CN104870365B - 纳米金刚石颗粒及其制造方法以及荧光分子探针和蛋白质的结构分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供包含利用含杂原子的官能团修饰了表面而提高了ODMR强度的NV色心的纳米金刚石颗粒。该纳米金刚石颗粒通过进行化学修饰,从而能够制成可在生物体内利用的荧光分子探针。另外,通过追踪该荧光分子探针中所含的NV色心的旋转运动,从而能够实时地分析蛋白质的结构变化。含杂原子的官能团可以设为羟基和羟基烷基中的至少任一官能团、或羧基。
Description
技术领域
本发明涉及纳米金刚石颗粒及其制造方法以及荧光分子探针和蛋白质的结构分析方法。
背景技术
作为蛋白质的结构、蛋白质等生物分子的结构分析、功能分析中使用的荧光分子探针,已知有各种探针。例如,可列举出与伯胺发生特异性反应而表现出荧光性的荧光胺等。此外,通过利用荧光分子探针标记靶蛋白质并使用荧光显微镜等进行观测,从而能够收集靶蛋白质的运动、取向等之类的与分子结构相关的各种信息。此外,最近,作为这种荧光分子探针所使用的荧光物质,纳米金刚石颗粒受到关注(例如,日本特开2011-180570号公报(专利文献1))。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2011-180570号公报
发明内容
发明要解决的问题
在生物体内,蛋白质密切参与生命现象。此外,追踪蛋白质在生物体内的结构变化在揭示蛋白质的功能、乃至揭示疾病的表现、进展的机理上极其重要。一直以来,蛋白质的结构分析仅在“体外(in-vitro)”即试管内进行。但是,实际上蛋白质发挥功能的生物体内“in-vivo”与试管内相比,环绕蛋白质的环境大大不同,因此试管内观测到的结果能够直接应用于生物体内的结构、功能的情况有限,期望尽快建立生物体内的蛋白质的结构分析方法。
一直以来,蛋白质的结构分析中主要使用基于核磁共振的分子结构分析法〔以下也记作“NMR(Nuclear Magnetic Resonance)法”〕、利用荧光显微镜的荧光分子观察法等。
NMR法由于能够进行非侵入性的测量,并且具有原子级别的高空间分辨率,因此能够收集与立体结构相关的许多信息。然而,在另一方面,灵敏度低,时间分辨率也低,因此难以进行实时的观测。
荧光分子观察法能够进行一分子测量,并且能够进行实时观察/测量。然而,在另一方面,空间分辨率低,极难测量所谓结构的波动、结构变化。进而,荧光分子探针所使用的荧光物质也常常具有毒性,不适于非侵入性的测量。
如此,利用现有的方法,在生物体内非侵入性且实时地观测1分子蛋白质的结构变化是不可能的。
已知光检测磁共振法〔以下也记作“ODMR(Optically-Detected MagneticResonance)法”〕作为高灵敏度地检测试验体的磁共振的手段。ODMR法通过对试验体同时照射激发光和高频磁场并检测荧光发光量的变化,从而高灵敏度地检测磁共振。在此之后,本说明书中也将这种测量手段记作ODMR测量。
近年来,正在进行例如像专利文献1中记载的荧光显微镜装置那样将融合磁共振法和荧光分子观察法而成的ODMR法应用于生物体内的蛋白质的结构分析的研究。于是,其中显示出纳米金刚石颗粒作为荧光分子探针的可能性。
已知,包含由金刚石晶体中的氮原子和空穴构成的复合缺陷(以下也记作“NV色心”)的纳米金刚石颗粒在NV色心发生荧光发光,并且因磁共振而使荧光发光量变化。此处,NV色心表示如图1所示由取代了金刚石晶体中的碳原子1的氮原子2(N;Nitrogen)和与氮原子2相邻的空穴3(V;Vacancy)构成的复合缺陷。
关于NV色心的荧光,荧光的褪色、闪烁较少,向荧光分析的适应性高。进而,纳米金刚石颗粒为包含碳原子的物质,因此认为其对生物体的毒性极低,而且用于标记靶蛋白质的颗粒表面的化学修饰容易,因此作为在生物体内使用的荧光分子探针被视为有前景。
进行包含如上所述的NV色心的纳米金刚石颗粒的ODMR测量,以将荧光发光量作为纵轴、磁场频率作为横轴的二维坐标表示时,在特定的高频磁场中观测到荧光发光的减少峰。此处,本说明书中,也将以上述二维坐标表示的谱图记作“ODMR谱”,也将上述减少峰记作“ODMR信号”。
此外,ODMR测量中,将照射高频磁场时的发光量设为L(ON)、未照射磁场时的发光量设为L(OFF)时,将根据下述式(I)算出的荧光发光量的减少率定义为“ODMR强度”。
(ODMR强度)=1-{L(ON)/L(OFF)}…(I)
上述减少峰(ODMR信号)在放置于静态的外部磁场中的NV色心发生分裂,峰的分裂宽度随NV色心的旋转运动而变化,因此,通过使用包含NV色心的纳米金刚石颗粒作为荧光分子探针,利用该荧光分子探针标记靶蛋白质,并且测量ODMR谱,从而有可能实现依靠上述现有方法无法实现的生物体内的蛋白质的精细且实时的结构分析。
此处,为了实现如上所述的生物体内的蛋白质的结构分析方法,具有极高的ODMR强度的包含NV色心的纳米金刚石颗粒成为必需。
然而,现状是,包含NV色心的纳米金刚石颗粒的ODMR强度不足以稳定地进行生物体内的测量,尚未建立如上所述的蛋白质的结构分析方法。此外,至今尚无报道有提高包含NV色心的纳米金刚石颗粒的ODMR强度的方法的例子。
本发明是鉴于这种现状而做出的,其目标在于提供包含提高了ODMR强度的NV色心的纳米金刚石颗粒,使用对该纳米金刚石颗粒进行化学修饰而成的荧光分子探针来提供新型的蛋白质的结构分析方法。
用于解决问题的方案
本发明的纳米金刚石颗粒通过利用特定的官能团修饰颗粒表面,从而提高了存在于颗粒内部的NV色心的ODMR强度(光检测磁共振强度)。
即,本发明的纳米金刚石颗粒的特征在于,包含利用含杂原子的官能团修饰了表面而提高了ODMR强度的NV色心。
