CN107462715B - 一种克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条和试剂盒及其应用 - Google Patents

一种克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条和试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条和试剂盒及其应用，所述试纸条包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘附至底板上，所述硝酸纤维素膜上按样品流动方向从前到后依次具有结合有克百威半抗原‑载体蛋白偶联物的第一检测线、结合有异丙威半抗原‑载体蛋白偶联物的第二检测线以及结合有羊抗鼠多克隆抗体的质控线，所述试剂盒包括该试纸条和装有克百威荧光微球标记抗体和异丙威荧光微球标记抗体的反应杯。本发明的克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒可以同时实现克百威和异丙威残留的检测，检测准确性高，具有高灵敏度、高特异性的特点，能够实现简单快速检测，操作简便，适合于大规模筛选。

Description

一种克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条和试剂盒及其 应用
技术领域
本发明属于农药残留检测技术领域，涉及一种克百克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条和试剂盒及其应用。
背景技术
氨基甲酸酯类农药是一种高效、广谱型杀虫剂，其杀虫作用机制为抑制昆虫神经传导的重要物质乙酰胆碱酯酶的活性。氨基甲酸酯类农药具有杀虫效果显著、分解快、残留期短、代谢迅速的特点。除此之外，还有显著刺激作物生长的作用。由于氨基甲酸酯类农药被大量不科学地使用，导致人畜中毒现象时有发生，长时间食用被污染的食品或是暴露在其环境中会对人的身体造成很大的危害。因此许多国家和地区对这种农药在食品中的残留量都制定了严格的限量标准，这就使得氨基甲酸酯类农药的分析检测倍受关注。
目前已有不少针对氨基甲酸酯类农药残留分析的方法如色谱分析法、生物传感器法、生物检测法、化学计量分析法等，这些方法由于各种原因不适合大规模筛选，而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多优势。
因此，在本领域，寻找一种对该氨基甲酸酯农药进行快速简便检测的方法很有必要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条和试剂盒及其应用。本发明的试纸条和试剂盒基于免疫检测，可以同时检测样品中克百威和异丙威残留，具有高灵敏度、高特异性的特点，能够实现简单快速检测，操作简便，适合于大规模筛选。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，所述试纸条包括底板(7)、样品垫(1)、硝酸纤维素膜(2)和吸水垫(3)，所述样品垫(1)、硝酸纤维素膜(2)和吸水垫(3)依次粘附至底板(7)上，所述硝酸纤维素膜(2)上按样品流动方向从前到后依次具有结合有克百威半抗原-载体蛋白偶联物的第一检测线(4)、结合有异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的第二检测线(5)以及结合有羊抗鼠多克隆抗体的质控线(6)。
本发明利用这样的免疫荧光试纸条可以同时实现克百威和异丙威的免疫检测，检测结果准确，操作简单。
优选地，所述克百威半抗原为具有如下式I和/或式II所示结构的化合物：
进一步优选地，所述克百威半抗原为具有式II所示结构的化合物。
在本发明中，所述克百威半抗原可以利用本领域已知的制备方法制备得到，或者也可以购买得到。
在本发明中，优选地，选择如下合成路线来合成式I所示的克百威半抗原：
选择如下合成路线来合成式II所示的克百威半抗原：
优选地，所述异丙威半抗原为具有如下式A和/或式B所示结构的化合物：
进一步优选地，所述异丙威半抗原为具有式B所示结构的化合物。
在本发明中，所述异丙威半抗原可以利用本领域已知的制备方法制备得到，或者也可以购买得到。
在本发明中，优选地，选择如下合成路线来合成式A所示的异丙威半抗原：
选择如下合成路线来合成式B所示的异丙威半抗原：
即在本发明中，如上所述式I所示克百威(可表示为KBW-1)和式A所示异丙威(可表示为YBW-1)的制备方法可以总结为：将呋喃酚(或2-异丙基苯酚)溶于二氯甲烷和吡啶的混合液中，冰浴下滴加对硝基苯甲酰氯，搅拌反应数小时后得到中间体；将中间体溶于四氢呋喃和水的混合液中，冰浴下滴加4-氨基丁酸的氢氧化钠溶液，反应数小时后进行后处理，柱层析纯化到KBW-1、YBW-1。
