WO2014058012A1 - ナノダイヤモンド粒子およびその製造方法ならびに蛍光分子プローブおよびタンパク質の構造解析方法 - Google Patents

ナノダイヤモンド粒子およびその製造方法ならびに蛍光分子プローブおよびタンパク質の構造解析方法 Download PDF

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nanodiamond
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進悟 外間
龍治 五十嵐
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Definitions

  • NMR nuclear magnetic resonance
  • fluorescent molecule observation methods using a fluorescence microscope and the like have been mainly used for protein structure analysis.
  • the NMR method enables noninvasive measurement and has a high spatial resolution at the atomic level, so that it can collect a lot of information on the three-dimensional structure.
  • real-time observation was difficult because of low sensitivity and low time resolution.
  • Fluorescence at the NV center has little fluorescence discoloration and blinking and is highly adaptable to fluorescence analysis.
  • nanodiamond particles are composed of carbon atoms, they are considered to have extremely low toxicity to living organisms, and because the chemical modification of the particle surface for labeling target proteins is easy, fluorescence used in vivo Promising as a molecular probe.
  • ODMR measurement of nanodiamond particles including the NV center as described above is performed and displayed in two-dimensional coordinates with the amount of fluorescent light emission on the vertical axis and the magnetic field frequency on the horizontal axis, a decrease peak of fluorescent light emission occurs in a specific high-frequency magnetic field.
  • the spectrum displayed on the two-dimensional coordinates is also referred to as an “ODMR spectrum”, and the above-described decrease peak is also referred to as an “ODMR signal”.
  • nanodiamond particles including an NV center having an extremely high ODMR strength are required.
  • the ODMR intensity of nanodiamond particles including an NV center is not sufficient for stable measurement in vivo, and a protein structure analysis method as described above has not yet been established. And until now, there has been no report on a method for increasing the ODMR intensity of nanodiamond particles including an NV center.
  • the present invention has been made in view of such a current situation, and an object of the present invention is to provide nanodiamond particles containing NV centers with enhanced ODMR intensity, and fluorescent molecules obtained by chemically modifying the nanodiamond particles An object of the present invention is to provide a novel protein structure analysis method using a probe.
  • the ODMR strength of the NV center existing inside the particles is increased by modifying the particle surface with a specific functional group.
  • the functional group containing a hetero atom is preferably an electron donating functional group.
  • the functional group containing a hetero atom is preferably at least one of a hydroxyl group and a hydroxyalkyl group.
  • the functional group containing a hetero atom may be a carboxyl group.
  • the nanodiamond particles preferably have an average particle size of 1 nm to 50 nm.
  • the ODMR intensity indicates the rate of decrease in the amount of fluorescence emitted by excitation light when a high frequency magnetic field of 1 to 5 GHz is irradiated.
  • nanodiamond particles of the present invention include a powdered reagent composed of nanodiamond particles and a reagent in which nanodiamond particles are dispersed in a liquid.
  • the present invention also relates to a protein structure analysis method, which irradiates the target protein labeled with the above-described fluorescent molecular probe with excitation light and a high frequency magnetic field of 1 to 5 GHz so that the amount of fluorescence emission is increased.
  • This is a protein structure analysis method for detecting a structural change of the target protein by detecting a decreasing peak magnetic field frequency. That is, the structural analysis method includes a step of labeling a target protein with a fluorescent molecular probe, and irradiating the labeled target protein with excitation light and a high frequency magnetic field of 1 to 5 GHz to detect a peak magnetic field frequency at which the amount of fluorescence emission decreases. And detecting the structural change of the target protein.
  • the peak magnetic field frequency is split under a static external magnetic field, and the rotational motion of the NV center included in the fluorescent molecular probe can be detected from the split width.
  • the nanodiamond particles of the present invention exhibit extremely high ODMR strength. Therefore, it can be used as a fluorescent molecular probe in a living body, and by using this, there is a possibility that fine and real-time structural analysis of a protein in the living body can be realized.
