CN108593639B - 一种pH分辨比色生物传感器构建的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于比色生物传感器构建领域，提供了一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，技术方案为：步骤1、四氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物(Fe3O4/GO)制备；步骤2、pH分辨比色生物传感器构建。本发明构建的pH分辨比色生物传感器能够为多目标检测提供了一种简单，快速，准确和低成本的策略。
Description
技术领域
本发明属于比色生物传感器构建领域，具体涉及一种构建简单、准确、低成本和用于多目标物同时检测的pH分辨比色生物传感器的方法。
背景技术
比色传感由于具有成本低，携带方便，操作简单等优点，已经在日常生活中广泛应用于各种目标检测，例如：DNA，蛋白质，细胞，毒素，重金属离子等等。主要原因比色传感不需要复杂的仪器，目标的量化可以通过肉眼来实现,所以它非常适合于测试点或现场测试。
对于比色传感器，目前的设计主要是基于单一的颜色变化，严重限制了多目标物检测的能力。到目前为止，关于能够实现多目标物检测的比色生物传感器的报道很少。变色染料也可以用作多色检测的信号指示剂。因此，多目标物检测的问题可以通过使用多个不同波长信号指示剂被部分解决。但是可见光是电磁波谱的窄带(大约400-700nm)。因此，由于光谱重叠，多色的共存会相互干扰。当三种以上颜色混合在一起时，人眼的识别能力不能辨别不同颜色的比例和浓度。所以这个策略只适用于两三个目标的检测。考虑到进一步利用波长区分色彩的潜力是有限的，自然而然地想到一个新的维度，如时间和电势，作为控制措施，使色彩显得有序是必要的。在这种情况下，两个信号指示器甚至具有相同的颜色，可以应用于双目标检测，因为它们在上分离。
真菌毒素对食品的全球污染是一个主要问题，因为它们对人类，动物和农作物造成不利影响，导致疾病和经济损失。因此，食品安全作为全球性问题日益突出。
发明内容
本发明利用四种变色染料为信号指试剂，引入pH值作为新的维度，克服染料间的相互干扰，开发了pH分辨比色生物传感器，旨在发明一种集简单，快速，准确，低成本等优点为一体的pH分辨比色生物传感器直接同时检测赭曲霉素A(OTA)，黄曲霉毒素B1(AFB1)，伏马菌素B1(FB1)和微囊藻毒素LR(MC-LR)。两种变色染料的颜色只能在酸性条件下采集，而另外两种只能在碱性条件下采集。四个目标的浓度可以通过调整pH值依次获得。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，步骤如下：
步骤1、四氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物(Fe3O4/GO)制备
步骤1、首先50mL氧化石墨烯水溶液超声1h，通氮气30min；之后氮气保护下，逐滴加入50mL的三氯化铁和硫酸亚铁混合溶液，搅拌12h。剧烈搅拌，将6M氢氧化钠逐滴加入到混合液至pH值达到10.0，90℃下反应1.5h,后冷却至室温。用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤至中性，定容与100mL存于4℃下备用。
所述氧化石墨烯浓度为0.8mg/mL。
所述三氯化铁和硫酸亚铁的质量分别为0.055g，0.048g。
所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02-0.2M。
步骤2、pH分辨比色生物传感器构建：
步骤2a、移取氧化石墨烯(GO)水溶液，超声2-4h；加入溶有DNA1的磷酸盐缓冲溶液，振荡22-24h，离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次；加入pH值为7.4的磷酸盐缓冲液和酚酞(PP)的乙醇溶液，振荡2～3h；离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤三次，得到PP-DNA1-GO，加入和氧化石墨烯水溶液等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；
其中，氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和酚酞的乙醇溶液体积比为1：0.9：0.1。
用孔雀石绿MGCB替代步骤2a的PP，用DNA3替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到MGCB-DNA3-GO；其中，氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和孔雀石绿的乙醇溶液体积比为1：0.9：0.1。
用百里酚酞TP替代步骤2a的PP，用DNA5替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到TP-DNA5-GO；其中，氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和百里酚酞的乙醇溶液体积比为1：0.9：0.1。
用甲基紫MV替代步骤2a的PP，用DNA7替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到MV-DNA7-GO；其中，氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和甲基紫的乙醇溶液体积比为1：0.9：0.1。
步骤2b、同时移取步骤1制备的Fe3O4/GO溶液，加入溶有DNA2的磷酸盐缓冲溶液溶液，振荡22-24h，离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到DNA2-Fe3O4/GO，加入和Fe3O4/GO溶液等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；
用DNA4替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA4-Fe3O4/GO；
用DNA6替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA6-Fe3O4/GO；
用DNA8替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA8-Fe3O4/GO；
步骤2c、按体积比1:1移取PP-DNA1-GO和DNA2-Fe3O4/GO混合得混合液一，接着加入目标物赭曲霉素A适配体(OTA aptamer)振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到PP-DNA1-GO-OTA aptamer-DNA2-Fe3O4/GO，加入和混合液一等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；