如上所述式II所示克百威(可表示为KBW-2)和式B所示异丙威(可表示为YBW-2)的制备方法可以总结为：将呋喃酚(或2-异丙基苯酚)溶于DMF中，80℃搅拌反应数分钟后滴加4-溴丁酸乙酯，反应数小时后得到中间体；将中间体溶于氢氧化钠水溶液中，80℃反应数小时后进行后酸化处理，柱层析纯化到KBW-2、YBW-2。
优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白质(BSA)、人血清蛋白质、血蓝蛋白或卵清蛋白(OVA)，优选为牛血清白蛋白。
优选地，所述克百威半抗原-载体蛋白偶联物中克百威半抗原与载体蛋白的结合摩尔比为(15-25):1，例如15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1或25:1，优选(20-23):1，在本发明中，如果克百威半抗原与载体蛋白的结合摩尔比过小则抗体的滴度较低，结合摩尔比过大则可能导致抗体的灵敏度比较低。
优选地，所述第一检测线(4)上结合的克百威半抗原-载体蛋白偶联物的量为0.01-1μg/cm，例如0.01μg/cm、0.03μg/cm、0.05μg/cm、0.08μg/cm、0.1μg/cm、0.3μg/cm、0.5μg/cm、0.8μg/cm或1μg/cm，优选0.8-1μg/cm。所述μg/cm表示每厘米第一检测线所结合的克百威半抗原-载体蛋白偶联物的质量。
优选地，所述第二检测线(5)上结合的异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的量为0.5-2μg/cm，例如0.5μg/cm、0.8μg/cm、1.0μg/cm、1.2μg/cm、1.4μg/cm、1.6μg/cm、1.8μg/cm或2μg/cm，优选0.8-1.2μg/cm。所述μg/cm表示每厘米第一检测线所结合的异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的质量。
优选地，所述质控线(6)上结合的羊抗鼠多克隆抗体的量为1-3μg/cm，例如1μg/cm、1.2μg/cm、1.5μg/cm、1.8μg/cm、2μg/cm、2.3μg/cm、2.5μg/cm、2.8μg/cm或3μg/cm，优选1.2-2.5μg/cm。所述μg/cm表示每厘米质控线所结合的羊抗鼠多克隆抗体的质量。
在本发明中，所述克百威半抗原-载体蛋白偶联物和异丙威半抗原-载体蛋白偶联物可由本领域已知的制备方法制备得到。例如示例性地，所述克百威半抗原-载体蛋白偶联物(KBW-1或KBW-2与载体蛋白的偶联物)以及异丙威半抗原-载体蛋白偶联物(YBW-1或YBW-2与载体蛋白的偶联物)由如下方法制备：
(1)KBW-1或YBW-1与载体蛋白的偶联物制备方法：将KBW-1(或者YBW-1)溶于DMF中，搅拌加入EDC和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上,取上清夜为A液；称取载体蛋白质溶于PBS(PH8.0)中，搅拌溶解制备B液。4℃磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h，4℃下用生理盐水透析3天，然后将透析液于4000转/min离心5min，取上清液液于-20℃保存。
(2)KBW-2或YBW-2与载体蛋白的偶联物制备方法：将KBW-2(或者YBW-2)溶解于DMF中，然后在该溶液中加入等摩尔的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下搅拌过夜反应后离心，取上清液缓慢加入到载体蛋白的碳酸盐(pH9.6)的碳酸盐缓冲溶液中，然后搅拌反应8h，待反应完成后，再将反应液装入透析袋，用0.01mol/LPBS(pH 7.4)缓冲溶液透析3天，每天更换3次透析液，然后将透析液于4000转/min离心5min，取上清液液于-20℃保存。
优选地，所述第一检测线(4)与第二检测线(5)之间的距离为3-8mm，优选5mm。在本发明中，如果两条检测线距离过近，则反应所发出的荧光对仪器的识别会产生一定干扰；如果两条检测线距离太远，则层析所需时间需要加长，待测液所需量也会增加。
优选地，所述第二检测线(5)与质控线(6)之间的距离为3-8mm，优选5mm。同样如果第二检测线与质控线距离过近，则反应所发出的荧光对仪器的识别会产生一定干扰；如果距离太远，则层析所需时间需要加长，待测液所需量也会增加。