  • FIG. 4 is a flowchart illustrating a method for producing nanodiamond particles including an NV center with enhanced ODMR intensity according to an embodiment of the present invention. It is a schematic conceptual diagram which shows the analyzer concerning the protein structure analysis method of embodiment of this invention. It is a graph which shows the example of a measurement of the ODMR intensity
  • FIG. 20A is a diagram showing a fluorescent image of conventional nanodiamond particles
  • FIG. 20B is a diagram showing an ODMR image of conventional nanodiamond particles. It is a flowchart which shows the outline of the structure-analysis method of the protein which concerns on embodiment of this invention.
  • the nanodiamond particles of the present embodiment have a surface modified with a functional group containing a hetero atom, and include an NV center with an increased ODMR intensity.
  • the manufacturing method of the nano diamond powder used as a raw material is not particularly limited, and may be manufactured by any method.
  • Examples of the method for producing the nanodiamond powder include a CVD method (chemical vapor deposition method), an explosion method (detonation method), and a high temperature high pressure method (HPHT method).
  • the average particle diameter of nanodiamond particles is preferably as small as possible, preferably 50 nm or less, more preferably 40 nm or less, and most preferably 30 nm or less. If the average particle size exceeds 50 nm, the dispersibility tends to decrease, which is not preferable. As described above, the average particle size is preferably as small as possible, but is preferably 1 nm or more from the viewpoint of having an NV center and ensuring high crystallinity. As described above, the nanodiamond powder obtained by the detonation method can have a particle size range of about 4 to 5 nm.
  • the nanodiamond powder obtained by the detonation method is particularly suitable as a raw material for the nanodiamond particles of the present embodiment.
  • the “average particle diameter” can be measured by, for example, a dynamic light scattering method, a laser diffraction method, or the like.
  • the nanodiamond particles of the present embodiment include NV centers with increased ODMR strength.
  • the NV center indicates a composite defect composed of a nitrogen atom 2 substituting the carbon atom 1 in the diamond crystal and a vacancy 3 adjacent to the nitrogen atom 2.
  • the nitrogen atoms 2 and the vacancies 3 can be bonded by heat-treating the nanodiamond powder at a high temperature of 700 ° C. to 1000 ° C. in vacuum. As a result, the NV center shown in FIG. 1 is generated in the diamond crystal.
  • NV ( ⁇ ) and NV (0) As described above, nanodiamond particles in which an NV center is generated inside a diamond crystal emits fluorescence when irradiated with excitation light. When the diamond particles are simultaneously irradiated with excitation light and a high-frequency magnetic field to generate electron spin magnetic resonance (hereinafter also referred to as “ESR (Electron Spin Resonance)”), the amount of fluorescent light emission may decrease.
  • ESR Electro Spin Resonance
  • This phenomenon is caused by the presence of NV ( ⁇ ) in the NV center that forms a spin state that does not emit fluorescence when ESR occurs.
  • NV ⁇
  • the ground state of the NV center is the spin triplet ( 3 A), and the excited state is the spin triplet ( 3 E).
  • An energy gap corresponding to a wavelength of 637 nm exists between ( 3 A) and ( 3 E).
  • a spin singlet ( 1 A 1 ) exists between ( 3 A) and ( 3 E).
  • NV ( ⁇ ) has acquired an extra electron 5 in the hole 3 adjacent to the nitrogen atom 2.
  • the ODMR intensity can be increased if the abundance of NV ( ⁇ ) in the NV center can be increased.
  • the present inventors have modified the surface of the nanodiamond particles with a specific functional group.
  • the present inventors have found that the abundance ratio of (-) can be increased and the ODMR intensity can be remarkably increased, and the present invention has been completed.
  • the nanodiamond particles of the present embodiment are nanodiamond particles whose surface has been modified with a functional group containing a heteroatom to increase the ODMR strength of the NV center.
  • a hetero atom refers to an atom other than carbon (C) and hydrogen (H), and an atom having an unshared electron pair on the atom in a functional group.
  • heteroatoms include oxygen (O), nitrogen (N), sulfur (S), and the like.
  • the functional group containing a hetero atom include a hydroxyl group (—OH), a hydroxyalkyl group (—CH 2 OH, —ROH: R represents an alkyl group), a carboxyl group (—COOH), and an amino group.
  • the functional group containing a hetero atom is preferably an electron donating functional group.
