CN106525790B - 一种汞离子荧光检测纳米探针的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纳米探针设计应用领域,公开了一种汞离子荧光检测纳米探针的制备及应用,通过纳米粒子的优化设计,通过调节Au和Fe3O4前驱体的摩尔比可调控合成纳米探针的尺寸大小,通过选择合适的碱基序列用于Hg2+检测,建立“T‑Hg2+‑T”结构;经过合理设计纳米探针,具有单一的检测能力,检测下限为0.46nM,远低于世界卫生组织规定的饮用水中Hg2+的最高允许浓度30nM,并且使用过的纳米探针通过半胱氨酸溶液,可以解离“T‑Hg2+‑T”结构使纳米探针再生恢复使用。可应用于环境、食品、人体体液等样品中Hg2+的检测。
Description
技术领域
本发明涉及纳米探针设计应用领域,特别是一种汞离子荧光检测纳米探针的制备及应用。
背景技术
汞离子(Hg2+)是毒性最大的重金属离子之一,大量存在于各种生物垃圾和污染物中,环境中的Hg2+容易被微生物转化成甲基汞,通过食物链进入体内后,由于其具有持久性、易迁移性和生物富集性,会对生物体造成严重的损害,因此水资源中Hg2+的检测和治理成为迫在眉睫的问题。近年来,研究人员开发出很多用于Hg2+检测的纳米探针,主要基于Hg2+增强贵金属纳米粒子的类过氧化物酶活性和Hg2+与胸腺嘧啶(T)能够特异性结合形成“T-Hg2 +-T”稳定结构等原理。其中,基于“T-Hg2+-T”结构构建的荧光纳米探针表现出良好的选择性和灵敏度。随着纳米技术的发展,传统单一功能的纳米材料已经越来越不能满足需求,因此,需要开发出一种具有多功能的探针,同时实现多种类型样本中Hg2+的检测和快速去除等功能,以满足环境、食品汞污染检测及人体汞中毒检测等多方面的更高需求。
相对于具有单一功能的纳米粒子,多功能复合纳米粒子可以同时结合两种或两种以上的功能,例如多模式生物成像(包括荧光成像、核磁共振成像、光声成像以及CT成像等)、检测、催化、磁性分离以及癌症的诊断或治疗等,可以同时满足对多种功能的需求,因而研究多功能复合纳米材料具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种汞离子荧光检测纳米探针的制备及应用,以满足高效的汞离子检测和分离,并且同时具有多模式生物成像功能,可以同时满足多种功能需求。可应用于环境、食品等样品中Hg2+的检测以及人体体液等标本中汞中毒的检测。
为实现上述技术目的,达到上述技术效果,本发明公开了一种汞离子荧光检测纳米探针的制备,包括了以下步骤:
Au-Fe3O4复合纳米凹球的合成:在Fe3+溶液加入二水合柠檬酸三纳,磁力搅拌,待二水合柠檬酸三钠完全溶解后再依次加入尿素和聚丙烯酰胺固体粉末,得到澄清溶液后再逐滴加入HAuCl4水溶液,再在常温下持续搅拌1小时,将所得溶液转入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中,再放入鼓风干燥箱200℃条件下反应10小时,反应结束后,自然冷却至室温,经磁分离、洗涤纯化后,再将样品放入真空干燥箱中60℃下真空干燥10小时,即可得到Au-Fe3O4复合纳米凹球固体粉末;
Au-Fe3O4复合纳米凹球的DNA功能化:在终浓度为0.01%十二烷基硫酸钠、10mM磷酸缓冲盐溶液的混合溶液中加入0.1mL 20μM末端巯基化的DNA碱基序列1和0.9mL 1mg/mLAu-Fe3O4复合纳米凹球溶液,室温下共孵育12小时,然后超声30秒,再振荡过夜,在接下来的8小时内分四次加入NaCl溶液且每次加入后超声30秒混匀,使NaCl的终浓度为0.3M,再次孵育12小时,经磁分离、洗涤纯化后,最后分散在0.3M NaCl/10mM磷酸缓冲盐溶液中,4℃下保存;
CdTe量子点的DNA功能化:将0.1mL 20μM末端巯基化的DNA碱基序列1’与0.9mL 1μM CdTe量子点溶液,室温下共孵育12小时,然后超声30秒,再将混合物转入终浓度为0.01%十二烷基硫酸钠、10mM磷酸缓冲盐溶液和0.05M氯化钠的混合溶液中,振荡过夜,然后在8小时内分四次加入NaCl溶液,且每次加入后超声30秒混匀,使NaCl的终浓度为0.3M,再次孵育12小时,得到的样品用超纯水洗涤后分散在0.3M NaCl/10mM磷酸缓冲盐溶液中,4℃下保存。