优选地，所述样品垫为聚对苯二甲酸乙二酯纤维样品垫、聚对苯二甲酸丁二酯纤维样品垫、聚对苯二甲酸丙二酯纤维样品垫、聚对苯二甲酸-1,4-环己二甲酯纤维样品垫或聚-2,6-萘二酸乙二酯纤维样品垫中的任意一种。
优选地，所述吸水垫为脱脂棉吸水垫、硅胶吸水垫或海绵吸水垫中的任意一种。
优选地，所述底板为PVC板、PP板、PE板或PU板中的任意一种。
优选地，所述克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条的宽度为3-8mm，例如3mm、3.5mm、3.8mm、4mm、4.4mm、4.8mm、5mm、5.5mm、5.8mm、6mm、6.3mm、6.5mm、6.8mm、7mm、7.3mm、7.5mm、7.8mm或8mm，优选3-5mm。试纸条宽度的设定主要考虑所需待测液用量多少，越宽意味着吸水垫越宽，所需待测液越多，反之越少，过宽对生产成本不利，过窄对信号的观察识别不利，故一般选择3-8mm，更加优选3-5mm。
另一方面，本发明提供了一种克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的试纸条以及装有克百威荧光微球标记抗体和异丙威荧光微球标记抗体的反应杯。
在本发明中，所述试纸条搭配所述反应杯使用，使用时将待测液加入反应杯中混匀，反应几分钟后，插入试纸条，反应杯中的荧光微球标记抗体在层析作用下爬升与试纸条上的克百威、异丙威抗原结合，在荧光读数仪下读数来判定样品的阴、阳性。
另一方面，本发明提供了所述克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒在同时检测样品中克百威和异丙威的残存中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒可以同时实现克百威和异丙威残留的检测，检测准确性高，并且该试剂盒中试纸条和反应杯的性能稳定，采用反应杯及试纸条模式可以有效的提高灵敏度，以及提高对外界样本的抗干扰能力，使得检测具有高灵敏度、高特异性的特点，能够实现简单快速检测，操作简便，适合于大规模筛选。
附图说明
图1为本发明克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条的结构示意图，其中1为样品垫，2为硝酸纤维素膜，3为吸水垫，4为第一检测线，5为第二检测线，6为质控线，7为底板。
图2为本发明克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒的结构和组成示意图，其中左边为试纸条，右侧为反应杯，其中试纸条上T1代表第一检测线，T2代表第二检测线，C为质控线。
图3为本发明利用克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒进行样品检测时的结果判读示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，制备与克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条的制备相关的试剂，方法如下：
(1)克百威半抗原KBW-1/KBW-2的制备与鉴定
0.8g呋喃酚溶于15mL二氯甲烷后，加入0.58mL(10mmol)吡啶形成混合溶液，向其中滴加1g对硝基苯氯甲酸酯溶液(溶于10mL二氯甲烷)，整个体系保持4℃以下冰盐浴。用薄板层析(TLC)跟踪反应，确定3h结束反应。反应液先用3％的盐酸于分液漏斗中振荡洗涤，过柱纯化，得到淡黄色的晶体，
取0.4g(1.2mmol)上步制得的产物溶于12mL四氢呋喃中，0.16g(2.4mmol)4-氨基丁酸溶于pH为8.2的12mL碳酸氢钠溶液，把四氢呋喃溶液(溶有上步产物)逐滴加入碳酸氢钠溶液中，滴加过程保持冰浴，TLC跟踪反应，确定室温反应4.5h，反应结束后，在冰浴下加4mol/L的HCl调节反应液的pH为4，用乙酸乙酯提取3次，提取液加无水Na2SO4脱水，浓缩至约5mL，过柱纯化，收集目标组分，减压蒸馏除去溶剂得到白色晶体KBW-1。
称取呋喃酚600mg，加入15ml除水的DMF，冰浴下加入200mg的NaH，搅拌10min后向其中缓慢的滴加1.0g 4-溴丁酸乙酯，过夜反应，蒸干溶剂，加入20ml 10％的NaOH溶液回流反应4h，之后用6N盐酸将溶液调成酸性，用乙酸乙酯萃取，有机相蒸干过柱纯化，得到白色固体KBW-2。
(2)异丙威半抗原YBW-1/YBW-2的制备与鉴定
0.8g2-异丙基苯酚溶于15mL二氯甲烷后，加入0.58mL(10mmol)吡啶形成混合溶液，向其中滴加1g对硝基苯氯甲酸酯溶液(溶于10mL二氯甲烷)，整个体系保持4℃以下冰盐浴。用薄板层析(TLC)跟踪反应，确定3h结束反应。反应液先用3％的盐酸于分液漏斗中振荡洗涤，过柱纯化，得到淡黄色的晶体，