其中，混合液一和目标物赭曲霉素A适配体的体积比为20:1；
同时按体积比1:1移取MGCB-DNA3-GO和DNA4-Fe3O4/GO混合得混合液二，接着加入目标物黄曲霉毒素B1适配体(AFB1aptamer)振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/GO，加入和混合液二等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；
其中，混合液二和目标物黄曲霉毒素B1适配体的体积比为20:1；
同时按体积比1:1移取TP-DNA5-GO和DNA6-Fe3O4/GO混合得混合液三，接着加入目标物伏马菌素B1适配体(FB1aptamer)振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到TP-DNA5-GO-FB1aptamer-DNA6-Fe3O4/GO，加入和混合液三等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；
其中，混合液三和目标物伏马菌素B1适配体的体积比为20:1；
同时按体积比1:1移取MV-DNA7-GO和DNA8-Fe3O4/GO混合得混合液四，接着加入目标物微囊藻毒素LR适配体(MC-LR aptamer)振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到MV-DNA7-GO-MC-LR aptamer-DNA8-Fe3O4/GO，加入和混合液四等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；
其中，混合液四和目标物微囊藻毒素LR适配体的体积比为20:1；
步骤2d、分别移取步骤2c中的PP-DNA1-GO-OTA aptamer-DNA2-Fe3O4/GO，MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/G，TP-DNA5-GO-FB1aptamer-DNA6-Fe3O4/GO，MV-DNA7-GO-MC-LR aptamer-DNA8-Fe3O4/GO的溶液混合，磁分离移去上清液；接着分别对应滴加浓度从5ng/mL到500ng/mL的目标物赭曲霉素A(OTA)，黄曲霉毒素B1(AFB1)，伏马菌素B1(FB1)和微囊藻毒素LR(MC-LR)的混合液，磁分离后通过改变上清液和沉淀物的pH值按浓度进行比色分析；
其中，PP-DNA1-GO-OTA aptamer-DNA2-Fe3O4/GO和目标物赭曲霉素A(OTA)等体积；MGCB-DNA3-GO-AFB1 aptamer-DNA4-Fe3O4/G和黄曲霉毒素B1(AFB1)等体积；TP-DNA5-GO-FB1aptamer-DNA6-Fe3O4/GO和伏马菌素B1(FB1)等体积；MV-DNA7-GO-MC-LR aptamer-DNA8-Fe3O4/GO和微囊藻毒素LR(MC-LR)等体积。
步骤2a中，所述氧化石墨烯(GO)水溶液浓度为0.4mg/mL。
步骤2a中，所述pH值为7.4的磷酸缓冲溶液的离子强度为0.02M～0.2M。
步骤2a中，所述酚酞(PP)，孔雀石绿(MGCB)，百里酚酞(TP)，甲基紫(MV)的浓度分别为2mM，2mM，1.5mM，2mM；
步骤2a中，所述DNA1，DNA3，DNA5，DNA7，都是用0.1M pH＝7.4的磷酸缓冲溶液配置；
所述DNA1序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT TGT CCG ATGCTC CCT TTA-3'，(序列编号NO.1)
DNA3序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT TGT GGG CCT AGCGAA GGG CAC GAG A-3'，(序列编号NO.3)
DNA5序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT AGA TTG CAC TTACTA TCT AAT TGA ATA AGC TGG TAT GTG CAG ACG TAA-3'，(序列编号NO.5)
DNA7序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTA ATT GTC ATGGTG GTC CTG TTT GGC GCC-3'；(序列编号NO.7)
步骤2b中，所述pH值为7.4的磷酸缓冲溶液的离子强度为0.02M～0.2M。
步骤2b中，所述DNA2，DNA4，DNA6，DNA8都是用0.1M pH＝7.4的磷酸缓冲溶液配置；
所述DNA2序列为5'-CGC CAC CCA CAC CCG ATC GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTGTGT GTG TGT-3'，(序列编号NO.2)
DNA4序列为5'-CAC AGA GAG ACA ACA CGT GCC CAA CGT GTG TGT GTG TGT GTGTGT GTG TGT GTG T-3'，(序列编号NO.4)
DNA6序列为5'-TTG AAT AAG CTG GTA TAA GGT AAT GCG ATT AAT TGA ATA AGCTGG TAT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT G TG TGT-3'，(序列编号NO.6)
DNA8序列为5'-GCG GAG ATG GGG CAT AAT GAG GTG GTA TGG GTG TGT GTG TGTGTG TGT GTG TGT GTG TG-3'；(序列编号NO.8)
步骤2c中，所述适配体都是用0.1M pH＝7.4的磷酸缓冲溶液配置。
所述赭曲霉素A适配体(OTA aptamer)序列为5'-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAAAGG GAG CAT CGG ACA-3'，(序列编号NO.9)
黄曲霉毒素B1适配体(AFB1aptamer)序列为5'-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTCTGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-3'，(序列编号NO.10)
伏马菌素B1适配体(FB1aptamer)序列为5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGCATT ACC TTA TAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TATT CAA TTA GATAGT AAG TGC AAT CT-3'，(序列编号NO.11)