此处,上述含杂原子的官能团优选为给电子性官能团。另外,上述含杂原子的官能团优选为羟基和羟基烷基中的至少任一种。另外,上述含杂原子的官能团也可以为羧基。
另外,上述纳米金刚石颗粒的平均粒径优选为1nm以上且50nm以下。
此外,上述ODMR强度是指,表示照射1~5GHz的高频磁场时的由激发光造成的荧光发光量的减少率。
作为本发明的纳米金刚石颗粒的具体的利用形态,例如可列举出包含纳米金刚石颗粒的粉末状试剂、将纳米金刚石颗粒分散于液体而成的试剂等。
进而,本发明也涉及上述纳米金刚石颗粒的制造方法,该制造方法为如下的提高了ODMR强度的纳米金刚石颗粒的制造方法,即,其包括以下的工序:准备纳米金刚石颗粒的工序;以及,进行选择性地提高该纳米金刚石颗粒表面上存在的官能团中的1种以上的含杂原子的官能团的修饰率的处理的工序。
此处,优选的是,上述1种以上的含杂原子的官能团为羟基和/或羟基烷基(羟基和羟基烷基中的至少任一种),并且进行上述处理的工序为进行还原处理的工序。
另外,也可以是:上述1种以上的含杂原子的官能团为羧基,并且进行上述处理的工序为进行氧化处理的工序。
另外,本发明也涉及使用了上述纳米金刚石颗粒的荧光分子探针,该荧光分子探针的特征在于,对上述包含提高了ODMR强度的NV色心的纳米金刚石颗粒进行化学修饰。该荧光分子探针例如可以以粉末状的试剂、分散于液体而成的试剂的形式来利用。
进而,本发明也涉及蛋白质的结构分析方法,该结构分析方法为:对利用上述荧光分子探针标记了的靶蛋白质照射激发光和1~5GHz的高频磁场,检测荧光发光量减少的峰值磁场频率,从而检测该靶蛋白质的结构变化的蛋白质的结构分析方法。即,该结构分析方法具备以下的工序:利用荧光分子探针标记靶蛋白质的工序;以及,对所标记的靶蛋白质照射激发光和1~5GHz的高频磁场,检测荧光发光量减少的峰值磁场频率,从而检测靶蛋白质的结构变化的工序。
此处,上述峰值磁场频率在静态的外部磁场下发生分裂,可以由其分裂宽度的大小检测荧光分子探针中所含的NV色心的旋转运动。
发明的效果
本发明的纳米金刚石颗粒表现出极高的ODMR强度。因此,可以用作生物体内的荧光分子探针,通过使用其而有可能实现生物体内的蛋白质的精细且实时的结构分析。
附图说明
图1为金刚石晶体中的NV色心的示意概念图。
图2为示出金刚石晶体中的氮原子和空穴的配置的一例的示意概念图。
图3为示出NV色心的能级的一例的概念图。
图4为示出金刚石晶体中的NV(-)的示意概念图。
图5为示出金刚石晶体中的NV(0)的示意概念图。
图6为示出NV(-)的能级的一例的示意概念图。
图7为示出NV(-)进行荧光发光时的能级的一例的示意概念图。
图8为示出本发明的实施方式的ODMR谱的一例的图。
图9为示出本发明的实施方式的蛋白质的结构分析方法中的ODMR谱的一例的图。
图10为示出本发明的实施方式的纳米金刚石颗粒的IR光谱的一例的图。
图11为示出本发明的实施方式的ODMR强度的评价所使用的荧光显微镜装置的一例的示意概念图。
图12为示出本发明的实施方式的包含提高了ODMR强度的NV色心的纳米金刚石颗粒的制造方法的流程图。
图13为示出本发明的实施方式的蛋白质的结构分析方法中的分析装置的示意概念图。
图14为示出本发明的实施方式的纳米金刚石颗粒的ODMR强度的测定例的图表。
图15为示出本发明的实施方式的纳米金刚石颗粒的ODMR强度的测定例的图表。
图16为示出本发明的实施方式的荧光分子探针的合成线路的一例的图。
图17为示出添加有纳米金刚石颗粒的细胞株的观察结果的一例的图。
图18为示出水溶液中的蛋白质的浓度与吸附于纳米金刚石颗粒的蛋白质浓度的关系的一例的图表。
图19:图19的(A)为示出本发明的实施方式的纳米金刚石颗粒的荧光像的图,图19的(B)为示出本发明的实施方式的纳米金刚石颗粒的ODMR像的图。
图20:图20的(A)为示出现有的纳米金刚石颗粒的荧光像的图,图20的(B)为示出现有的纳米金刚石颗粒的ODMR像的图。
图21为示出本发明的实施方式的蛋白质的结构分析方法的概要的流程图。
具体实施方式
[实施方式1]
以下,对本发明的实施方式(以下也记作“本实施方式”)进一步详细说明,但本发明并不限定于这些。
<包含提高了ODMR强度的NV色心的纳米金刚石颗粒>
以下,对本实施方式的纳米金刚石颗粒进行说明。本实施方式的纳米金刚石颗粒包含利用含杂原子的官能团修饰了表面而提高了ODMR强度的NV色心。
《纳米金刚石粉末》
成为原料的纳米金刚石粉末的制造方法没有特别限制,利用任何方法制造均可。作为纳米金刚石粉末的制造方法,例如可列举出CVD法(化学气相沉积法)、爆炸法(爆轰法)、高温高压法(HPHT法)等。
本实施方式的纳米金刚石颗粒以向生物体内的蛋白质的结构分析方法中的利用作为目标之一。通常,利用CVD法、HPHT法得到的纳米金刚石粉末具有较宽的粒度分布,因此优选适当地进行分级来调整粒度分布。此处,作为分级方法,例如可以适宜地使用超离心法、尺寸排阻色谱法等。另一方面,若是利用爆轰法得到的纳米金刚石粉末,则可以不进行分级操作地直接使用。这是因为,爆轰法在其制法原理上不会生成大颗粒,可得到粒径为4~5nm左右且粒径整齐的粉末。
若考虑生物体内的使用,则纳米金刚石颗粒的平均粒径越小越优选,优选为50nm以下、更优选为40nm以下、最优选为30nm以下。平均粒径超过50nm时,存在分散性降低的倾向,不优选。另外,如上所述平均粒径越小越优选,但从具有NV色心且确保高结晶性的观点出发优选为1nm以上。如前所述,利用爆轰法得到的纳米金刚石粉末能够具有4~5nm左右的粒径范围。因此,利用爆轰法得到的纳米金刚石粉末特别适宜作为本实施方式的纳米金刚石颗粒的原料。需要说明的是,“平均粒径”可以通过例如动态光散射法、激光衍射法等来测定。
《NV色心》
