京)有限公司的产品；HRP标记的羊抗鼠抗体为天根生化科技(北京)有限公司的产品；卵清白蛋白为Sigma-Aldrich的产品，产品目录号为41235。
4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸(N1-(4-Carboxyphenyl)sulfanilamide，CS)按照下述文献中的方法制备：DevelopmentofaSingleELISAforDetectionofSulfonamides.HasmukhB.ShethandPeterSporns.J.Agric.FoodChem.1991,39:1696-1700。
下述实施例中的磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺间甲氧哒嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑均为Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号分别为：S6377、S0883、S0758、S6252、S5632、S7385、46902、46762、N13251、S7257、46908、S5632、S9882、02743、S0383、S6256、32996、S7507、S8876、S8751、S7257、S5272、S8626、S9251、31736和46901。磺胺醋酰、磺胺甲噻唑和磺胺溴二甲嘧啶均为中国药品生物制品鉴定所的产品，产品目录号分别为：100413、100096、100412。
实施例1、蛋白质flop的制备
一、蛋白质flop的制备
将表达载体pET-28b(+)的NdeI和XhoI识别位点间的序列替换为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，保持表达载体pET-28b(+)的其它序列不变得到重组表达载体pET-28b(+)-flop。经DNA测序证明，重组表达载体pET-28b(+)-flop中的flop基因为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，编码SEQIDNO.1所示的蛋白质flop。
将重组表达载体pET-28b(+)-flop转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到含有SEQIDNo.2所示的用于编码蛋白质flop的DNA序列的重组菌株，将该菌株命名为重组大肠杆菌BL21-pET28b-flop-7(下文中简称BL21-pET28b-flop-7菌株)。
重组大肠杆菌BL21-pET28b-flop-7于2014年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.10068。重组大肠杆菌BL21-pET28b-flop-7在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心参据的生物材料(株)为BL21(DE3)-pET28b-flop。
将表达载体pET-28b(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到不含有插入片段重组菌株，将该菌株命名为重组大肠杆菌BL21-CK(下文中简称BL21-CK菌株)，该菌株是空载体对照菌株。
从固体筛选培养基上挑取BL21-pET28b-flop-7菌株，将BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和大肠杆菌BL21(DE3)(下文中简称为BL21菌株)分别接种于2mL含卡那霉素(浓度为30μg/mL)的LB液体培养基中，在37℃，转速为250rpm条件下振摇培养8h，分别得到BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株的种子培养液。分别将1mL的BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株的种子培养液接种于200mL含卡那霉素(浓度为30μg/mL)的LB液体培养基中，在37℃，转速为250rpm条件下振摇培养至培养体系的OD600为0.6-0.8，分别取出上述菌株的1mL菌液，未诱导菌体的菌液。分别将OD600为0.6-0.8的BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株的菌液中加入IPTG至各菌株菌液中的IPTG终浓度为1mM，在20℃，转速为200rpm条件下进行摇菌培养，过夜培养后分别收集所有菌株诱导培养后的菌液。将所有菌株诱导培养后的菌液在4℃下10000rpm离心5min，收集菌体，分别得到BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株的菌体。用Tris-HCl(10mMTris，pH7.0)重悬菌体，200W功率冰浴超声(超声10s，间隔10s)破碎菌体至悬液变澄清，在4℃，12000g条件下离心20min，收集上清液，分别得到BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株的上清液。将培养容器内的所有物质记作菌液。
二、蛋白质flop的纯化