微囊藻毒素LR适配体(MC-LR aptamer)序列为5'-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CATGAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3'；(序列编号NO.12)
步骤2c中，所述pH值为7.4的磷酸缓冲溶液的离子强度为0.02M～0.2M；
步骤2d中，赭曲霉素A(OTA)溶液、黄曲霉毒素B1(AFB1)溶液、伏马菌素B1(FB1)、微囊藻毒素LR(MC-LR)均使用纯水配制。
本发明所构建的pH分辨比色生物传感器同时检测赭曲霉素A(OTA)，黄曲霉毒素B1(AFB1)，伏马菌素B1(FB1)和微囊藻毒素LR(MC-LR)，具体的技术解决方案如下：
(1)氧化石墨烯组装体通过DNA杂交自组装形成
DNA1和DNA2为赭曲霉素A适配体(OTA aptamer)的半互补连，DNA1和DNA2能同时赭曲霉素A适配体(OTA aptamer)进行杂交，将氧化石墨烯(GO)和Fe3O4/GO组装在一起，形成一个组装体。同样DNA3和DNA4为黄曲霉毒素B1适配体(AFB1 aptamer)的半互补连，DNA5和DNA6为伏马菌素B1适配体(FB1 aptamer)的半互补连，DNA7和DNA8为微囊藻毒素LR适配体(MC-LRaptamer)的半互补连。
(2)pH值作为控制染料释放
两种变色染料的颜色只能在酸性条件下采集，而另外两种只能在碱性条件下采集四个目标的浓度可以通过调整pH值依次获得。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用多种变色染料作为指示信号构建pH分辨比色生物传感器，将pH作为控制染料释放的顺序，达到多目标物同时检测；
(2)本发明构建的pH分辨比色生物传感器，通过DNA自组装氧化石墨烯，避免了生物传感器制作过程繁琐，费用昂贵的化学修饰过程；
(3)本发明构建的pH分辨比色生物传感器，通过磁场进行分离，缩短实验时间；
(4)本发明构建的pH分辨比色生物传感器，实现了对赭曲霉毒素A(OTA)，黄曲霉毒素B1(AFB1)，伏马菌素B1(FB1)和微囊藻毒素LR(MC-LR)同时有效检测。
·附图说明
图1为GO(A)和Fe3O4/GO(B)的电镜扫描图；
图2为GO(A)，probe-GO(B)，PP-GO(C)和probe 1-GO-OTA-aptamer-probe 2-GO(D)的原子力显微镜图；
图3为反应温度(A)和反应时间(B)的优化图；
图4为同时检测目标物的显色图片和紫外吸收光谱图：(A)OTA，(C)AFB1以及检测线形图(B)OTA，(D)AFB1；
图5为pH分辨比色生物传感器的选择性分析；
图6为同时检测目标物的显色图片：(A)OTA+FB1，(C)AFB1+MC-LR以及检测三维柱状图：(B)OTA+FB1，(D)AFB1+MC-LR。
·具体实施方式
具体实施中：进一步对目标物和适配体反应温度和时间进行优，在最优反应温度37℃和最优反应时间90min条件下，以酚酞(PP)和孔雀石绿(MGCB)作为指示信号，实现同时对赭曲霉素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)比色检测，浓度与指示信号对应的紫外吸收波长呈良好线性；以酚酞(PP)，孔雀石绿(MGCB)，百里酚酞(TP)和甲基紫(MV)作为指示信号，实现对赭曲霉素A(OTA)，黄曲霉毒素B1(AFB1)，伏马菌素B1(FB1)和微囊藻毒素LR(MC-LR)同时比色检测，充分体现本发明的优势。
一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，步骤如下：
步骤1、四氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物(Fe3O4/GO)制备
步骤1、首先50mL氧化石墨烯水溶液超声1h，通氮气30min；之后氮气保护下，逐滴加入50mL的三氯化铁和硫酸亚铁混合溶液，搅拌12h。剧烈搅拌，将6M氢氧化钠逐滴加入到混合液至pH值达到10.0，90℃下反应1.5h,后冷却至室温。用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤至中性，定容与100mL存于4℃下备用。
所述氧化石墨烯浓度为0.8mg/mL。
所述三氯化铁和硫酸亚铁的质量分别为0.055g，0.048g。
所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02-0.2M。
步骤2、pH分辨比色生物传感器构建：
步骤2a、首先，移取1mL氧化石墨烯(GO)水溶液，超声2-4h；加入DNA1磷酸盐缓冲溶液，振荡22-24h，离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤三次；加入900μL pH值为7.4的磷酸盐缓冲液和100μL酚酞(PP)的乙醇溶液，振荡3h；离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤三次，得到PP-DNA1-GO，加入1mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于4℃下备用；
MGCB-DNA3-GO除孔雀石绿(MGCB)和DNA3外，条件和步骤与上述一致；
TP-DNA5-GO除百里酚酞(TP)和DNA5外，条件和步骤与上述一致；
MV-DNA7-GO除甲基紫(MV)和DNA7外，条件和步骤与上述一致；
步骤2b、同时移取1mL步骤1制备的Fe3O4/GO溶液，加入DNA2磷酸盐缓冲溶液溶液，振荡22-24h，离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤三次，得到DNA2-Fe3O4/GO，加入1mLpH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于4℃下备用；
DNA4-Fe3O4/GO，除DNA4外，条件和步骤与上述一致；
DNA6-Fe3O4/GO，除DNA6外，条件和步骤与上述一致；
DNA8-Fe3O4/GO，除DNA8外，条件和步骤与上述一致；
步骤2c、随后，500μL PP-DNA1-GO和500μL DNA2-Fe3O4/GO混合，接着加入50μL目标物赭曲霉素A适配体(OTA aptamer)振荡10-12h。磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤三次，得到PP-DNA1-GO-OTA aptamer-DNA2-Fe3O4/GO，加入1mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于4℃下备用；