本实施方式的纳米金刚石颗粒包含提高了ODMR强度的NV色心。此处,NV色心是指,表示如图1所示由取代了金刚石晶体中的碳原子1的氮原子2和与氮原子2相邻的空穴3构成的复合缺陷。
《NV色心的生成》
通常,通过如上所述的方法制造纳米金刚石粉末时,在金刚石晶体中混入作为杂质的氮原子,同时也存在欠缺碳原子的空穴。但是,在原样的状态下例如如图2所示氮原子2与空穴3没有形成相邻的一对,没有形成NV色心。
《真空热处理》
所以,通过将纳米金刚石粉末在真空中、700℃~1000℃的高温下进行热处理,从而能够使氮原子2与空穴3结合。由此,在金刚石晶体中生成图1所示的NV色心。
《空气热处理》
但是,如上所述在高温下进行真空热处理时,颗粒表面的金刚石结构的一部分发生石墨化。如此,表面被石墨覆盖时,即使在晶体内部具有NV色心,纳米金刚石颗粒也不会表现出良好的荧光发光。
所以,为了得到表现出良好的荧光发光的纳米金刚石颗粒,需要在真空热处理之后进一步在空气中、400℃~600℃下进行热处理而使表面氧化。
《NV(-)和NV(0)》
如上所述地操作,在金刚石晶体内部生成了NV色心的纳米金刚石颗粒在照射激发光时进行荧光发光。此外,对该金刚石颗粒同时照射激发光和高频磁场,发生电子自旋共振〔以下也记作“ESR(Electron Spin Resonance)”〕时,有时荧光发光量减少。
该现象是由于NV色心当中存在在发生ESR时形成不进行荧光发光的自旋状态的NV(-)而引起的。以下,使用图3~8说明该现象。
如图3所示,NV色心的基态为自旋三重态(3A)、激发状态为自旋三重态(3E)。此外,在(3A)与(3E)之间存在相当于波长637nm的能隙。另外,在(3A)与(3E)之间存在自旋单重态(1A1)。
如图4所示,NV(-)在与氮原子2相邻的空穴3获得了多余的电子5。由于该电子的存在,不成对电子6成为2个,可以形成S=1的自旋状态。
因此,如图6所示,NV(-)的基态在未施加静磁场的状态下也分裂为具有相当于约2.87GHz的能隙的Mz=0的基态(A1)和Mz=±1的准基态(E)。因此,照射约2.87GHz的高频磁场时,在零磁场环境下也发生ESR。
此处,将在发生ESR的状态下对NV(-)照射激发光时的弛豫过程示于图7。因激发光而自Mz=±1的准基态(E)被激发的电子的一部分发生系间窜越,如图7中的点划线所示经由自旋单重态(1A1)走向不进行荧光发光的非辐射过程。即,该现象以图8所示那样的荧光发光量的减少(ODMR信号)的形式被观测到。此外,走向非辐射过程的电子越多,ODMR信号越大(换言之,ODMR强度越提高。)。
另一方面,NV(0)中,如图5所示NV色心中不存在多余的电子5,因此成为S=1/2的自旋状态。因此,对于NV(0)而言,即使照射激发光也仅发生图3所示的(3A)与(3E)之间的跃迁,不会走向非辐射过程。即,不会表现出ODMR信号(ODMR非活性)。
由以上的说明可知,若能够增加NV色心当中NV(-)的存在率,则能够提高ODMR强度。
本发明人等针对在包含NV色心的纳米金刚石颗粒中提高NV(-)的存在率的方法反复进行了深入研究,结果发现,通过利用特定的官能团修饰纳米金刚石颗粒的表面,能够增加NV(-)的存在率,并且飞跃性地提高ODMR强度,从而完成了本发明。
即,本实施方式的纳米金刚石颗粒为通过利用含杂原子的官能团修饰表面而提高了NV色心的ODMR强度的纳米金刚石颗粒。
《含杂原子的官能团》
本说明书中,杂原子是指除碳(C)、氢(H)以外的原子,并且表示官能团中在该原子上具有未共享电子对的原子。作为这种杂原子,例如可列举出氧(O)、氮(N)、硫(S)等。此外,作为含杂原子的官能团,例如可列举出羟基(-OH)、羟基烷基(-CH2OH、-ROH:R表示烷基。)、羧基(-COOH)、氨基(-NH2)、烷基氨基(-NHR、-NR2:R表示烷基。)、巯基(-SH)等。
《给电子性》
上述含杂原子的官能团优选为给电子性官能团。此处,本说明书中,“给电子性”是指,表示由该杂原子上的未共享电子对而引起的共振效应所带来的给电子性。
通过利用给电子性的含杂原子的官能团修饰纳米金刚石颗粒的表面,从而能够促进NV(-)的产生。
此外,上述含杂原子的官能团当中,羟基、羟基烷基和羧基容易得到本发明的效果,作为修饰官能团是优选的。需要说明的是,羧基为具有吸电子性的官能团,但根据本发明人的研究,明确了即使在利用羧基修饰了纳米金刚石颗粒时也能提高NV(-)的存在率。
《表面修饰处理》
通常,纳米金刚石颗粒的表面上存在多种多样的官能团。作为这种官能团,例如已知烷基、羧基、酮基、羟基、乙烯基、内酯基等的存在。
本实施方式的纳米金刚石颗粒可以通过进行选择性地提高这种官能团当中的1种以上的含杂原子的官能团的修饰率的处理而制造。
此处,含杂原子的官能团优选为选自由羟基、羟基烷基和羧基组成的组中的1种以上官能团。
另外,作为如上所述的处理,例如可以适宜地使用对存在于纳米金刚石颗粒表面的官能团进行还原处理和/或氧化处理的方法。
此处,上述处理为还原处理时,能够选择性地提高基于羟基和/或羟基烷基(羟基和羟基烷基中的至少任一种)修饰纳米金刚石颗粒表面的修饰率。作为还原处理的方法,现有公知的任何还原反应均可采用。例如,可以使用硼烷-四氢呋喃混合溶液、氢化铝锂、硼氢化钠、芬顿试剂(Fenton’s reagent)等作为还原剂来进行还原处理。
另外,上述处理也可以为氧化处理。为氧化处理时,能够选择性地提高基于羧基修饰纳米金刚石颗粒表面的修饰率。作为氧化处理的方法,现有公知的任何氧化反应均可采用。例如,可以使用浓硫酸与浓硝酸的混合溶液、Piranha溶液、硫酸、硝酸、高氯酸混合溶液等作为氧化剂来进行氧化处理。
《表面修饰官能团的定性》