  • the “electron donating property” indicates an electron donating property by a resonance effect caused by an unshared electron pair on the hetero atom.
  • NV (-) By modifying the surface of the nanodiamond particles with a functional group containing an electron-donating heteroatom, the generation of NV (-) can be promoted.
  • a hydroxyl group, a hydroxyalkyl group, and a carboxyl group are preferable as the modified functional group because the effects of the present invention are easily obtained.
  • the carboxyl group is a functional group having an electron-withdrawing property.
  • the presence rate of NV ( ⁇ ) can be increased. It is clear.
  • the nanodiamond particles of the present embodiment can be produced by performing a treatment for selectively increasing the modification rate of a functional group containing one or more heteroatoms among such functional groups.
  • the functional group containing a hetero atom is preferably one or more functional groups selected from the group consisting of a hydroxyl group, a hydroxyalkyl group and a carboxyl group.
  • a method of reducing and / or oxidizing a functional group present on the surface of the nanodiamond particles can be suitably used.
  • the modification rate of the nanodiamond particle surface with a hydroxyl group and / or a hydroxyalkyl group can be selectively increased. it can.
  • Any conventionally known reduction reaction can be employed as the reduction treatment method.
  • the reduction treatment may be performed using a borane-tetrahydrofuran mixed solution, lithium aluminum hydride, sodium borohydride, Fenton reagent or the like as the reducing agent.
  • the treatment may be an oxidation treatment.
  • the modification rate of the nanodiamond particle surface by the carboxyl group can be selectively increased.
  • any conventionally known oxidation reaction can be employed.
  • the oxidizing treatment may be performed using a mixed solution of concentrated sulfuric acid and concentrated nitric acid, a piranha solution, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid mixed solution, or the like as the oxidizing agent.
  • the evaluation of the ODMR intensity can be performed by irradiating nanodiamond particles with an excitation light and irradiating a high-frequency magnetic field that generates ESR to measure the amount of fluorescence emission and calculating the ODMR intensity by the above formula (I). .
  • the nanodiamond particles of the present embodiment have a high ODMR intensity.
  • the nanodiamond particles preferably do not contain a rare earth metal (for example, ytterbium (Yb), erbium (Er), thulium (Tm), etc.) inside the crystal. This is because when a rare earth metal is introduced into the crystal, the diamond crystal lattice is distorted and the ODMR intensity may be reduced. Further, it is preferable that the diamond crystal does not contain magnetic elements (for example, manganese (Mn), iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), copper (Cu), etc.)). This is because the magnetic field generated by these magnetic elements may adversely affect the ODNR intensity measurement.
  • Mn manganese
  • Fe iron
  • Ni nickel
  • Co cobalt
  • Cu copper
  • the carbon constituting the diamond crystal those existing in nature can be used without any particular limitation.
  • Such nanodiamond particles of the present embodiment are manufactured by the following manufacturing method.
  • the nanodiamond particles manufactured by the following manufacturing method exhibit the above characteristics. Therefore, the nanodiamond particles of the present embodiment have an excellent effect of exhibiting extremely high ODMR strength.
  • the manufacturing method of the nano diamond particle of this embodiment is demonstrated.
  • FIG. 12 shows a flowchart of the method for producing nanodiamond particles of the present embodiment.
  • the manufacturing method includes a step S1 of preparing nanodiamond particles and a step S2 of selectively increasing the modification rate of a functional group containing one or more heteroatoms among functional groups present on the surface of the nanodiamond particles. And including.
  • each step will be described.
  • step S1 for preparing nanodiamond particles First, in step S1, step S11 for classifying nanodiamond powder, step S12 for heat-treating nanodiamond particles in vacuum, and step S13 for heat-treating nanodiamond particles in air are performed. By performing step S11, the nanodiamond particles are adjusted to a particle size distribution suitable for use in vivo, and by performing step S12, NV centers are generated inside the nanodiamond particles. Furthermore, by carrying out step S13, the graphite layer on the surface of the nanodiamond particles can be oxidized to produce nanodiamond particles containing NV centers exhibiting fluorescence. In addition, when using the diamond powder obtained by the detonation method as mentioned above, the classification process can be omitted.