利用表达载体pET-28b(+)带有的组氨酸标签(His-tag)标记通过镍离子亲和层析纯化BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株的上清液中的蛋白质flop。先用10倍柱体积的bindingbuffer平衡His·Columns，加入4倍体积步骤一获得的上述菌株的上清液，然后用5倍柱体积的washbuffer洗脱杂蛋白，Washbuffer中的咪唑的浓度为100mM，最后用10倍柱体积的elutionbuffer洗脱目标蛋白，收集洗脱液，透析，分别得到BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株纯化后的蛋白质溶液。
三、蛋白质flop的验证
1、SDS-PAGE电泳验证
分别将BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株的步骤一中的OD600为0.6-0.8的未诱导菌体的菌液，步骤一中的上述菌株的上清液和步骤二中的上述菌株纯化后的蛋白质溶液进行10％SDS-PAGE电泳。结果如图2所示，BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株的步骤一中的OD600为0.6-0.8的未诱导菌体的菌液中均不含有分子量为35KDa的蛋白质条带(图2中A)；BL21-pET28b-flop-7菌株的步骤一中的上清液和步骤二中的纯化后的蛋白质溶液中均含有分子量为35KDa的蛋白质条带(图2中B和C)，BL21-CK菌株和BL21菌株的步骤一中的上清液和步骤二中的纯化后的蛋白质溶液中均不含有分子量为35KDa的蛋白质条带，结果表明在IPTG诱导下，BL21-pET28b-flop-7菌株表达了与目的蛋白质分子量大小一致的蛋白质。
2、Westernblot验证
分别将BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株的步骤一中的OD600为0.6-0.8的未诱导菌体的菌液，步骤一中的上述菌株的上清液和步骤二中的上述菌株纯化后的蛋白质溶液分别进行10％SDS-PAGE电泳；将电泳条带印迹到NC膜上，再依次与His-tag单克隆抗体以及HRP标记的羊抗鼠抗体杂交，进行DAB显色。结果如图3所示，BL21-pET28b-flop-7菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株的步骤一中的OD600为0.6-0.8的未诱导菌体的菌液中均不含有分子量为35KDa的蛋白质条带(图3中A)；BL21-pET28b-flop-7菌株的步骤一中的上清液和步骤二中的纯化后的蛋白质溶液中均含有分子量为35KDa的蛋白质条带(图3中B和C)，BL21-CK菌株和BL21菌株的步骤一中的上清液和步骤二中的纯化后的蛋白质溶液中均不含有分子量为35KDa的蛋白质条带，结果表明在IPTG诱导下，BL21-pET28b-flop-7菌株表达了与目的蛋白质分子量大小一致的蛋白质。
上述结果表明BL21-pET28b-flop-7菌株成功表达了蛋白质flop。
实施例2、检测磺胺药物的试剂盒
本实施例中各个试剂的配置如下：
浓度为0.05M，pH值为7.0的PBS缓冲液的配制：溶液A：17.9gNa2HPO4·12H2O,1L去离子水，得到浓度为0.05M的Na2HPO4溶液；溶液B：8.6gKH2P04·2H2O，1L去离子水，得到浓度为0.05M的KH2P04溶液；取60mL溶液A和40mL溶液B，加入8.5gNaCl，混合均匀。
浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液的配制：8gNaCl、0.2gKCl、3.53gNa2HPO4·12H2O、0.24gKH2PO4，1L去离子水。
浓度为0.1M，pH值为7.2的PBS缓冲液的配制：溶液C：35.8gNa2HPO4·12H2O，1L去离子水，得到浓度为0.1M的Na2HPO4溶液；溶液D：15.6gNaH2P04·2H2O，1L去离子水，得到浓度为0.1M的NaH2P04溶液；将72mL溶液C和28mL溶液D混合后加入8.5gNaCl混合均匀。
浓度为0.02M，pH值为7.2的PBS缓冲液的配制：取浓度为0.1M，pH值为7.2的PBS缓冲液200mL，加入去离子水800mL，混匀。
浓度为0.05M，pH值为9.6的碳酸钠溶液的配制：1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO3，加水定容至1L。
底物显色液：由E液和F液组成；E液为2％(质量百分含量)过氧化脲的水溶液，F液为1％(质量百分含量)四甲基联苯胺的水溶液；将溶液E与溶液F按照1：1(v/v)的比例混合。
终止液：浓度为0.2M的硫酸水溶液。
洗涤液：0.5mL吐温20、5g叠氮化钠，990mL浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液，混合均匀。
样品稀释液：pH值为8.0，由溶剂和溶质组成；溶剂为水，溶质及其浓度为：20mMTris、5mMMgCl2、2％(质量百分含量)脱脂奶粉、1:1500(v/v)的6-羟甲基-7,8二氢蝶呤焦磷酸盐(DHPPP)。
包被缓冲液：pH值为8.0，由溶剂和溶质组成，溶剂为水；溶质及其浓度为：20mMTris、30mMMgCl2。