如上所述进行表面修饰处理后,优选进行存在于纳米金刚石颗粒的表面的官能团的定性。官能团的定性例如可以通过测定红外分光光谱(以下也记作“IR光谱”)来进行。例如,可以将纳米金刚石颗粒通过现有公知的压片法成形为压片,测定IR光谱。
《ODMR强度的评价》
ODMR强度的评价可以如下进行:边对纳米金刚石颗粒照射激发光边照射会产生ESR的高频磁场,测量荧光发光量,并且根据上述式(I)算出ODMR强度,从而进行。
《NV(-)的存在率的评价》
NV(-)的存在率的评价也可以如下进行:对于在相同条件下处理过的一定数量的纳米金刚石颗粒,针对各个颗粒求出上述ODMR强度,算出它们的算术平均,从而进行。此处,为了得到可靠性高的结果,上述一定数量例如优选设为50~200个左右。
《其他》
如上所述,本实施方式的纳米金刚石颗粒具有高ODMR强度。此处,从进一步提高ODMR强度的观点出发,纳米金刚石颗粒优选在晶体内部不含稀土金属(例如,镱(Yb)、铒(Er)、铥(Tm)等)。这是因为,晶体中导入稀土金属时,金刚石晶格中产生畸变,有时ODMR强度减退。另外,优选的是,金刚石晶体中也不含磁性元素(例如,锰(Mn)、铁(Fe)、镍(Ni)、钴(Co)、铜(Cu)等)。这是因为,这些磁性元素发生的磁场有时对ODMR强度的测定造成不良影响。
需要说明的是,本实施方式中,构成金刚石晶体的碳中,只要是自然界存在的碳就可以没有特别限定地使用。例如,作为天然存在的碳的稳定的同位素,有12C和13C,金刚石晶体中的它们的存在比率也没有特别限定。
[实施方式2]
这种本实施方式的纳米金刚石颗粒通过如下的制造方法而制造。换言之,通过如下的制造方法而制造的纳米金刚石颗粒表现出如上所述的特性。因此,本实施方式的纳米金刚石颗粒具有表现出极高的ODMR强度这样的优异的效果。以下,针对本实施方式的纳米金刚石颗粒的制造方法进行说明。
<包含提高了ODMR强度的NV色心的纳米金刚石颗粒的制造方法>
图12中示出本实施方式的纳米金刚石颗粒的制造方法的流程图。该制造方法包括以下的工序:准备纳米金刚石颗粒的工序S1;以及进行选择性地提高纳米金刚石颗粒的表面上存在的官能团当中的1种以上的含杂原子的官能团的修饰率的处理的工序S2。以下,针对各工序进行说明。
《准备纳米金刚石颗粒的工序S1》
首先,工序S1中,实施以下的工序:对纳米金刚石粉末进行分级的工序S11;对纳米金刚石颗粒在真空中进行热处理的工序S12;以及,对纳米金刚石颗粒在空气中进行热处理的工序S13。通过实施工序S11,从而将纳米金刚石颗粒调整为适用于生物体内的粒度分布,通过实施工序S12,从而在纳米金刚石颗粒的内部生成NV色心。进而,通过实施工序S13,从而将纳米金刚石颗粒表面的石墨层氧化,能够制造包含表现出荧光性的NV色心的纳米金刚石颗粒。需要说明的是,如前所述使用通过爆轰法得到的金刚石粉末时,可以省略进行分级的工序。
《进行选择性地提高含杂原子的官能团的修饰率的处理的工序S2》
接着,工序S2中,作为对于上述工序S1中得到的纳米金刚石颗粒进行选择性地提高颗粒的表面上存在的官能团当中的1种以上的含杂原子的官能团的修饰率的处理的工序,实施进行还原处理的工序S21和/或进行氧化处理的工序S22,从而能够制造包含提高了ODMR强度的NV色心的纳米金刚石颗粒。
需要说明的是,本实施方式的纳米金刚石颗粒的制造方法只要包含上述工序S1(工序S11~工序S13)和工序S2(工序S21和工序S22中的至少任一者),则也可以包含其它工序,只要包含工序S1和工序S2就会显示出本发明的效果。
此处,作为其它工序,例如可以包括在工序S2后将纳米金刚石颗粒干燥的工序。但是,将进行了表面修饰的纳米金刚石颗粒干燥时,进行冷冻干燥是理想的。这是因为,利用冷冻干燥能够防止纳米金刚石颗粒发生聚集而形成团簇。另一方面,例如进行减压干燥时,纳米金刚石颗粒发生聚集而形成团簇,故不优选。
本实施方式的纳米金刚石颗粒用于生物分子的结构分析,因此如前所述其粒径小是优选的。此外,特别优选的是,本实施方式的纳米金刚石颗粒为单一颗粒而非聚集体。其理由如下所述。
如后所述本实施方式的蛋白质的结构分析方法中,通过追踪纳米金刚石颗粒中的N-V轴矢量与外部磁场(静磁场)矢量所成的角度,从而追踪N-V轴的旋转运动。此处,金刚石晶体中的NV色心具有4个N-V轴。因此,使用纳米金刚石颗粒的聚集体作为荧光分子探针时,在聚集体中多个纳米金刚石颗粒以各种方向(角度)近距离地存在,因此,多个N-V轴也会各种各样地取向,ODMR信号的分辨率降低。因此,本实施方式的纳米金刚石颗粒优选为单一颗粒,其制造方法中优选采用不会产生聚集体的工艺。
[实施方式3]
以下,针对上述说明的本实施方式的纳米金刚石颗粒应用于生物体测量的具体应用例即荧光分子探针进行说明。
<荧光分子探针>
本实施方式的荧光分子探针通过对包含提高了ODMR强度的NV色心的纳米金刚石颗粒进行化学修饰而得到。
此处,若考虑到生物体内的测量,则作为荧光分子探针所使用的纳米金刚石颗粒,优选本实施方式的纳米金刚石颗粒当中粒径为1~10nm的纳米金刚石颗粒。
另外,为了在ODMR测量中确保充分的S/N比、得到较高的时间分辨率,优选本实施方式的纳米金刚石颗粒当中ODMR强度为0.02以上的纳米金刚石颗粒、更优选ODMR强度为0.05以上的纳米金刚石颗粒、特别优选ODMR强度为0.10以上的纳米金刚石颗粒。
《化学修饰》
此处,化学修饰是指,表示将与靶蛋白质特异性结合的分子链化学键合于纳米金刚石。该分子链可以与形成金刚石晶体的碳原子直接键合,也可以与纳米金刚石颗粒表面上的官能团键合。另外,该分子链优选根据靶蛋白质(也称为目标蛋白质)适当选择。例如,以后述代谢型谷氨酸受体作为靶时,可以使用α-氨基苄青霉素(Ampicillin,以下也有时简写为“Amp”)等。
《非特异性吸附的抑制方法》