同时500μL MGCB-DNA3-GO和500μL DNA4-Fe3O4/GO混合，接着加入50μL目标物黄曲霉毒素B1适配体(AFB1aptamer)振荡10-12h。磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤三次，得到MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/GO，加入1mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于4℃下备用；
同时500μL TP-DNA5-GO和500μL DNA6-Fe3O4/GO混合，接着加入50μL目标物伏马菌素B1适配体(FB1aptamer)振荡10-12h。磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤三次，得到TP-DNA5-GO-FB1aptamer-DNA6-Fe3O4/GO，加入1mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于4℃下备用；
同时500μL MV-DNA7-GO和500μL DNA8-Fe3O4/GO混合，接着加入50μL目标物微囊藻毒素LR适配体(MC-LR aptamer)振荡10-12h。磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤三次，得到MV-DNA7-GO-MC-LR aptamer-DNA8-Fe3O4/GO，加入1mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于4℃下备用；
步骤2d、接着，分别移取1mL步骤2c中的PP-DNA1-GO-OTA aptamer-DNA2-Fe3O4/GO，MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/G，TP-DNA5-GO-FB1aptamer-DNA6-Fe3O4/GO，MV-DNA7-GO-MC-LR aptamer-DNA8-Fe3O4/GO的溶液混合，磁分离移去上清液；接着滴加不同浓度从5ng/mL到500ng/mL的1mL目标物赭曲霉素A(OTA)，黄曲霉毒素B1(AFB1)，伏马菌素B1(FB1)和微囊藻毒素LR(MC-LR)的混合液，磁分离后通过改变上清液和沉淀物的pH值按浓度进行比色分析。
步骤2a中，所述氧化石墨烯(GO)水溶液浓度为0.4mg/mL。
步骤2a中，所述pH值为7.4的磷酸缓冲溶液的离子强度为0.02M～0.2M。
步骤2a中，所述酚酞(PP)，孔雀石绿(MGCB)，百里酚酞(TP)，甲基紫(MV)的浓度分别为2m M，2m M，1.5m M，2m M；
步骤2a中，所述DNA1序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT TGTCCG ATG CTC CCT TTA-3'，DNA3序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGTTGT GGG CCT AGC GAA GGG CAC GAG A-3'，DNA5序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTGTGT GTG TGT AGA TTG CAC TTA CTA TCT AAT TGA ATA AGC TGG TAT GTG CAG ACG TAA-3'，DNA7序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTA ATT GTC ATG GTGGTC CTG TTT GGC GCC-3'；所述DNA1，DNA3，DNA5，DNA7，都是用0.1M pH＝7.4的磷酸缓冲溶液配置；
步骤2b中，所述pH值为7.4的磷酸缓冲溶液的离子强度为0.02M～0.2M。
步骤2b中，所述DNA2序列为5'-CGC CAC CCA CAC CCG ATC GTG TGT GTG TGT GTGTGT GTG TGT GTG TGT-3'，DNA4序列为5'-CAC AGA GAG ACA ACA CGT GCC CAA CGT GTGTGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG T-3'，DNA6序列为5'-TTG AAT AAG CTG GTA TAA GGTAAT GCG ATT AAT TGA ATA AGC TGG TAT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT G TG TGT-3'，DNA8序列为5'-GCG GAG ATG GGG CAT AAT GAG GTG GTA TGG GTG TGT GTG TGT GTGTGT GTG TGT GTG TG-3'；所述DNA2，DNA4，DNA6，DNA8都是用0.1M pH＝7.4的磷酸缓冲溶液配置；
步骤2c中，所述赭曲霉素A适配体(OTA aptamer)序列为5'-GAT CGG GTG TGG GTGGCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3'，黄曲霉毒素B1适配体(AFB1aptamer)序列为5'-GTTGGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-3'，伏马菌素B1适配体(FB1aptamer)序列为5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATT ACC TTA TACCAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TATT CAA TTA GAT AGT AAG TGC AATCT-3'，微囊藻毒素LR适配体(MC-LR aptamer)序列为5'-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CATGAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3'；所述适配体都是用0.1MpH＝7.4的磷酸缓冲溶液配置。
步骤2c中，所述pH值为7.4的磷酸缓冲溶液的离子强度为0.02M～0.2M；
步骤2d中，所述目标物混合液中赭曲霉素A(OTA)的浓度为5ng/mL～500ng/mL，黄曲霉毒素B1(AFB1)的浓度为5ng/mL～500ng/mL，伏马菌素B1(FB1)的浓度为5ng/mL～500ng/mL，微囊藻毒素LR(MC-LR)的浓度为5ng/mL～500ng/mL；赭曲霉素A(OTA)溶液使用纯水配置，黄曲霉毒素B1(AFB1)溶液使用纯水配置，伏马菌素B1(FB1)溶液使用纯水配置，微囊藻毒素LR(MC-LR)溶液使用纯水配置；