封闭液：20g脱脂奶粉，用浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液溶解并定容至1L。
冻存液：含5％(质量浓度)BSA的浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液。
酶标物-HRP标记的半抗原(4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸，CS)的配置方法如下：
a.将半抗原4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸溶于1mLDMF中，配置成浓度为0.2mM的4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸溶液；
b.在1mL浓度为0.2mM的4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸溶液中依次加入二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使得DCC的浓度为0.3mM，NHS的浓度为0.6mM，将此混合液在室温下搅拌2h，获得溶液G；
c.取10mg的HRP溶解于2mL浓度为0.05M，pH值为9.6的碳酸钠溶液中，室温搅拌至HRP溶解，获得溶液H；
d.将溶液G和溶液H按照1：2(v/v)的比例混合，室温搅拌4h，装入透析袋，采用浓度为0.05M，pH值为7.0的PBS缓冲液作为透析液进行透析72h，得到CS与HRP的偶联物，即为酶标物。
酶标工作液：采用样品稀释液将酶标物配置成成浓度为1μg/mL的溶液，即为酶标工作液。
一、待测样本中残留磺胺药物的检测
1、酶标板的制备
用包被缓冲液将实施例1制备的蛋白质flop溶液稀释成浓度为1.0μg/mL的溶液，命名为蛋白质flop包被液。用蛋白质flop包被液包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，37℃包被2h，甩干孔中液体，用洗涤液(稀释20倍)洗涤1次，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
2、标准品的制备
将磺胺二甲基嘧啶标准品用冻存液配制成浓度为100ng/mL，每冻干瓶分装1mL，置于冻干机中冻干，密封后4℃保存。
3、标准曲线的制作
将磺胺药物标准品磺胺二甲基嘧啶用样品稀释液溶解，配置成如下浓度梯度的溶液：50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、和1.6ng/mL。
向包被有蛋白质flop的酶标板微孔中加入上述不同浓度的磺胺二甲基嘧啶标准品溶液50μL，再加入酶标物工作液50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，甩干孔中液体，每孔加入350μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板4次，用吸水纸拍干。每孔加入底物显色液，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色10min，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值OD450值。
阴性对照孔为将磺胺二甲基嘧啶溶液替换为等体积的高纯水，其它步骤不变；空白对照孔为将添加的蛋白质flop溶液替换为高纯水，其它步骤不变。
用每个浓度的磺胺二甲基嘧啶溶液的吸光度平均值(B)除以阴性对照孔的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。
以标准品溶液浓度(ng/mL)为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线(图1)。该标准曲线的函数关系式为y＝-18.95Ln(x)+43.087,R2＝0.9918.
4、样品中残留磺胺药物浓度的测定
检测样品为牛奶：牛奶用样品稀释液按1:5(牛奶：样品稀释液)的体积比进行稀释后，4℃10000rpm离心，取50μL上清液用于检测。
检测样品为奶粉：称取1g奶粉，溶于5mL样品稀释液中，混合均匀，取50μL用于检测。
检测样品为尿液：直接取50μL尿液用于检测。
检测样品为鸡肉、鱼、虾及蛋类：称取5g均质样品，加入10mL乙腈水溶液(V乙 腈：V水＝9:1)，上下颠倒震荡10min，5000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，用1mL样品稀释液重悬，取50μL用于检测。
检测样品为蜂蜜：称取5g样品，加入15mL去离子水，于涡旋仪上充分混合1min，过Oasis固相萃取柱后(利用离子交换，将目标物富集和纯化)，先用5mL去离子水洗柱，负压下抽干，再用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用1mL样品稀释液重悬，取50μL用于检测。
将步骤3中的不同浓度的磺胺二甲基嘧啶标准品溶液替换为待测样品溶液，其余操作步骤不变，测定每孔待测样品溶液的吸光度值OD450值。用每个浓度的待测样品溶液的吸光度平均值(B)除以阴性对照孔的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。