上述化学修饰优选包含抑制向靶蛋白质以外的生物体高分子非特异性吸附的分子链。作为这种分子链的一例,例如可列举出超支化聚甘油(HPG:Hyper branched Poly-Glycerol)。化学修饰通过包含抑制非特异性吸附的分子链,从而能够高选择性地标记靶蛋白质。
图16示出本实施方式的荧光分子探针的合成线路的一例。如图16所示,本实施方式的荧光分子探针可以按照以下的(i)~(iii)的步骤来合成。即,本实施方式的荧光分子探针101可以通过:(i)将纳米金刚石颗粒100的表面利用例如羟基进行修饰而提高ODMR强度;(ii)使抑制非特异性吸附的分子链键合于羟基等;(iii)然后利用与靶蛋白质特异性结合的分子链进行修饰,从而进行合成。需要说明的是,图16中示出作为抑制非特异性吸附的分子链采用HPG、作为与靶蛋白质特异性结合的分子链采用Amp的例子。
(实验例)
此处,使用实验例来说明成功地抑制了非特异性吸附的具体例。首先,(i)利用羟基修饰纳米金刚石颗粒,进行ODMR强度的增强。接着,(ii)在该纳米金刚石颗粒上键合以下的[a]~[c]所示的分子链(即,利用该分子链进行表面修饰),得到表面修饰纳米金刚石颗粒。
[a]羧基
[b]聚乙二醇(PEG:polyethylene glycol)
[c]HPG
在以下的该实验例的说明中,根据上述符号[a]~[c],将利用羧基进行了表面修饰的纳米金刚石颗粒记作“ND[a]”、利用PEG进行了表面修饰的纳米金刚石颗粒记作“ND[b]”、利用HPG进行了表面修饰的纳米金刚石颗粒记作“ND[c]”。
(实验例1)
实验例1中评价了纳米金刚石颗粒向细胞表面的非特异性吸附。
对于DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)培养基中培养的A431(人皮肤鳞状细胞癌来源的细胞株),以成为1mg/ml的浓度的方式添加上述得到的ND[a]~[c],制作试验细胞株[a]~[c]。此处,例如试验细胞株[a]是指,表示以成为1mg/ml的浓度的方式添加有ND[a]的试验细胞株。
另外,此时,作为比较实验例,也相应地制作以成为10mg/ml的浓度的方式添加有ND[c]的细胞株(试验细胞株[d])。
将上述各试验细胞株培养2小时后,用生理盐水清洗。此外,利用明视场显微镜观察各试验细胞株中所含的细胞上吸附的纳米金刚石颗粒,确认纳米金刚石颗粒向细胞膜的非特异性吸附的有无。将其结果示于图17。
图17为使用明视场显微镜以10倍的倍率观察各试验细胞株而得到的观察视场图像、和以40倍的倍率观察各试验细胞株而得到的观察视场图像。图17中,“a.ND-COOH”表示试验细胞株[a],“b.ND-PEG”表示试验细胞株[b],“c.ND-HPG”表示试验细胞株[c],“d.ND-HPG”表示试验细胞株[d]。另外,“e.control”表示对照细胞,即未添加纳米金刚石颗粒的细胞株。
如图17所示,关于“a.ND-COOH”和“b.ND-PEG”,在视场中存在黑点,可知发生了纳米金刚石颗粒向细胞膜的非特异性吸附。另一方面,关于“c.ND-HPG”和“d.ND-HPG”,没有确认到这种非特异性吸附,即使与“e.control”(对照细胞)相比也几乎无法确认到差异。即,确认到,通过利用HPG对纳米金刚石颗粒进行表面修饰,从而能够抑制由纳米金刚石颗粒造成的向细胞表面的非特异性吸附。
(实验例2)
实验例2中评价了蛋白质向纳米金刚石颗粒的非特异性吸附。
首先,在溶菌酶水溶液中以成为2mg/ml的浓度的方式添加上述ND[a]~[c],制作试验水溶液[a]~[c]。此处,例如试验水溶液[a]是指,表示以成为2mg/ml的浓度的方式添加有ND[a]的溶菌酶水溶液。
接着,通过测量波长280nm下的吸光度而算出各水溶液中吸附于纳米金刚石颗粒表面的蛋白质(溶菌酶)的量。将其结果示于图18。
图18为示出实验例2中水溶液中存在的溶菌酶的浓度与非特异性地吸附于纳米金刚石颗粒表面的溶菌酶的浓度的关系的图表。图18中,横轴表示添加纳米金刚石颗粒前的初始溶菌酶浓度,纵轴表示吸附于纳米金刚石颗粒表面的溶菌酶浓度。另外,图18中,圆型的图例示出ND[a]的结果,三角型的图例示出ND[b]的结果,方型的图例示出ND[c]的结果。需要说明的是,对于各浓度,进行了多次测定,以误差棒的形式表示结果的标准偏差。另外,图18中的曲线是为了易于理解地表示结果而辅助性地标示的。
根据图18,关于ND[a]和ND[b],明显确认到随着初始溶菌酶浓度增加而溶菌酶向纳米金刚石颗粒表面的非特异性吸附变多的倾向。另一方面,关于ND[c](利用HPG进行了表面修饰的纳米金刚石颗粒),即使初始溶菌酶浓度增加,吸附于纳米金刚石颗粒表面的溶菌酶量也在零(0)附近推移。即,确认到,通过利用HPG对纳米金刚石颗粒进行表面修饰,从而能够抑制靶蛋白质以外的蛋白质(该例子中为溶菌酶)向纳米金刚石颗粒的非特异性吸附。
《靶蛋白质》
作为本实施方式中成为观测对象的靶蛋白质,例如可列举出代谢型谷氨酸受体(以下也记作“mGluR”)等。根据迄今的结构生物学的知识预料到,mGluR在细胞内传达信号时,使2聚体的构象发生了变化。但是,迄今为止没有报道过实际观测了该结构变化的例子。利用本实施方式的荧光分子探针和后述本实施方式的蛋白质的结构分析方法,能够首次观测上述结构变化的可能性高。
[实施方式4]
以下,针对使用了上述荧光分子探针的本实施方式的蛋白质的结构分析方法进行说明。
<蛋白质的结构分析方法>
图21为示出本实施方式的蛋白质的结构分析方法的概要的流程图。如图21所示,本实施方式的蛋白质的结构分析方法为如下的方法:对用本实施方式的荧光分子探针标记了的靶蛋白质照射激发光和1~5GHz的高频磁场,检测荧光光谱减少的峰值磁场频率,从而检测靶蛋白质的结构变化的蛋白质的结构分析方法。即,本实施方式的蛋白质的结构分析方法具备以下的工序:工序S101,用荧光分子探针标记靶蛋白质;以及工序S102,对所标记的靶蛋白质照射激发光和1~5GHz的高频磁场,检测荧光发光量减少的峰值磁场频率,从而检测靶蛋白质的结构变化。