本发明所构建的pH分辨比色生物传感器同时检测赭曲霉素A(OTA)，黄曲霉毒素B1(AFB1)，伏马菌素B1(FB1)和微囊藻毒素LR(MC-LR)，具体的技术解决方案如下：
(1)氧化石墨烯组装体通过DNA杂交自组装形成
DNA1和DNA2为赭曲霉素A适配体(OTA aptamer)的半互补连，DNA1和DNA2能同时赭曲霉素A适配体(OTA aptamer)进行杂交，将氧化石墨烯(GO)和Fe3O4/GO组装在一起，形成一个组装体。同样DNA3和DNA4为黄曲霉毒素B1适配体(AFB1aptamer)的半互补连，DNA5和DNA6为伏马菌素B1适配体(FB1aptamer)的半互补连，DNA7和DNA8为微囊藻毒素LR适配体(MC-LRaptamer)的半互补连。
(2)pH值作为控制染料释放
两种变色染料的颜色只能在酸性条件下采集，而另外两种只能在碱性条件下采集四个目标的浓度可以通过调整pH值依次获得。
实例1：
1)氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物(Fe3O4/GO)制备
首先50mL氧化石墨烯水溶液(0.8mg/mL)超声1h，通氮气30min；之后氮气保护下，逐滴加入50mL的三氯化铁(0.055g)和硫酸亚铁(0.048g)混合溶液，搅拌12h。剧烈搅拌，将6M氢氧化钠逐滴加入到混合液至pH值达到10.0，90℃下反应1.5h,后冷却至室温。用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤至中性，定容与100mL存于4℃下备用。
2)不同温度下的比色分析
固定反应时间为90min，分别移取1mL PP-DNA1-GO-OTA aptamer-DNA2-Fe3O4/GO，MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/GO的溶液混合，磁分离后移去上层清液，加入1mL目标物赭曲霉素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)混合物，混合物中赭曲霉素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度分别为100ng/mL和100ng/mL,分别在4℃，25℃，37℃，60℃下进行比色分析，最优反应温度为37℃。
实例2：
1)氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物(Fe3O4/GO)制备
首先50mL氧化石墨烯水溶液(0.8mg/mL)超声1h，通氮气30min；之后氮气保护下，逐滴加入50mL的三氯化铁(0.055g)和硫酸亚铁(0.048g)混合溶液，搅拌12h。剧烈搅拌，将6M氢氧化钠逐滴加入到混合液至pH值达到10.0，90℃下反应1.5h,后冷却至室温。用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤至中性，定容与100mL存于4℃下备用。
2)不同时间下的比色分析
固定反应温度为37℃。，分别移取1mL PP-DNA1-GO-OTA aptamer-DNA2-Fe3O4/GO，MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/GO的溶液混合，磁分离后移去上层清液，加入1mL目标物赭曲霉素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)混合物，混合物中赭曲霉素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度分别为100ng/mL和100ng/mL,分别在15min，30min，45min，60min，75min，90min，105min，120min，下进行比色分析，最优反应时间为90min。
实例3：
1)氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物(Fe3O4/GO)制备
首先50mL氧化石墨烯水溶液(0.8mg/mL)超声1h，通氮气30min；之后氮气保护下，逐滴加入50mL的三氯化铁(0.055g)和硫酸亚铁(0.048g)混合溶液，搅拌12h。剧烈搅拌，将6M氢氧化钠逐滴加入到混合液至pH值达到10.0，90℃下反应1.5h,后冷却至室温。用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤至中性，定容与100mL存于4℃下备用。
2)比色检测赭曲霉素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)
固定反应温度为37℃和反应时间为90min。，分别移取1mL PP-DNA1-GO-OTAaptamer-DNA2-Fe3O4/GO，MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/GO的溶液混合，磁分离后移去上层清液，加入1mL目标物赭曲霉素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)混合物，混合物中物赭曲霉素A(OTA)浓度为0,5,50,100,150,200,250,300,500ng/mL和黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度分别为0,10,50,100,150,200,250,400ng/mL。在碱性条件下，沉淀物的紫外吸收峰强度与赭曲霉素A(OTA)浓度呈良好的线性关系；在酸性条件下，上清液的紫外吸收峰强度与黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度呈良好的线性关系，充分展现了本发明较宽的线性范围。
实例4：
1)氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物(Fe3O4/GO)制备
首先50mL氧化石墨烯水溶液(0.8mg/mL)超声1h，通氮气30min；之后氮气保护下，逐滴加入50mL的三氯化铁(0.055g)和硫酸亚铁(0.048g)混合溶液，搅拌12h。剧烈搅拌，将6M氢氧化钠逐滴加入到混合液至pH值达到10.0，90℃下反应1.5h,后冷却至室温。用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤至中性，定容与100mL存于4℃下备用。
2)选择性分析