将百分吸光度值代入标准曲线的函数关系式y＝-18.95Ln(x)+43.087，即得到样品溶液中磺胺药物的残留量。
二、试剂盒准确度检测
向不含磺胺类药物的样品中添加磺胺二甲基嘧啶的标准品，使磺胺二甲基嘧啶标准品在样品中的终浓度分别为30μg/L(或30μg/kg)、60μg/L(或60μg/kg)。将含有浓度为30μg/L(或30μg/kg)(真实值)或60μg/L(或60μg/kg)(真实值)磺胺二甲基嘧啶的样品，按照一中步骤4的测定方法进行样品中磺胺二甲基嘧啶含量的测定，得到每个样品的测定值。
从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，同一批次的试剂盒每个实验重复5次，分别计算变异系数。
回收率的计算方法：RG＝测定值与真实值的比值×100％；
变异系数的计算方法：CV＝(各平行样品的标准差与各平行样品平均值的比值)×100％；
批内变异系数的计算方法：批内CV＝同一次测定中各平行样品的变异系数的平均值。
批间变异系数的计算方法：批间CV＝同一样品在不同批次测定结果的变异系数的平均值。
结果见表1，所有样品中磺胺二甲基嘧啶的回收率在72.2％-97.5％，批内变异系数在6.4％-9.9％，批间变异系数在9.8％-13.0％。结果表明本发明的检测磺胺药物的试剂盒的检测结果稳定，准确度高。
表1、试剂盒准确度的检测结果
三、试剂盒灵敏度检测
采用样品稀释液分别溶解磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺间甲氧哒嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑等磺胺药物样品，配置成如下浓度梯度的溶液：50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL和1.6ng/mL。实验设3次重复。按照步骤一中的操作方法分别计算蛋白质flop分别对磺胺二甲基嘧啶、磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺间甲氧哒嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑样品的最低检测限(LOD)IC80值。
结果如下：
1)吸光度值与每孔所加入的各标准品浓度成反比，证明所表达纯化得到的蛋白质flop具有识别多种磺胺药物的特性，并呈现线性关系，说明该蛋白质flop可用于多种磺胺药物的检测。
2)各种药物的最低检测限：以各种药物的IC80为最低检测限(LOD)：阴性对照孔(即不添加磺胺药物溶液的孔)的吸光度值为B0，各实验孔的吸光度值为B，当B/B0为80％时所对应的标准品溶液的浓度即为最低检测限(IC80)。结果见表2，该试剂盒的对于磺胺药物的最低检测限的范围是0.92-16.44ng/mL，对于磺胺吡啶的检测限最低为0.92ng/mL，具有很高的灵敏度。
表2、多种磺胺药物的最低检测限
四、试剂盒保存期
试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，根据实施例2中待测样品中残留磺胺药物的检测、试剂盒准确度检测和试剂盒灵敏度检测，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、最低检测限(LOD)IC80值、磺胺药物添加实际测定值均在正常范围之内。结果如表3所示，所有样品中磺胺二甲基嘧啶的添加回收率在70.5％-89.3％，批内变异系数在8.1％-14.6％，批间变异系数在14.3％-16.0％。结果如表4所示，该试剂盒的对于磺胺药物的最低检测限的范围是1.92-17.44ng/mL。
表3、试剂盒准确度的检测结果
表4、多种磺胺药物的最低检测限
考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。结果如表5所示，所有样品中磺胺二甲基嘧啶的添加回收率在70.5％-89.3％，批内变异系数在8.7％-15.0％，批间变异系数在14.3％-18.9％。结果如表6所示，该试剂盒的对于磺胺药物的最低检测限的范围是1.92-17.54ng/mL。
表5、试剂盒准确度的检测结果
表6、多种磺胺药物的最低检测限
考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻8天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存12个月以上。如表7所示所有样品中磺胺二甲基嘧啶的添加回收率在65.1％-86.4％，批内变异系数在12.1％-15.0％，批间变异系数在15.3％-18.8％。结果如表8所示，该试剂盒的对于磺胺药物的最低检测限的范围是1.82-18.54ng/mL。
表7、试剂盒准确度的检测结果
表8、多种磺胺药物的最低检测限
实施例3、检测磺胺药物的胶体金试纸条
本实施例中各个试剂的配置如下：
浓度为0.05M，pH值为9.6的碳酸钠溶液的配制：1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO3，加水定容至1L。
浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液的配制：8gNaCl、0.2gKCl、3.53gNa2HPO4·12H2O、0.24gKH2PO4，1L去离子水。
浓度为0.05M，pH值为7.0的PBS缓冲液的配制：溶液A：17.9gNa2HPO4·12H2O,1L去离子水；溶液B：8.6gKH2P04·2H2O，1L去离子水；取60mL溶液A和40mL溶液B，加入8.5gNaCl，混合均匀。
一、胶体金试纸条的制备
1、包被原的制备
用DCC法将半抗原4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸(CS)偶联于卵清白蛋白(OVA)上。
a.将半抗原4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸溶于1mLDMF中，配置成浓度为0.2mM的4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸溶液；
b.在1mL浓度为0.2mM的4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸溶液中依次加入二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使得DCC的浓度为0.3mM，NHS的浓度为0.6mM，将此混合液在室温下搅拌2h，获得溶液A；
取10mg的OVA溶解于2mL碳酸盐缓冲液中，室温搅拌至HRP溶解。
c.取10mg的OVA溶解于2mL浓度为0.05M，pH值为9.6的碳酸钠溶液中，室温搅拌至OVA溶解，获得溶液B；
d.将溶液A和溶液B按照1：2(v/v)的比例混合混合，室温搅拌4h，装入透析袋，采用浓度为0.05M，pH值为7.0的PBS缓冲液作为透析液进行透析72h，得到CS与OVA的偶联物，即为包被原。
2、胶体金标记蛋白质flop
胶体金溶液的制备：取0.01％(体积百分比)氯金酸水溶液100mL用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1％(质量百分比)柠檬酸三钠水溶液2.5mL，继续搅拌加热20min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积(100mL)，2-8℃保存。
采用浓度为0.1M的K2CO3水溶液调节胶体金溶液的pH值为8.2。将10mLpH值为8.2的胶体金溶液中加入50mL烧杯中，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入浓度为1mg/mL的蛋白质溶剂为实施例2中的包被缓冲液)，逐滴加入3mL5％(质量百分比)的BSA水溶液，持续搅拌10min。将溶液常温低速(1500r/min)离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液。将红色上清溶液在2-8℃，11000rpm条件下离心40min。离心后的溶液分为三层，透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用含1％(质量百分比)BSA的浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液重悬至原体积，获得重悬后的溶液。将重悬后的溶液平衡过夜，在2-8℃，11000rpm条件下离心40min，共离心2次。最后含1％(质量百分比)BSA的浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液(含质量百分比为0.02％的NaN3)将沉淀重悬为原体积的1/40，即得到胶体金标记的蛋白质flop溶液，置于2-8℃保存。
3、喷金：将胶体金标记的蛋白质flop溶液喷到玻璃纤维上，制成胶体金垫。
4、喷膜：在硝酸纤维素膜上的T线和C线位置分别喷上包被原和鼠抗HIS标签单克隆抗体，得到反应膜；
5、组装：将样品垫、胶体金垫、反应膜和吸水纸按常规方法进行组装，然后切条，将试纸卡装入塑料制卡中，形成试纸卡，样品孔位于胶体金试纸条顶端，所述样品垫的始端为胶体金试纸条顶端。(图4)。
二、样品中残留磺胺药物的检测
1、样品前处理及检测
牛奶样品：无需前处理，直接检测。
取出试纸卡，开封后平放于桌面，吸取待测液逐滴加入4滴于样品孔中；42℃反应10min进行结果判断，20min后的结果无效。
2、结果判断
胶体金试纸的检测原理：当样品中含有过多的磺胺药物时，胶体金标记的蛋白质flop完全被样品中的磺胺药物结合，所以检测线(T线)上的包被原不能与胶体金标记的蛋白质flop结合，因此检测线(T线)上不显色，质控线(C线)上的鼠抗HIS标签单克隆抗体能够与胶体金标记的蛋白质flop结合显色，检测结果为阳性；
当样品中不含有磺胺药物时，胶体金标记的蛋白质flop可以与检测线(T线)上的包被原结合，检测线(T线)上显色，质控线(C线)上的鼠抗HIS标签单克隆抗体能够与胶体金标记的蛋白质flop结合显色，检测结果为阴性。
阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性。
阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性。