此外,如图9所示,上述峰值磁场频率在静态的外部磁场下分裂,可以由其分裂宽度的大小检测上述荧光分子探针中所含的NV色心的旋转运动,可以追踪靶蛋白质的结构变化。
《利用荧光分子探针进行靶蛋白质的标记的工序S101》
为了用荧光分子探针标记靶蛋白质,首先将靶蛋白质与成为标签的蛋白质(以下也记作“标签蛋白质”)融合。例如,将上述例示的mGluR作为靶时,可以采用细菌来源β-内酰胺酶的变异体(以下也记作“BL标签”)作为标签蛋白质。
例如,通过脂质体转染法将编码mGluR和BL标签的碱基序列而成DNA转染到HeLa细胞内,从而在HeLa细胞内表达mGluR和BL标签融合而成的蛋白质。
此时,作为荧光分子探针,可以使用化学修饰有与BL标签发生特异性反应的Amp的纳米金刚石颗粒。然后,通过介由Amp将BL标签与纳米金刚石颗粒结合,从而可以用纳米金刚石颗粒标记mGluR。
《检测靶蛋白质的结构变化的工序S102》
如上所述,标记了的靶蛋白质的结构分析可以通过利用ODMR测量来检测荧光分子探针中所含的金刚石晶体内的N-V轴的旋转运动而进行。
(N-V轴)
此处,N-V轴是指,表示在金刚石晶体内的NV色心中连接氮原子(N)与相邻的空穴(V)的直线轴。NV色心在该N-V轴上具有磁矩μNV。
(旋转运动的检测)
如图9中示出的ODMR谱那样,纳米金刚石颗粒中所含的NV(-)的ODMR信号因塞曼效应而在静态的外部磁场下分裂成2个。分裂出的2个ODMR信号以约2.87GHz为中心对称。这表示简并的Mz=±1的能级因塞曼效应而分裂为Mz=+1和Mz=-1这样的2个能级。此时,将ODMR信号的分裂宽度设为Δω时,Δω与N-V轴跟静磁场所成的角θ相应地发生变化。
因此,例如可以由图9中示出的ODMR谱中的峰的分裂宽度Δω、利用下述式(II)算出N-V轴与静磁场所成的角θ。
θ=cos-1(hΔω/μNVB0)…(II)
式(II)表示N-V轴矢量与静磁场矢量的内积,式(II)中,θ表示N-V轴与静磁场所成的角,h表示约化普朗克常数,Δω表示ODMR谱的峰的分裂宽度,μNV表示NV色心的磁矩,B0表示静磁场强度。
需要说明的是,此处,峰的分裂宽度Δω在将ODMR谱中的2个荧光发光量的减少峰的各峰顶点的频率设为ω1、ω2(ω1和ω2满足ω1>ω2的关系)时由Δω=ω1-ω2算出。
因此,通过追踪Δω的经时变化,从而能够追踪N-V轴的旋转运动。由此,例如利用使用包含NV(-)的纳米金刚石颗粒而成的荧光分子探针标记了蛋白质的特定部位时,能够追踪该部位的旋转运动,进而变得能够追踪该蛋白质的结构变化。
例如,如上所述用本实施方式的荧光分子探针标记mGluR时,能够实时地测量mGluR的2聚体的构象。
《分析装置》
上述说明的蛋白质的结构分析可以利用如下那样的分析装置来进行。图13为示出本实施方式的蛋白质的结构分析方法的分析装置的一例的示意概念图。若将该分析装置以每种功能进行大致区分,则可以分为光检测部、磁共振部、以及控制部。
光检测部由能进行单分子荧光测量的荧光显微镜构成。例如,如图13所示,可以由光学显微镜10和能进行荧光检测的检测部60构成。此处,检测部60中,作为荧光检测器,使用超高灵敏度且定量性高的雪崩光电二极管或电子倍增型冷却CCD照相机。
磁共振部(高频磁场发生部20)主要由电磁体(未图示)、振荡器21、高频线圈23和静磁场线圈24构成。电磁体可以为50高斯以下,但理想的是能够控制磁场方位。振荡器21需要为能够以纳秒级别控制振荡的高频振荡器。另外,高频线圈23用于使试样发生ESR,静磁场线圈24用于将静磁场变更为任意的方向。
控制部由工作站、转换电路31和调制部30构成。工作站例如可以使用具备处理部40、输入装置50和输出装置51的工作站。另外,转换电路31具体而言为DAC(Digital toAnalog Converter;数字摸拟转换器),调制部30具体而言为脉冲延迟发生器(plus delaygenerator)。
在该分析装置中,光检测部与磁共振部需要使用DAC和脉冲延迟发生器以皮秒~纳秒的精度同步。工作站进行光检测部与磁共振部的配置、以及DAC和脉冲延迟发生器的控制。另外,工作站实时地导入由光检测部检测到的荧光信号,进行递归的装置控制,并且进行测量数据的分析。
测量数据的分析方法没有特别限制,例如可以使用:在由自旋哈密顿参量(spinHamiltonian)的能力固有值模拟的高频率区域光谱与实际得到的测量结果之间通过拟合而进行方位分析的方法;或者,进行ODMR强度的时域信号的频率分析的方法等。
实施例
以下,列举实施例更详细地说明本发明,但本发明不限定于这些。
[实施例1]
以下所示的实施例1、实施例2和比较例1中,使用通过HPHT法得到的纳米金刚石粉末进行ODMR强度的评价。
<包含NV色心的纳米金刚石颗粒的制造>
《准备纳米金刚石颗粒的工序S1》
首先,作为起始原料,准备通过HPHT法得到的纳米金刚石粉末(产品名“Micron+MDA、0-0.10μm”、Element Six公司制造)。
(进行分级的工序S11)
将该纳米金刚石粉末分散在水中,以15000rpm进行20分钟离心,进行金刚石颗粒的分级。关于如此操作而得到的纳米金刚石颗粒的平均粒径,使用激光衍射/散射式粒度分布计(产品名“Microtrac II”、NIKKISO CO.,LTD.制造)利用动态光散射法求出。此时,平均粒径为27.3nm,粒度分布的标准偏差为7.3nm。
(在真空中进行热处理的工序S12)