取0.4g(1.2mmol)上步制得的产物溶于12mL四氢呋喃中，0.16g(2.4mmol)4-氨基丁酸溶于pH为8.2的12mL碳酸氢钠溶液，把四氢呋喃溶液(溶有上步产物)逐滴加入碳酸氢钠溶液中，滴加过程保持冰浴，TLC跟踪反应，确定室温反应4.5h，反应结束后，在冰浴下加4mol/L的HCl调节反应液的pH为4，用乙酸乙酯提取3次，提取液加无水Na2SO4脱水，浓缩至约5mL，过柱纯化，收集目标组分，减压蒸馏除去溶剂得到白色晶体YBW-1.
称取2-异丙基苯酚600mg，加入15ml除水的DMF，冰浴下加入200mg的NaH，搅拌10min后向其中缓慢的滴加1.0g 4-溴丁酸乙酯，过夜反应，蒸干溶剂，加入20ml 10％的NaOH溶液回流反应4h，之后用6N盐酸将溶液调成酸性，用乙酸乙酯萃取，有机相蒸干过柱纯化，得到白色固体YBW-2。
(3)克百威半抗原-载体蛋白偶联物和异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的制备
KBW-1和KBW-2与载体蛋白的偶联物制备
将KBW-1溶于DMF中，搅拌加入EDC和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上,取上清夜为A液；称取载体蛋白质溶于PBS(pH8.0)中，搅拌溶解制备B液。4℃磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h，4℃下用生理盐水透析3d，然后将透析液于4000转/min离心5min，取上清液液于-20℃保存。
将KBW-2溶解于DMF中，然后在该溶液中加入等摩尔的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下搅拌过夜反应后离心，取上清液缓慢加入到载体蛋白的碳酸盐(pH9.6)的碳酸盐缓冲溶液中，然后搅拌反应8h，待反应完成后，再将反应液装入透析袋，用0.01mol/LPBS(pH 7.4)缓冲溶液透析3天，每天更换3次透析液，然后将透析液于4000转/min离心5min，取上清液液于-20℃保存。
YBW-1和YBW-2与载体蛋白的偶联物制备
将YBW-1溶于DMF中，搅拌加入EDC和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上,取上清夜为A液；称取载体蛋白质溶于PBS(pH8.0)中，搅拌溶解制备B液。4℃磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h，4℃下用生理盐水透析3d，然后将透析液于4000转/min离心5min，取上清液液于-20℃保存。
将YBW-2溶解于DMF中，然后在该溶液中加入等摩尔的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下搅拌过夜反应后离心，取上清液缓慢加入到载体蛋白的碳酸盐(pH9.6)的碳酸盐缓冲溶液中，然后搅拌反应8h，待反应完成后，再将反应液装入透析袋，用0.01mol/LPBS(pH 7.4)缓冲溶液透析3天，每天更换3次透析液，然后将透析液于4000转/min离心5min，取上清液液于-20℃保存。
(4)克百威半抗原-载体蛋白偶联物和异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定
取KBW-1、载体蛋白BSA和KBW-1-BSA(克百威半抗原-载体蛋白偶联物)分别进行紫外(200-400nm)扫描鉴定，并通过比较三者的最高吸光值发现KBW-1-BSA的吸光值与KBW-1半抗原和BSA明显不同，说明半抗原已经与BSA成功偶联制得KBW-1-BSA。经计算，KBW-1半抗原与BSA的结合摩尔比为20:1。
取YBW-1、载体蛋白BSA和YBW-1-BSA(异百威半抗原-载体蛋白偶联物)分别进行紫外(200-400nm)扫描鉴定，并通过比较三者的最高吸光值发现YBW-1-BSA的吸光值与YBW-1半抗原和BSA明显不同，说明半抗原已经与BSA成功偶联制得YBW-1-BSA。经计算，YBW-1半抗原与BSA的结合摩尔比为19:1。
取KBW-2、载体蛋白OVA和KBW-2-OVA分别进行紫外(200-400nm)扫描鉴定，并通过比较三者的最高吸光值发现KBW-2-OVA的吸光值与KBW-2半抗原和OVA明显不同，说明半抗原已经与OVA成功偶联制得KBW-2-OVA。经计算，KBW-2半抗原与OVA的结合摩尔比为21:1。
取YBW-2、载体蛋白OVA和YBW-2-OVA分别进行紫外(200-400nm)扫描鉴定，并通过比较三者的最高吸光值发现YBW-2-OVA的吸光值与YBW-2半抗原和OVA明显不同，说明半抗原已经与OVA成功偶联制得YBW-2-OVA。经计算，YBW-2半抗原与OVA的结合摩尔比为23:1。