其中,Au-Fe3O4复合纳米凹球的合成步骤中,Au和Fe3O4的摩尔比为0.1比1至0.2比1,Au-Fe3O4复合纳米凹球粒径为160-190nm。
其中,Au-Fe3O4复合纳米凹球的DNA功能化和CdTe量子点的DNA功能化步骤中,DNA碱基序列1和DNA碱基序列1’为末端带有巯基且富含胸腺嘧啶的碱基序列。
优选的,DNA碱基序列1为SH-GATCACTGTCTTCTG,DNA碱基序列1’为GTCTGTTGTCACGTC-SH。
本发明还公开了一种汞离子荧光检测纳米探针的应用,其中,荧光检测纳米探针采用上述制备方法制备,并应用于金属离子检测分离。
本发明具有以下有益效果:
1.本发明通过纳米粒子的优化设计,通过调节Au和Fe3O4前驱体的摩尔比可调控合成纳米探针的尺寸大小,通过选择合适的碱基序列用于Hg2+检测,建立“T-Hg2+-T”检测结构。
2.经过合理设计纳米探针,具有单一的检测能力,检测下限为0.46nM,远低于世界卫生组织规定的饮用水中Hg2+的最高允许浓度30nM,并且使用过的纳米探针通过半胱氨酸溶液,可以解离“T-Hg2+-T”结构使纳米探针再生恢复使用。
附图说明
图1为本发明的原理示意图。
图2为本发明的纳米探针结构表征图,其中图a为扫描电子显微镜图,图b为透射电子显微镜图;图c为粉末X射线衍射图;图d为VSM磁性能测试图。
图3为本发明纳米探针检测Hg2+的结果示意图,其中图a为纳米探针检测Hg2+的荧光发射光谱;图b为536nm处荧光强度随Hg2+浓度变化的曲线,插图:536nm处荧光强度与Hg2+浓度0-10nM的关系曲线。
图4为本发明纳米探针专一性检测结果图。
图5为本发明纳米探针恢复性检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
如图1所示,本发明公开了一种汞离子荧光检测纳米探针的制备及其应用,具体步骤如下:
Au-Fe3O4复合纳米凹球的合成:取一个100mL烧杯,依次加入称量好的1.8mmolFeCl3固体和40mL超纯水,磁力搅拌,待溶液澄清后加入4.8mmol二水合柠檬酸三纳,继续搅拌,此时溶液会由橙黄色变为绿色,表明此时Fe3+部分被还原成Fe2+。待二水合柠檬酸三钠完全溶解后再依次加入7.2mmol尿素和0.36g聚丙烯酰胺固体粉末,得到澄清溶液后再逐滴加入3.6mL 0.1M HAuCl4水溶液,再在常温下持续搅拌1小时,溶液会逐渐变成紫黑色。此时将所得溶液转入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中,再放入鼓风干燥箱200℃条件下反应10小时。反应结束后,自然冷却至室温。所得样品先用过量无水乙醇洗涤,然后再用无水乙醇和超纯水分别洗涤,并用钕铁硼强磁铁磁性分离,重复两次,再将样品放入真空干燥箱中60℃下真空干燥10小时,即可得到Au-Fe3O4复合纳米凹球固体粉末。
Au-Fe3O4复合纳米凹球的DNA功能化:在终浓度为0.01%SDS、10mM 磷酸缓冲盐溶液的混合溶液中加入0.1mL 20μM末端巯基化的DNA碱基序列1和0.9mL 1mg/mL Au-Fe3O4复合纳米凹球溶液,室温下共孵育12小时,然后超声30秒,再振荡过夜。在接下来的8小时内分四次加入NaCl溶液且每次加入后超声30秒混匀,使NaCl的终浓度为0.3M,再次孵育12小时。得到的样品用磁性分离和超纯水洗涤,重复三次,最后分散在0.3M NaCl/10mM磷酸缓冲盐溶液中,4℃下保存。
CdTe量子点的DNA功能化:将0.1mL 20μM末端巯基化的DNA碱基序列1’与0.9mL 1μM CdTe量子点溶液,室温下共孵育12小时,然后超声30秒,再将混合物转入终浓度为0.01%SDS、10mM磷酸缓冲盐溶液和0.05M氯化钠的混合溶液中,振荡过夜。然后在8小时内分四次加入NaCl溶液且每次加入后超声30秒混匀,使NaCl的终浓度为0.3M,再次孵育12小时。得到的样品用超纯水洗涤三次后分散在0.3M NaCl/10 mM磷酸缓冲盐溶液中,4℃下保存。