接着,将通过分级处理而得到的纳米金刚石颗粒在真空中、800℃下进行热处理,在金刚石晶体内生成NV色心。
(在空气中进行热处理的工序S13)
接着,在空气中、550℃下进行热处理,对表面进行氧化。
《进行选择性地提高含杂原子的官能团的修饰率的处理的工序S2》
(进行还原处理的工序S21)
将如上所述操作而得到的纳米金刚石颗粒10mg、硼烷-四氢呋喃复合物(产品名、ALDRICH公司制造)300μl放入到玻璃制反应器中,然后加入四氢呋喃5ml,在氩气气氛下、在70℃下回流,搅拌24小时。接着,去除上清液,用丙酮、超纯水清洗后,进行干燥,得到包含提高了ODMR强度的NV色心的纳米金刚石颗粒。
[实施例2]
在实施例1的包含NV色心的纳米金刚石颗粒的制造中,不实施还原处理,而实施以下的氧化处理,除此之外,与实施例1同样操作,得到包含提高了ODMR强度的NV色心的纳米金刚石颗粒。
《进行氧化处理的工序S22》
将经过空气热处理的纳米金刚石粉末11mg、和将浓硫酸与浓硝酸以体积比9:1混合而成的溶液5ml放入到玻璃制反应器中,在75℃下搅拌72小时。接着,去除上清液,用超纯水进行清洗后,进行干燥,得到纳米金刚石颗粒。
[比较例1]
在实施例1的包含NV色心的纳米金刚石颗粒的制造中,未实施还原处理,除此之外,与实施例1同样操作,得到包含NV色心的纳米金刚石颗粒。
<包含NV色心的纳米金刚石颗粒的评价>
《修饰官能团的定性》
关于如上所述操作而得到的实施例1、实施例2和比较例1的纳米金刚石颗粒的表面上存在的官能团的定性(IR光谱的测定),如以下所述那样进行。此处,关于实施例1或实施例2,将还原处理后或氧化处理后的纳米金刚石颗粒作为试样。另一方面,关于比较例1的纳米金刚石颗粒,将真空热处理后且空气热处理前的纳米金刚石颗粒作为试样。这是因为,在空气热处理后进行IR测定时,由于因石墨的氧化而生成的杂质物质,测定的精度会降低。
首先,在溴化钾的粉末中加入包含极少量的纳米金刚石颗粒的粉末,进行混合制成均匀粉末后,将该混合粉末放入到成型模具中,进行压制,制成盘状的测定试样。接着,使用傅立叶变换红外光谱测定装置(型号“FT/IR-4200”、日本分光株式会社制造),测定各测定试样的IR光谱。将其结果示于图10。
图10中,“N.D-CH2OH”表示实施例1的纳米金刚石颗粒的IR光谱,“N.D-COOH”表示实施例2的纳米金刚石颗粒的IR光谱,“N.D”表示比较例1的纳米金刚石颗粒的IR光谱。
如图10所示,对于比较例1的纳米金刚石颗粒,观测到源自烷基、酮基、醚基、羟基、乙烯基、内酯基等多种官能团的峰。另一方面,对于实施例1(还原处理)的纳米金刚石颗粒,能够观测到源自羟基烷基的峰(1258cm-1、2956-2927cm-1),源自其它官能团的峰与比较例1(未处理)相比相对地减少。另外,关于实施例2(氧化处理)的纳米金刚石颗粒,能够明显地观测到源自羧基的峰(1778cm-1),源自其它官能团的峰与比较例1(未处理)相比相对地减少。即,确认到实施例1的纳米金刚石颗粒的表面被羟基和/或羟基烷基修饰,实施例2的纳米金刚石颗粒的表面被羧基修饰。
《ODMR强度和NV(-)存在率的评价》
接着,如以下所述那样评价实施例1、实施例2和比较例1的ODMR强度。
首先,使用图11,说明ODMR强度的评价所使用的荧光显微镜装置。该荧光显微镜装置具备:光学显微镜10、高频磁场发生部20、调制部30、处理部40、输入装置50、以及输出装置51。进而,光学显微镜10具备:光源11、激发滤波器12、分光镜13、带通滤波器(bandfilter)14、以及物镜15。进而,高频磁场发生部20具备:振荡器21、放大部22、以及高频线圈23。需要说明的是,该装置中设置转换电路31和用于将静磁场变更为任意方向的静磁场线圈24时,成为与前文说明的蛋白质的结构分析所使用的分析装置(参见图13)同样的装置。
自光源11发出的光通过激发滤波器12而成为激发光。激发光被分光镜13反射,通过物镜15而照射于试样台70。自被激发光激发的试样71产生的荧光不会被分光镜13反射,而直接向检测部60行进,从而测量荧光发光量。另外,对于试样71利用高频磁场发生部20照射高频磁场。通过照射高频磁场,使试样71发生ESR,用检测部60测量此时的荧光发光量的变化,从而能够利用处理部40根据上述式(I)算出ODMR强度。
首先,在上述荧光显微镜装置的试样台上,将包含实施例1的纳米金刚石颗粒的粉末试样悬浮在水中,并涂布于载玻片。对该试样照射激发光,在输出装置51的画面上确认到由纳米金刚石颗粒的荧光发光造成的亮点。接着,照射高频磁场,减少荧光发光量,测量ODMR强度。对100个颗粒进行同样的测量。
与上述同样操作,针对实施例2和比较例1的纳米金刚石颗粒,也测定100个颗粒的ODMR强度。将其结果示于表1以及图14和图15。
[表1]
表1的测定结果的栏中示出的各数值表示100个颗粒中ODMR强度为一定值以上(0.01以上、0.02以上、0.05以上)的颗粒的累积度数(%)、以及针对100个颗粒的ODMR强度的算术平均值。
另外,图14为示出针对100个颗粒的ODMR强度的测定结果的图表,示出自ODMR强度高的颗粒将颗粒降序排列的结果。图14中,实线表示实施例1的结果,点划线表示实施例2的结果,点线表示比较例1的结果。
另外,图15为示出ODMR强度与颗粒的存在概率的关系的图表,将具有横轴所示的ODMR强度的数值以上的ODMR强度的颗粒的存在概率表示于纵轴。图15中,圆型的图例和实线表示实施例1的结果,三角型的图例和点划线表示实施例2的结果,方型的图例和点线表示比较例1的结果。需要说明的是,图15的横轴的数值以100倍来表示。