固定反应温度为37℃和反应时间为90min。，分别移取1mL PP-DNA1-GO-OTAaptamer-DNA2-Fe3O4/GO，MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/GO的溶液混合，磁分离后移去上层清液，加入1mL不同的目标物，分别是水，伏马菌素B1(FB1)(200ng/mL)，赭曲霉素A(OTA)(100ng/mL)，黄曲霉毒素B1(AFB1)(100ng/mL)，赭曲霉素A(OTA)(100ng/mL)+黄曲霉毒素B1(AFB1)(100ng/mL)，赭曲霉素A(OTA)(100ng/mL)+黄曲霉毒素B1(AFB1)(100ng/mL+伏马菌素B1(FB1)(200ng/mL)。伏马菌素B1(FB1)不会对比色检测产生影响，充分展现了良好的选择性。
实例5：
1)氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物(Fe3O4/GO)制备
首先50mL氧化石墨烯水溶液(0.8mg/mL)超声1h，通氮气30min；之后氮气保护下，逐滴加入50mL的三氯化铁(0.055g)和硫酸亚铁(0.048g)混合溶液，搅拌12h。剧烈搅拌，将6M氢氧化钠逐滴加入到混合液至pH值达到10.0，90℃下反应1.5h,后冷却至室温。用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤至中性，定容与100mL存于4℃下备用。
2)比色检测赭曲霉素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)
固定反应温度为37℃和反应时间为90min。，分别移取PP-DNA1-GO-OTA aptamer-DNA2-Fe3O4/GO，MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/GO，TP-DNA5-GO-FB1aptamer-DNA6-Fe3O4/GO,MV-DNA7-GO-MC-LR aptamer-DNA8-Fe3O4/GO的溶液混合，磁分离后移去上层清液，加入1mL目标物赭曲霉素A(OTA)，黄曲霉毒素B1(AFB1)，伏马菌素B1(FB1)和微囊藻毒素LR(MC-LR)混合物，赭曲霉素A(OTA)，浓度为0,100,200ng/mL，黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度分别为0,50,100ng/mL，伏马菌素B1(FB1)的浓度为0,100,200ng/mL，微囊藻毒素LR(MC-LR)浓度分别为0,50,100ng/mL，。在碱性条件下，根据OTA和FB1的浓度和比率，沉淀物显示不同颜色；在酸性条件下，根据AFB1和MC-LR的浓度和比率，上清液显示不同的颜色。
图1为GO和Fe3O4/GO的电镜扫描图；其中A是GO，B是Fe3O4/GO；图中可以看出Fe3O4/GO成功合成。
图2为GO，probe-GO，PP-GO和GO的DNA自组装体的原子力显微镜图和厚度轮廓图；其中A是GO，厚度约为1.32nm；B是probe-GO，厚度约为1.59nm；其中C是PP-GO，厚度约为3.01nm；D是GO的DNA自组装体，厚度约为22.40nm；图中可以看出probe和PP成功负载在GO表面，GO能够通过DNA自组装形成组装体。
图3为反应温度(A)和反应时间(B)的优化图；最佳反应温度为37℃,和最佳反应时间为90min。
图4为同时检测两种目标物的显色图片和紫外吸收光谱图：(A)OTA，(C)AFB1以及检测线形图(B)OTA，(D)AFB1。由A和B图可知道滴加不同浓度的赭曲霉素A和黄曲霉毒素B1的显色图片的粉红色由深变浅，且紫外光谱图(552nm)与赭曲霉素A的浓度呈反比关系且具有良好的线性关系；由C和D图可知道滴加不同浓度的赭曲霉素A和黄曲霉毒素B1的显色图片的绿色由浅变深，且紫外光谱图(617nm)与黄曲霉毒素B1的浓度呈正比关系且具有良好的线性关系；
图5为pH分辨比色生物传感器的选择性；图中可以看出传感器由良好的选择性。
图6为同时检测四种目标物的显色图片以及检测三维柱状图；其中A为不同浓度OTA和FB1的显色图片，溶液的颜色随着OTA和FB1浓度的增加由深紫色变为浅紫色，当OTA浓度越低时，溶液颜色紫色偏蓝；当FB1浓度越低时，溶液颜色紫色偏粉红。B为通过分析552nm和594nm的紫外光谱图得出OTA浓度和FB1浓度的三维柱状图；C为不同浓度的AFB1和MC-LR的显色图片，溶液的颜色随着AFB1和MC-LR浓度的增加由无色变为深蓝色，当只存在AFB1时，溶液颜色为绿色；当只存在MC-LR时，溶液颜色为粉红色；D为通过分析617nm和570nm的紫外光谱图得出AFB1浓度和MC-LR浓度的三维柱状图；表明pH分辨比色生物传感器可以用于四个目标物同时检测。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种pH分辨比色生物传感器构建的方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt tgtccgatgc tcccttta 48
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgccacccac acccgatcgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgt 48
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt tgtgggccta gcgaagggca cgaga 55
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacagagaga caacacgtgc ccaacgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgt 55
<210> 5
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt agattgcact tactatctaa ttgaataagc 60
tggtatgtgc agacgtaa 78
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgaataagc tggtataagg taatgcgatt aattgaataa gctggtatgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtgtgtgt 78
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtaattgtca tggtggtcct gtttggcgcc 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ataccagctt attcaattaa tcgcattacc ttataccagc ttattcaatt acgtctgcac 60
ataccagctt attcaattag atagtaagtg caatct 96