(5)克百威、异丙威单克隆抗体的制备与纯化，其步骤是：
免疫方案：取6～8周龄、体重18～20g BALB/C雌性小鼠，将制备的免疫原KBW-1-BSA(或YBW-1-BSA)与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射，剂量为每只50μg，以后每隔3周，取抗原(与一免等剂量)和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后皮下和腹腔注射加强免疫，加强免疫共4次，融合前3d加倍剂量强化免疫一次。
细胞的融合及培养：按免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(5～10)∶1的比例混合细胞，在50％PEG下融合，洗涤、沉淀后，用HAT培养基悬浮，接种于96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。培养3～5d后，用HAT培养基再换液一次，第10d换成HT培养基培养。
杂交瘤细胞的筛选与克隆：待融合细胞生长到覆盖培养孔10％～30％孔底面积时，采用梯度稀释的方法进行筛选，取上清液用间接ELISA方法筛选抗体阳性孔，筛选时包被抗原为KBW-2-OVA(或YBW-2-OVA)交联物，并以OVA、BSA作阴性对照。选择阳性反应的杂交瘤细胞，阳性孔进一步用竞争ELISA鉴定筛选，有限稀释法连续克隆3～4次，最后一次克隆后检测为阳性的孔所得细胞株即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
腹水的制备与纯化：将BALB/c小鼠腹腔注射降植烷0.3ml/只，7～10d后同法注射单克隆细胞l×106～2×106个(0.4ml/只)，待小鼠腹腔明显胀大后抽取腹水，离心除去油脂沉淀后，即得小鼠腹水McAb。腹水采用辛酸-硫酸铵法纯化，用紫外分光光度计分别测定纯化单克隆抗体的紫外280、260nm的光密度，用Lowry-kalokar公式计算蛋白质的浓度，其余的纯化单抗-70℃保存备用。
实施例2
在本实施例中由实施例1制备的试剂和原料制备克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒，其包括试纸条和反应杯，所述试纸条如图1所示，包括底板(7)、样品垫(1)、硝酸纤维素膜(2)和吸水垫(3)，所述样品垫(1)、硝酸纤维素膜(2)和吸水垫(3)依次粘附至底板(7)上，所述硝酸纤维素膜(2)上按样品流动方向从前到后依次具有结合有克百威半抗原-载体蛋白偶联物的第一检测线(4)(即T1线)、结合有异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的第二检测线(5)(即T2线)以及结合有羊抗鼠多克隆抗体的质控线(6)(即本发明中所述质控线C线)；所述反应杯装有克百威荧光微球标记抗体和异丙威荧光微球标记抗体。
其制备方法具体包括如下步骤：
(1)将0.457g CdCl2·2.5H2O溶于160mL水中，加入到500mL三颈瓶中，加入TGA0.334mL。调节pH至11.2。高速磁力搅拌下，通高纯N2 30min，迅速将新制备NaHTe水溶液加入反应(各物质的摩尔比为：Cd2+:TGA:NaHTe＝1:2.4:0.5)。将此反应液加热至沸腾，开始计时取样，制得CdTe。
随后，用反相微乳液技术制备CdTe@SiO2，具体方法：分别取7.5mL环己烷、1.77mLTriton X-100、1.8mL正己醇于烧瓶中，混合均匀；加入480μL CdTe，搅拌5min，随后加入100.0μL TEOS,搅拌混匀，加入60.0μL氨水(25wt.-％)；锡纸包裹，反应24h；加入等体积的丙酮，涡旋，打破微乳液体系；3000g离心10min，得到SiO2包裹的CdTe纳米微球；用乙醇洗涤3次，洗涤过程中，涡旋、超声破碎沉淀。在空气中干燥产品，一般情况下，可以得到约20mg产品。
取适量荧光微球加入氨基硅烷乙醇溶液中，加热回流12～24h，用乙醇洗涤加热回流后产物。用戊二酸酐的二甲基甲酰胺(DMF)饱和溶液重悬纳米颗粒，室温搅拌2～4h。再次用乙醇洗涤纳米颗粒，用双蒸水重悬纳米颗粒，制成1.0mg/mL悬浮液备用。
(2)克百威和异丙威微球标记抗体及其反应杯的制备