应用方法:
在0.5mL 1mg/mL DNA功能化的Au-Fe3O4复合纳米凹球与1μM DNA功能化的CdTe量子点混合溶液中,加入0.1mL待测溶液,振荡均匀后,检测其荧光发射光谱。
实施例2:
实验目的及方法:为了表征合成的纳米探针微观结构,本实施例以实施例1合成的纳米探针作为研究对象,通过扫描电子显微镜、投射电子显微镜、粉末X射线衍射及VSM磁性能测试,具体实验方法参见相应标准操作此处不再赘述。
实验结果:
如图2(a)所示,Au-Fe3O4复合纳米凹球在扫描电子显微镜下呈明显的凹球状,在图2(b)中可以看到,Au-Fe3O4复合纳米凹球的形貌尺寸均一,呈明显的凹球状,平均粒径约为163nm。
为了进一步确定复合纳米凹球的结构,采用XRD对其晶体结构进行了表征,结果如图2(c)所示。Au-Fe3O4复合纳米凹球出现了多个明显的衍射峰,其中(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)这6个晶面与标准JCPDS No.65-3107对应的Fe3O4物相衍射数据相似,而标记为(104)、(111)、(116)和(311)这4个晶面与标准JCPDS No.65-2870对应的Au物相衍射数据一致,证明了复合纳米凹球是由Fe3O4和Au复合组成的。
通过VSM表征了Au-Fe3O4复合纳米凹球的磁学性质,其磁滞回归曲线如图2(d)所示。Fe3O4和Au-Fe3O4复合纳米凹球的的饱和磁化强度分别为65.8和53.1emu/g,都具有很好的磁响应性,可以在外加磁场的作用下快速分离。
实施例3
实验目的及方法:为了测定合成纳米探针的检测范围和检测线,本实施例以实施例1合成纳米探针为实验对象,在0.5mL 1mg/mL DNA功能化的Au-Fe3O4复合纳米凹球与1μMDNA功能化的CdTe量子点混合溶液中,分别加入0.1mL不同浓度的Hg2+溶液,振荡均匀后,检测其荧光发射光谱。
实验结果:
如图3(a)所示,随着Hg2+浓度从0增大到50nM,溶液的荧光强度逐渐降低。图3(b)显示了Au-Fe3O4复合纳米凹球-CdTe量子点体系在536nm处荧光强度与Hg2+浓度的关系,在0-50nM范围,二者之间没有线性相关,而当Hg2+浓度在0-10nM范围时,二者之间表现出较好的线性关系,其中线性回归方程为:I=1.4-0.13*C,其中C(nM)为Hg2+浓度,I为对应的Au-Fe3O4复合纳米凹球-CdTe量子点体系在536nm处荧光强度,线性相关系数为:R2=0.993。根据σ=3S/L算得Hg2+的检测下限为0.46nM,远低于世界卫生组织规定的饮用水中Hg2+的最高允许浓度(30nM),表明构建的荧光纳米探针对Hg2+检测具有较好的灵敏度。
实施例4
实验目的及方法:为了考察本发明合成纳米探针的专一性,本实施例以实施例1合成纳米探针为实验对象,通过Cu2+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Ag+等常见的金属阳离子考察了DNA功能化的Au-Fe3O4复合纳米凹球-DNA功能化的CdTe量子点体系对Hg2+检测的选择性。
实验结果:
结果如图4所示,除了加入Hg2+的溶液在536nm处的荧光强度与加入前有明显的降低,加入其他常见金属阳离子的溶液在536nm处的荧光强度与空白对照组相比没有发生明显的变化。结果表明Au-Fe3O4复合纳米凹球-CdTe QDs体系对Hg2+具有较好的响应性和选择性。
实施例5