  • the other step may include, for example, a step of drying the nanodiamond particles after step S2.
  • a step of drying the nanodiamond particles after step S2 it is desirable to perform freeze-drying when drying the nanodiamond particles with surface modification. This is because freeze-drying can prevent nanodiamond particles from aggregating into clusters.
  • drying under reduced pressure is not preferable because nanodiamond particles aggregate and form clusters.
  • the particle diameter is preferably small as described above. And it is especially preferable that the nano diamond particle of this embodiment is not an aggregate but a single particle. The reason is as follows.
  • the NV axis rotational motion is tracked by tracking the angle between the NV axis vector in the nanodiamond particles and the external magnetic field (static magnetic field) vector.
  • the NV center in the diamond crystal has four NV axes. Therefore, when an aggregate of nanodiamond particles is used as a fluorescent molecular probe, a plurality of nanodiamond particles are present in a short distance in various directions (angles) in the aggregate, so that a plurality of NV axes are also present. Various orientations will occur and the resolution of the ODMR signal will be reduced. Therefore, the nanodiamond particles of the present embodiment are preferably single particles, and it is preferable to employ a process that does not generate aggregates in the manufacturing method.
  • the fluorescent molecular probe of this embodiment can be obtained by chemically modifying nanodiamond particles containing NV centers with increased ODMR intensity.
  • nanodiamond particles having an ODMR intensity of 0.02 or more are preferable among the nanodiamond particles of the present embodiment, and the ODMR intensity is 0.
  • Nano diamond particles of 0.05 or more are more preferable, and nano diamond particles having an ODMR intensity of 0.10 or more are particularly preferable.
  • chemical modification indicates that a molecular chain that specifically binds to a target protein is chemically bonded to nanodiamond.
  • the molecular chain may be directly bonded to the carbon atom forming the diamond crystal, or may be bonded to a functional group on the nanodiamond particle surface.
  • the molecular chain is preferably selected as appropriate according to the target protein (also referred to as target protein).
  • target protein also referred to as target protein.
  • ampicillin hereinafter sometimes abbreviated as “Amp” or the like can be used.
  • FIG. 16 shows an example of a synthesis scheme of the fluorescent molecular probe of the present embodiment.
  • the fluorescent molecular probe of this embodiment can be synthesized according to the following procedures (i) to (iii). That is, in the fluorescent molecular probe 101 of this embodiment, (i) the surface of the nanodiamond particle 100 is modified with, for example, a hydroxyl group to increase the ODMR intensity, and (ii) a molecular chain that inhibits non-specific adsorption is a hydroxyl group. (Iii) and further modified with a molecular chain that specifically binds to the target protein.
  • FIG. 16 shows an example in which HPG is employed as a molecular chain that inhibits non-specific adsorption and Amp is employed as a molecular chain that specifically binds to a target protein.
  • nanodiamond particles were modified with hydroxyl groups to enhance the ODMR intensity.
  • molecular chains shown in the following [a] to [c] were bonded to the nanodiamond particles (that is, surface-modified with the molecular chains) to obtain surface-modified nanodiamond particles.
  • Example 1 In Experimental Example 1, nonspecific adsorption of nanodiamond particles to the cell surface was evaluated.
  • each of the above test cell lines was cultured for 2 hours and then washed with physiological saline. Then, the nanodiamond particles adsorbed on the cells contained in each test cell line were observed with a bright field microscope to confirm the presence or absence of nonspecific adsorption of the nanodiamond particles to the cell membrane. The result is shown in FIG.
  • FIG. 17 is an observation field image obtained by observing each test cell line at a magnification of 10 times using a bright field microscope, and an observation field image obtained by observing each test cell line at a magnification of 40 times.
  • “a. ND-COOH” indicates the test cell line [a]
  • “b. ND-PEG” indicates the test cell line [b]
  • “c. ND-HPG” indicates the test cell line [ c]
  • “d.ND-HPG” indicates the test cell line [d].
  • E.control indicates a control cell, that is, a cell line to which no nanodiamond particles are added.
  • test aqueous solutions [a] to [c] were added to a lysozyme aqueous solution to a concentration of 2 mg / ml to prepare test aqueous solutions [a] to [c].