无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸卡均判为无效。
三、胶体金试纸条的准确度检测
1、假阳性率和假阴性率
原奶样品直接采自农场奶牛。用LC-MS/MS检测奶样中磺胺二甲基嘧啶含量，LC-MS/MS按照GB/T22975-2008进行。
取经LC-MS/MS确证的阴性奶样(磺胺二甲基嘧啶含量小于100ng/mL)100份(编号为1#-100#)，取经LC-MS/MS确证的阳性奶样(磺胺二甲基嘧啶含量大于100ng/ml)100份(编号为1-100)。将样品分别用胶体金试纸条进行检测，计算假阳性率和假阴性率。假阳性率＝(假阳性样品数/阴性样品总数)×100％；假阴性率＝(假阴性样品数/阳性样品总数)×100％
结果：在100份阴性奶样测定中，胶体金试纸条检测出阳性样品5份(编号分别为13#、32#、58#、66#、67#)，假阳性率为5％。在100份阳性奶样测定中，胶体金试纸条检测出阴性样品0份，假阴性率为0％。
按照相同方法检测超市购买的牛奶。用LC-MS/MS检测奶样中磺胺二甲基嘧啶含量，LC-MS/MS按照GB/T22975-2008进行。
取经LC-MS/MS确证的阴性成品奶样(磺胺二甲基嘧啶含量小于4ng/mL)15份(编号为1#-15#)，取经LC-MS/MS确证的阳性奶样(磺胺二甲基嘧啶含量大于4ng/mL)10份(编号为1-10)。将样品分别用胶体金试纸条进行检测，计算假阳性率和假阴性率。
结果：在15份阴性成品奶样测定中，胶体金试纸条检测出阳性样品1份(编号为8#)，假阳性率为6.67％。在10份阳性奶样测定中，试纸卡检测出阴性样品0份，假阴性率为0％。
结果表明，胶体金试纸条检测磺胺二甲基嘧啶的假阳性率为5-6.67％，假阴性率为0％，具有很高的准确度。
四、胶体金试纸条的保存期
稳定性试验结果表明，本试纸卡在2-8℃或室温条件下阴凉干燥处可保存1年。

Claims (8)

1.一种检测磺胺药物的试剂盒，包括包被原和酶标记物；所述包被原为蛋白质flop；所述酶标记物是将标记酶和4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸偶联在一起得到的偶联物；所述蛋白质flop为如下a)或b)的蛋白质：
a)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将SEQIDNo.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下中的至少一种：磺胺二甲基嘧啶标准溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、样品稀释液、包被缓冲液和封闭液。
3.权利要求1或2所述的试剂盒的制备方法，包括如下(1)或(2)的步骤：
(1)将所述包被原和所述酶标记物分别单独包装的步骤；
(2)将所述包被原、所述酶标记物、所述磺胺二甲基嘧啶标准溶液、所述底物显色液、所述终止液、所述洗涤液、所述样品稀释液、所述包被缓冲液和所述封闭液分别单独包装的步骤。
4.一种检测磺胺药物的胶体金试纸，包括相互连接的样品垫、胶体金垫、反应膜和吸收垫；所述反应膜位于所述胶体金垫和所述吸收垫之间；所述胶体金垫包被有胶体金标记的带有HIS标签的权利要求1所述的蛋白质flop；所述反应膜上含有检测线和质检线，所述检测线包被有4-(4-氨基-苯磺酰胺基)苯甲酸和载体蛋白，所述质检线包被有抗所述HIS标签的单克隆抗体；所述蛋白质flop为如下a)或b)的蛋白质：
a)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将SEQIDNo.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由a)衍生的蛋白质。
5.权利要求4所述胶体金试纸的制备方法，包括如下(1)或(2)的步骤：
(1)分别制备权利要求4中所述的检测磺胺药物的胶体金试纸中所述样品垫、所述胶体金垫和所述反应膜；
(2)将步骤(1)得到的所述样品垫、所述胶体金垫、所述反应膜和所述吸收垫相互连接，得到所述反应膜位于所述胶体金垫和所述吸收垫之间的检测磺胺药物的胶体金试纸。
6.一种检测样品中磺胺药物的方法，为如下Ⅰ或Ⅱ所示的方法：
Ⅰ、检测样品中磺胺药物的方法包括如下步骤：
1)将待测样品进行前处理，得到待测样品溶液；
2)用权利要求1或2所述的试剂盒对所述待测样品溶液进行检测；
Ⅱ、检测样品中磺胺药物的方法包括如下步骤：
1)将待测样品进行前处理，得到待测样品溶液；
2)用权利要求4所述的胶体金试纸对所述待测样品溶液进行检测。
7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，或权利要求4所述的胶体金试纸，或权利要求6所述的方法，其特征在于：所述磺胺药物为下述中的至少一种：磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺间甲氧哒嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑。
8.权利要求1所述蛋白质flop在制备权利要求1或2所述的试剂盒和/或权利要求4所述的胶体金试纸中的应用。
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