实验目的及方法:为了考察本发明合成纳米探针对水溶液中Hg2+的快速去除和纳米探针的再生功能,本实施例以实施例1合成的纳米探针为实验对象,进行实验表征,具体过程为:首先在DNA功能化的Au-Fe3O4复合纳米凹球-DNA功能化的CdTe量子点体系中加入Hg2+,其中Hg2+终浓度为1μM,共孵育2小时,然后在外加磁场的作用下磁性分离,采用原子吸收光谱检测所得上清液中Hg2+的浓度。其中,未加入荧光探针的Hg2+水溶液作为对照组。同时也考察了纳米荧光探针的重复利用。具体步骤为:将上述磁性分离得到的沉淀分散在水溶液中,再加入稀的半胱氨酸溶液,用来捕捉“T-Hg2+-T”结构中的Hg2+,检测加入半胱氨酸前后溶液的荧光发射光谱。
实验结果:
磁性去除前后Hg2+的浓度检测结果如图5(a)所示,可以看到,磁性去除前溶液中Hg2+的浓度为0.995±0.038μM,在外加磁场的作用下磁性分离后,溶液中Hg2+的浓度大大降低,约为5nM,表明磁性去除能够快速有效地去除水溶液中的Hg2+。如图5(b)所示,将磁性分离得到的沉淀再分散后,由于存在大量的Hg2+,CdTe量子点的荧光猝灭使得溶液的荧光强度很低。采用半胱氨酸溶液处理后,半胱氨酸分子上的巯基能够有效地捕获“T-Hg2+-T”结构中的Hg2+而使其脱离,随后两条DNA碱基序列分离,Au纳米粒子的猝灭效应降低,因此CdTe量子点的荧光恢复。表明经半胱氨酸溶液处理后,荧光纳米探针可以重复利用。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种汞离子荧光检测纳米探针的制备,其特征在于,包括了以下步骤:
Au-Fe3O4复合纳米凹球的合成:在Fe3+溶液加入二水合柠檬酸三纳,磁力搅拌,待二水合柠檬酸三钠完全溶解后再依次加入尿素和聚丙烯酰胺固体粉末,得到澄清溶液后再逐滴加入HAuCl4水溶液,再在常温下持续搅拌1小时,将所得溶液转入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中,再放入鼓风干燥箱200℃条件下反应10小时,反应结束后,自然冷却至室温,经磁分离、洗涤纯化后,再将样品放入真空干燥箱中60℃下真空干燥10小时,即可得到Au-Fe3O4复合纳米凹球固体粉末,其中,Au和Fe3O4的摩尔比为0.1比1至0.2比1,所述的Au-Fe3O4复合纳米凹球粒径为160-190nm;
Au-Fe3O4复合纳米凹球的DNA功能化:在终浓度为0.01%十二烷基硫酸钠、10mM磷酸缓冲盐溶液的混合溶液中加入0.1mL 20μM末端巯基化的DNA碱基序列1和0.9mL 1mg/mL Au-Fe3O4复合纳米凹球溶液,室温下共孵育12小时,然后超声30秒,再振荡过夜,在接下来的8小时内分四次加入NaCl溶液且每次加入后超声30秒混匀,使NaCl的终浓度为0.3M,再次孵育12小时,经磁分离、洗涤纯化后,最后分散在0.3M NaCl/10mM磷酸缓冲盐溶液中,4℃下保存;
CdTe量子点的DNA功能化:将0.1mL 20μM末端巯基化的DNA碱基序列1’与0.9mL 1μMCdTe量子点溶液,室温下共孵育12小时,然后超声30秒,再将混合物转入终浓度为0.01%十二烷基硫酸钠、10mM磷酸缓冲盐溶液和0.05M氯化钠的混合溶液中,振荡过夜,然后在8小时内分四次加入NaCl溶液,且每次加入后超声30秒混匀,使NaCl的终浓度为0.3M,再次孵育12小时,得到的样品用超纯水洗涤后分散在0.3M NaCl/10mM磷酸缓冲盐溶液中,4℃下保存。
2.如权利要求1所述的一种汞离子荧光检测纳米探针的制备,其特征在于:所述的Au-Fe3O4复合纳米凹球的DNA功能化和CdTe量子点的DNA功能化步骤中,DNA碱基序列1和DNA碱基序列1’为末端带有巯基且富含胸腺嘧啶的碱基序列。
3.如权利要求2所述的一种汞离子荧光检测纳米探针的制备,其特征在于:所述的DNA碱基序列1为SH-GATCACTGTCTTCTG,所述的DNA碱基序列1’为GTCTGTTGTCACGTC-SH。
4.一种汞离子荧光检测纳米探针的应用,其特征在于:所述的荧光检测纳米探针采用权利要求1-3中任一项的制备方法制备,并应用于金属离子检测分离。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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