将上述步骤(1)所得的荧光微球用0.1mol/L的碳酸钾调节pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；取各pH的荧光微球溶液1mL于一系列PE离心管中混匀，在以上各pH条件下用荧光微球分别标记克百威和异丙威抗体，蛋白标记量分别为1μg、2μg、4μg、6μg、8μg、10μg、15μg振荡均匀后，静置10min，离心去除沉淀测各个离心管的OD520nm，以OD520nm值最大时的pH(8.5)为最佳pH值。在最佳pH值下，荧光微球溶液中单克隆抗体添加量分别为4μg、6μg对应的吸收峰最大。然后，进行放大标记。取50mL荧光微球溶液，在合适的pH缓冲溶液里，分别加入合适体积的克百威和异丙威单克隆抗体，混匀后，静置30min，然后加入1％BSA溶液，封闭4h，离心，复溶后得到荧光标记克百威和异丙威单克隆抗体，将其分装至反应杯里，冻干干燥保存备用。
(3)检测线和控制线制备
(a)包被液配置：0.02mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液、1.0％(W/V)海藻糖、0.3％(W/V)吐温-20，搅拌均匀后经0.22μm滤膜过滤。
(b)将包被抗原KBW-2-OVA、YBW-2-OVA用上述包被液分别稀释后，分别喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线T1、T2，抗原的浓度均为1.0mg/mL，喷量为0.8μL/cm；涂于硝酸纤维素膜上羊抗鼠浓度为1.5mg/mL，喷量为0.8μL/cm；线之间的间距为5mm，于37℃烘箱中烘干过夜备用。
(4)试纸条的组装：将样品垫、喷有检测线T1、T2以及羊抗鼠的硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序依次黏贴在硬质聚氯乙烯板上，然后切割成宽度为4.4mm的试纸条。
综上制备得到如图2所示的克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒。
实施例3
在本实施例中，应用实施例2制备得到的克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒进行样品检测，其步骤是：
(1)样品的预处理：取2g已经切碎的某根茎类中药材样品加入到25mL离心管中，分别加入浓度均为10.0mg/L克百威、异丙威各100μL，然后加入8mL含有10％乙醇的pH值为7.2的PBS缓冲液的提取液，充分震荡混匀后即为待测液；阴性对照加100μL7.2的PBS缓冲液的提取液，其它操作不变。
(2)检测：吸取上述待测液200μL(9-10滴)于反应杯中，并上下抽吸10次混匀。20-40℃开始第一步反应，并计时3分钟；将测试条插入到反应杯中；20-40℃下开始第二步反应，并计时7分钟；从反应杯中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的吸水海绵，并进行结果判读。
(3)结果判读如表1所示。
表1
其结果判读形象地在图3中示出，当结合有百威半抗原-载体依次具有蛋白偶联物的第一检测线颜色≥质控线C线，而结合有异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的第二检测不显色时，为异丙威阳性；当结合有百威半抗原-载体依次具有蛋白偶联物的第一检测线不显色，而而结合有异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的第二检测颜色≥质控线C线时，为克百威阳性，当第一和第二检测线均不显色时为双阳性，当第一和第二检测线颜色均≥质控线C线时为双阴性。
与验证方法结果对比，如表2所示。
表2
实施例4
在本实施例中，利用应用实施例2制备得到的克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒进行样品检测，其步骤是：
(1)样品的预处理：取3g已经剪碎的果实类中药材样品加入到50mL离心管中，分别加入浓度均为10.0mg/L克百威、异丙威各100μL，然后加入12mL含有10％乙醇的pH值为7.2的PBS缓冲液的提取液，充分震荡混匀后即为待测液；阴性对照加100μL7.2的PBS缓冲液的提取液，其它操作不变。
(2)检测：吸取上述待测液200μL(9-10滴)于反应杯中，并上下抽吸5-10次混匀。20-40℃开始第一步反应，并计时3分钟；将测试条插入到反应杯中中；20-40℃下开始第二步反应，并计时7分钟；从反应杯中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的吸水海绵，并进行结果判读。
(3)结果判读如表3所示。
表3
与验证方法结果对比，如表4所示。
表4
实施例5