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggcgccaaac aggaccacca tgacaattac ccataccacc tcattatgcc ccatctccgc 60
Claims (8)
1.一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1、制备四氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物Fe3O4/GO，备用；
步骤2、pH分辨比色生物传感器构建：
步骤2a、移取氧化石墨烯GO水溶液，超声2-4h；加入溶有DNA1的磷酸盐缓冲溶液，振荡22-24h，离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次；加入pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液和酚酞PP的乙醇溶液，振荡2～3h；离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，得到PP-DNA1-GO，加入和氧化石墨烯水溶液等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液保存于2～4℃下备用；
用孔雀石绿MGCB替代步骤2a的PP，用DNA3替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到MGCB-DNA3-GO；
用百里酚酞TP替代步骤2a的PP，用DNA5替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到TP-DNA5-GO；
用甲基紫MV替代步骤2a的PP，用DNA7替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到MV-DNA7-GO；
步骤2b、同时移取步骤1制备的Fe3O4/GO溶液，加入溶有DNA2的磷酸盐缓冲溶液，振荡22-24h，离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次，得到DNA2-Fe3O4/GO，加入和Fe3O4/GO溶液等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液保存于2～4℃下备用；
用DNA4替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA4-Fe3O4/GO；
用DNA6替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA6-Fe3O4/GO；
用DNA8替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA8-Fe3O4/GO；
所述DNA1序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT TGT CCG ATG CTCCCT TTA-3'，
DNA2序列为5'-CGC CAC CCA CAC CCG ATC GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTGTGT-3'，
DNA3序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT TGT GGG CCT AGC GAAGGG CAC GAG A-3'，
DNA4序列为5'-CAC AGA GAG ACA ACA CGT GCC CAA CGT GTG TGT GTG TGT GTG TGTGTG TGT GTG T-3'，
DNA5序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT AGA TTG CAC TTA CTATCT AAT TGA ATA AGC TGG TAT GTG CAG ACG TAA-3'，
DNA6序列为5'-TTG AAT AAG CTG GTA TAA GGT AAT GCG ATT AAT TGA ATA AGC TGGTAT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT G TG TGT-3'，
DNA7序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTA ATT GTC ATG GTGGTC CTG TTT GGC GCC-3'，
DNA8序列为5'-GCG GAG ATG GGG CAT AAT GAG GTG GTA TGG GTG TGT GTG TGT GTGTGT GTG TGT GTG TG-3'；
步骤2c、按体积比1:1移取PP-DNA1-GO和DNA2-Fe3O4/GO混合得混合液一，接着加入目标物赭曲霉素A适配体OTA aptamer振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次，得到PP-DNA1-GO-OTA aptamer-DNA2-Fe3O4/GO，加入和混合液一等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液保存于2～4℃下备用；
同时按体积比1:1移取MGCB-DNA3-GO和DNA4-Fe3O4/GO混合得混合液二，接着加入目标物黄曲霉毒素B1适配体AFB1 aptamer振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次，得到MGCB-DNA3-GO-AFB1 aptamer-DNA4-Fe3O4/GO，加入和混合液二等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液保存于2～4℃下备用；
同时按体积比1:1移取TP-DNA5-GO和DNA6-Fe3O4/GO混合得混合液三，接着加入目标物伏马菌素B1适配体FB1 aptamer振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次，得到TP-DNA5-GO-FB1 aptamer-DNA6-Fe3O4/GO，加入和混合液三等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液保存于2～4℃下备用；
同时按体积比1:1移取MV-DNA7-GO和DNA8-Fe3O4/GO混合得混合液四，接着加入目标物微囊藻毒素LR适配体MC-LR aptamer振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次，得到MV-DNA7-GO-MC-LR aptamer-DNA8-Fe3O4/GO，加入和混合液四等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液保存于2～4℃下备用；