由表1以及图14和图15明显可知,与未处理的比较例1的纳米金刚石颗粒相比,实施例1和实施例2的纳米金刚石颗粒包含大量具有高ODMR强度的颗粒。特别是实施例1的纳米金刚石颗粒包含具有ODMR强度为0.05以上这样极高的ODMR强度的颗粒,这样的颗粒在比较例的纳米金刚石颗粒中完全不存在。
由以上的结果可以确认到,通过实施例的纳米金刚石颗粒包含NV色心,利用含杂原子的官能团修饰了表面,从而NV(-)的存在率增加,提高了ODMR强度。
[实施例3]
以下示出的实施例3和比较例2中,使用通过爆轰法得到的纳米金刚石粉末进行ODMR强度的评价。
首先,准备通过爆轰法得到的纳米金刚石粉末(“NanoAmando(注册商标)Aqueouscolloid(Dispersed 5nm-Bucky Diamond)”、NanoCarbon Research Institute,Ltd.制造)。该纳米金刚石粉末中所含的颗粒为单一颗粒,其粒径的范围为4nm~5nm左右。
接着,除了未进行对纳米金刚石粉末进行分级的工序S11之外,与实施例1同样操作,得到实施例3的纳米金刚石颗粒。
[比较例2]
将上述通过爆轰法得到的纳米金刚石粉末在真空中、800℃下进行热处理,接着在空气中、550℃下进行热处理,从而得到比较例2的纳米金刚石颗粒。即,比较例2的纳米金刚石颗粒是除了未进行还原处理之外与实施例3同样操作而得到的。
《ODMR强度的评价》
对于如上所述操作而得到的实施例3和比较例2的纳米金刚石颗粒的ODMR强度,使用前述荧光显微镜(参见图11)来进行评价。将结果示于图19和图20以及表2。
[表2]
表2中的荧光发光量和ODMR强度的栏中示出的数值为图19(实施例3)和图20(比较例2)中示出的视场图像中的荧光发光量和ODMR强度。图19的(A)所示的图像示出了实施例3的纳米金刚石颗粒的荧光像。如图19的(A)所示,该视场图像中可以确认到3个由纳米金刚石颗粒的荧光发光造成的亮点。另外,图19的(B)示出同视场中的ODMR像。图19的(B)中明显确认到与图19的(A)的亮点相对应的3个亮点。因此,实施例3的纳米金刚石颗粒为ODMR活性。
另一方面,图20的(A)为比较例2的纳米金刚石颗粒的荧光像,图20的(B)为相同的纳米金刚石颗粒的ODMR像。图20的(A)中可以确认到由纳米金刚石颗粒的荧光发光造成的亮点,但图20的(B)中无法确认到亮点。因此,比较例2的纳米金刚石颗粒为ODMR非活性。
由以上的结果可以确认到,即使是通过爆轰法得到的金刚石颗粒,通过利用含杂原子的官能团修饰表面,从而NV(-)的存在率也会增加,提高了ODMR强度。
如上所述对本发明的实施方式和实施例进行了说明,但将上述各实施方式和实施例的技术特征适当组合也是从一开始就预计了的。
本次公开的实施方式和实施例在各方面上均为例示,不应被视为限定性的解释。本发明的范围由权利要求书而非上述说明来表示,意图包含与权利要求书等同的意思和范围内的所有变更。
附图标记说明
1碳原子、2氮原子、3空穴、4氮原子的非共享电子、5多余的电子、6碳原子的不成对电子、10光学显微镜、11光源、12激发滤波器、13分光镜、14带通滤波器、15物镜、20高频磁场发生部、21振荡器、22放大部、23高频线圈、24静磁场线圈、30调制部、31转换电路、40处理部、50输入装置、51输出装置、60检测部、70试样台、71试样、100纳米金刚石颗粒、101荧光分子探针。
Claims (11)
1.一种包含提高了光检测磁共振强度的NV色心的纳米金刚石颗粒,其利用给电子性官能团修饰了表面,
所述光检测磁共振强度为照射1~5GHz的高频磁场时的、由激发光造成的荧光发光量的减少率,所述荧光发光量的减少率为0.01以上。
2.根据权利要求1所述的包含提高了光检测磁共振强度的NV色心的纳米金刚石颗粒,其中,所述给电子性官能团为羟基和羟基烷基中的至少任一种。
3.根据权利要求1所述的包含提高了光检测磁共振强度的NV色心的纳米金刚石颗粒,其中,所述纳米金刚石颗粒的平均粒径为1nm以上且50nm以下。
4.一种包含权利要求1~权利要求3中任一项所述的包含提高了光检测磁共振强度的NV色心的纳米金刚石颗粒的粉末状试剂、或者将所述纳米金刚石颗粒分散于液体而成的试剂。
5.一种包含提高了光检测磁共振强度的NV色心的纳米金刚石颗粒的制造方法,所述光检测磁共振强度为照射1~5GHz的高频磁场时的、由激发光造成的荧光发光量的减少率,所述荧光发光量的减少率为0.01以上,
所述制造方法包括以下的工序:
准备纳米金刚石颗粒的工序;以及
进行选择性地提高所述纳米金刚石颗粒的表面上存在的官能团中的1种以上的给电子性官能团的修饰率的处理的工序。
6.根据权利要求5所述的包含提高了光检测磁共振强度的NV色心的纳米金刚石颗粒的制造方法,其中,所述给电子性官能团为羟基和羟基烷基中的至少任一种,并且进行所述处理的工序为进行还原处理的工序。
7.一种荧光分子探针,其中,对权利要求1~权利要求3中任一项所述的包含提高了光检测磁共振强度的NV色心的纳米金刚石颗粒进行了化学修饰。
8.根据权利要求7所述的荧光分子探针,其中,利用超支化聚甘油进行了化学修饰。
9.一种包含权利要求7所述的荧光分子探针的粉末试剂、或者将所述荧光分子探针分散于液体而成的试剂。
10.一种蛋白质的结构分析方法,其具备以下的工序:
利用权利要求7所述的荧光分子探针标记靶蛋白质的工序;以及
对所标记的所述靶蛋白质照射激发光和1~5GHz的高频磁场,检测荧光发光量减少的峰值磁场频率,从而检测所述靶蛋白质的结构变化的工序。
11.根据权利要求10所述的蛋白质的结构分析方法,其中,所述检测的工序中,所述峰值磁场频率在静态的外部磁场下分裂,
所述检测的工序包括根据所述峰值磁场频率的分裂宽度的大小检测所述荧光分子探针中所含的NV色心的旋转运动的工序。
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