在本实施例中，应用实施例2制备得到的克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒进行样品检测，其步骤是：
(1)样品的预处理：取1g已经剪碎的叶类蔬菜样品加入到15mL离心管中，分别加入浓度均为10.0mg/L克百威、异丙威各100μL，然后加入4mL含有10％乙醇的pH值为7.2的PBS缓冲液的提取液，充分震荡混匀后即为待测液；阴性对照加100μL7.2的PBS缓冲液的提取液，其它操作不变。
(2)检测：吸取上述待测液200μL(9-10滴)于反应杯中，并上下抽吸5-10次混匀。20-40℃开始第一步反应，并计时3分钟；将测试条插入到反应杯中；20-40℃下开始第二步反应，并计时7分钟；从反应杯中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的吸水海绵，并进行结果判读。
(3)结果判读如表5所示。
表5
与验证方法结果对比，如表6所示。
表6
实施例6
在本实施例中，对所述克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒进行了特异性实验和稳定性试验，以验证其应用效果的准确性，方法如下：
(1)特异性实验：分别将涕灭威、涕灭威亚砜、灭多威、西维因、叶蝉散、扑杀威、甲萘威、三羟基克百威等配制成500μg/kg，吸取200μL于反应杯中，并上下抽吸5-10次混匀。20-40℃开始第一步反应，并计时3分钟；将测试条插入到反应杯中中；20-40℃下开始第二步反应，并计时7分钟；从反应杯中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的吸水海绵，结果显示T1和T2均可明显显示，证明这些药物均不会与抗体发生交叉反应。
(2)稳定性试验：将本发明研制的3批试纸条及其反应杯分别放置在37℃恒温培养箱、常温、4℃，每隔1个月取出同时测定10份阳性样本及10份阴性样本，结果显示：37℃作用6个月对本发明的试纸条无破坏作用，证明该试纸条在高温下较为稳定；本试纸条在常温放置12个月仍较为稳定。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条和试剂盒及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (21)

1.一种克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板(7)、样品垫(1)、硝酸纤维素膜(2)和吸水垫(3)，所述样品垫(1)、硝酸纤维素膜(2)和吸水垫(3)依次粘附至底板(7)上，所述硝酸纤维素膜(2)上按样品流动方向从前到后依次具有结合有克百威半抗原-载体蛋白偶联物的第一检测线(4)、结合有异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的第二检测线(5)以及结合有羊抗鼠多克隆抗体的质控线(6)；所述第一检测线(4)与第二检测线(5)之间的距离为3-8mm，所述第二检测线(5)与质控线(6)之间的距离为3-8mm；
所述克百威半抗原为具有如下式II所示结构的化合物：
所述异丙威半抗原为具有如下式B所示结构的化合物：
2.根据权利要求1所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清蛋白质、血蓝蛋白或卵清蛋白。
3.根据权利要求2所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述克百威半抗原-载体蛋白偶联物中克百威半抗原与载体蛋白的结合摩尔比为(15-25):1。
5.根据权利要求4所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述克百威半抗原-载体蛋白偶联物中克百威半抗原与载体蛋白的结合摩尔比为(20-23):1。
6.根据权利要求1所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述第一检测线(4)上结合的克百威半抗原-载体蛋白偶联物的量为0.01-1μg/cm。
7.根据权利要求6所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述第一检测线(4)上结合的克百威半抗原-载体蛋白偶联物的量为0.8-1μg/cm。
8.根据权利要求1所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述第二检测线(5)上结合的异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的量为0.5-2μg/cm。