步骤2d、分别移取步骤2c中的PP-DNA1-GO-OTA aptamer-DNA2-Fe3O4/GO，MGCB-DNA3-GO-AFB1 aptamer-DNA4-Fe3O4/G，TP-DNA5-GO-FB1 aptamer-DNA6-Fe3O4/GO，MV-DNA7-GO-MC-LRaptamer-DNA8-Fe3O4/GO的溶液混合，磁分离移去上清液；接着分别对应滴加浓度从5ng/mL到500ng/mL的目标物赭曲霉素A OTA，黄曲霉毒素B1 AFB1，伏马菌素B1 FB1和微囊藻毒素LR MC-LR的混合液，磁分离后通过改变上清液和沉淀物的pH值按浓度进行比色分析。
2.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，其特征在于，
步骤1、首先50mL氧化石墨烯水溶液超声1h，通氮气30min；之后氮气保护下，逐滴加入50mL的三氯化铁和硫酸亚铁混合溶液，搅拌12h，剧烈搅拌，将6M氢氧化钠逐滴加入到混合液至pH值达到10.0，90℃下反应1.5h,后冷却至室温，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤至中性，定容与100mL存于4℃下备用；
所述氧化石墨烯浓度为0.8mg/mL；
所述三氯化铁和硫酸亚铁的质量分别为0.055g，0.048g；
所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.02-0.2M。
3.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，其特征在于，
步骤2a中，所述氧化石墨烯GO水溶液浓度为0.4mg/mL；所述pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液的离子强度为0.02M～0.2M；所述酚酞PP，孔雀石绿MGCB，百里酚酞TP，甲基紫MV的浓度分别为2mM，2mM，1.5mM，2mM。
4.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，其特征在于，
步骤2a中，氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和酚酞的乙醇溶液体积比为1：0.9：0.1；
氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和孔雀石绿的乙醇溶液体积比为1：0.9：0.1；
氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和百里酚酞的乙醇溶液体积比为1：0.9：0.1；
氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和甲基紫的乙醇溶液体积比为1：0.9：0.1。
5.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，其特征在于，
步骤2a和2b中，所述DNA1，DNA2，DNA3，DNA4，DNA5，DNA6，DNA7，DNA8都是用0.1M pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液配置。
6.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，其特征在于，
步骤2c中，所述适配体都是用0.1M pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液配置，所述pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液的离子强度为0.02M～0.2M；
所述赭曲霉素A适配体OTA aptamer序列为5'-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAG CAT CGG ACA-3'，
黄曲霉毒素B1适配体AFB1 aptamer序列为5'-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGTGTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-3'，
伏马菌素B1适配体FB1 aptamer序列为5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATTACC TTA TAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TATT CAA TTA GAT AGTAAG TGC AAT CT-3'，
微囊藻毒素LR适配体MC-LR aptamer序列为5'-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GACAAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3'。
7.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，其特征在于，步骤2c中，
混合液一和目标物赭曲霉素A适配体的体积比为20:1；
混合液二和目标物黄曲霉毒素B1适配体的体积比为20:1；
混合液三和目标物伏马菌素B1适配体的体积比为20:1；
混合液四和目标物微囊藻毒素LR适配体的体积比为20:1。
8.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，其特征在于，步骤2d中，赭曲霉素A溶液、黄曲霉毒素B1溶液、伏马菌素B1、微囊藻毒素LR均使用纯水配制。
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| Extraction of aflatoxins from food samples using graphene-based magnetic nanosorbents followed by high-performance liquid chromatography:A simple solution to overcome the problems of immunoaffinity columns;Es’haghi 等;《JOURNAL OF SEPARATION SCIENCE》;20140930;第37卷(第18期);第2566-2573页 * |
| 基于石墨烯的真菌毒素检测方法研究进展;喻理等;《分析测试学报》;20131231;第32卷(第12期);第1515-1522页 * |
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