9.根据权利要求8所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述第二检测线(5)上结合的异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的量为0.8-1.2μg/cm。
10.根据权利要求1所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述质控线(6)上结合的羊抗鼠多克隆抗体的量为1-3μg/cm。
11.根据权利要求10所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述质控线(6)上结合的羊抗鼠多克隆抗体的量为1.2-2.5μg/cm。
12.根据权利要求1所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述第一检测线(4)与第二检测线(5)之间的距离为5mm。
13.根据权利要求1所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述第二检测线(5)与质控线(6)之间的距离为5mm。
14.根据权利要求1所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述样品垫为聚对苯二甲酸乙二酯纤维样品垫、聚对苯二甲酸丁二酯纤维样品垫、聚对苯二甲酸丙二酯纤维样品垫、聚对苯二甲酸-1,4-环己二甲酯纤维样品垫或聚-2,6-萘二酸乙二酯纤维样品垫中的任意一种。
15.根据权利要求1所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述吸水垫为脱脂棉吸水垫、硅胶吸水垫或海绵吸水垫中的任意一种。
16.根据权利要求1所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述底板为PVC板、PP板、PE板或PU板中的任意一种。
17.根据权利要求16所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述底板为PVC板。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条的宽度为3-8mm。
19.根据权利要求18所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条，其特征在于，所述克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条的宽度为3-5mm。
20.一种克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-17中任一项所述的试纸条以及装有克百威荧光微球标记抗体和异丙威荧光微球标记抗体的反应杯。
21.根据权利要求20所述的克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒在同时检测样品中克百威和异丙威的残存中的应用。
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CB02 Change of applicant information

Address after: 518054 28 high tech middle two road, Nanshan District, Shenzhen, Guangdong

Applicant after: Shenzhen Institute for drug control (Shenzhen medical instrument testing center)

Applicant after: Shenzhen Rui Rui biotechnology Limited by Share Ltd

Address before: 518054 28 high tech middle two road, Nanshan District, Shenzhen, Guangdong

Applicant before: Shenzhen Institute for drug control (Shenzhen medical instrument testing center)

Applicant before: Bioeasy Technology, Inc.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
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