  • the test aqueous solution [a] indicates an lysozyme aqueous solution added so that ND [a] has a concentration of 2 mg / ml.
  • FIG. 18 is a graph showing the relationship between the concentration of lysozyme present in an aqueous solution and the concentration of lysozyme adsorbed nonspecifically on the surface of nanodiamond particles in Experimental Example 2.
  • the horizontal axis indicates the initial lysozyme concentration before adding the nanodiamond particles
  • the vertical axis indicates the lysozyme concentration adsorbed on the surface of the nanodiamond particles.
  • the round legend shows the result at ND [a]
  • the triangular legend shows the result at ND [b]
  • the square legend shows the result at ND [c].
  • the measurement is performed several times for each concentration, and the standard deviation of the result is displayed as an error bar.
  • the curve in FIG. 18 is supplementarily attached to display the result in an easy-to-understand manner.
  • ND [a] and ND [b] tended to increase nonspecific adsorption of lysozyme to the surface of nanodiamond particles as the initial lysozyme concentration increased.
  • ND [c] nanodiamond particles surface-modified with HPG
  • the amount of lysozyme adsorbed on the surface of nanodiamond particles was maintained in the vicinity of zero (0) even when the initial lysozyme concentration was increased. It was. That is, it was confirmed that nonspecific adsorption of proteins other than the target protein (lysozyme in this example) to the nanodiamond particles can be inhibited by surface-modifying the nanodiamond particles with HPG.
  • target proteins to be observed in the present embodiment include metabotropic glutamate receptors (hereinafter also referred to as “mGluR”). From the knowledge of structural biology so far, it is expected that mGluR changes the conformation of the dimer when transmitting a signal in the cell. However, no examples of actual observation of this structural change have been reported so far. According to the fluorescent molecular probe of the present embodiment and the protein structure analysis method of the present embodiment described later, there is a high possibility that the structural change can be observed for the first time.
  • mGluR metabotropic glutamate receptors
  • FIG. 21 is a flowchart showing an outline of the protein structure analysis method of the present embodiment.
  • the target protein labeled with the fluorescent molecular probe of this embodiment is irradiated with excitation light and a high frequency magnetic field of 1 to 5 GHz to reduce the fluorescence spectrum.
  • This is a protein structure analysis method for detecting a structural change of a target protein by detecting a peak magnetic field frequency.
  • the peak magnetic field frequency is split under a static external magnetic field, and the rotational motion of the NV center included in the fluorescent molecular probe is detected from the split width. And can track the structural changes of the target protein.
  • Step S101 of labeling target protein with fluorescent molecular probe In order to label a target protein with a fluorescent molecular probe, first, the target protein and a protein to be a tag (hereinafter also referred to as “tag-protein”) are fused. For example, when mGluR exemplified above is targeted, a mutant of ⁇ -lactamase derived from bacteria (hereinafter also referred to as “BL tag”) can be employed as a tag-protein.
  • BL tag a mutant of ⁇ -lactamase derived from bacteria
  • a protein in which mGluR and BL tags are fused can be expressed in HeLa cells.
  • nanodiamond particles obtained by chemically modifying Amp that specifically reacts with the BL tag can be used as the fluorescent molecular probe.
  • mGluR can be labeled with nanodiamond particles by binding the BL tag and nanodiamond particles via Amp.
  • Step S102 of detecting structural change of target protein can be performed by detecting the rotational movement of the NV axis in the diamond crystal contained in the fluorescent molecular probe by ODMR measurement.
  • the NV axis indicates a linear axis that connects the nitrogen atom (N) and the adjacent hole (V) at the NV center in the diamond crystal.
  • the NV center has a magnetic moment ⁇ NV on the NV axis.
  • the ODMR signal of NV ( ⁇ ) contained in the nanodiamond particles is split into two under a static external magnetic field due to the Zeeman effect.
  • the split width of the ODMR signal is ⁇ , ⁇ changes corresponding to the angle ⁇ formed by the NV axis and the static magnetic field.
  • the angle ⁇ formed by the NV axis and the static magnetic field can be calculated by the following formula (II).
  • the conformation of the dimer of mGluR can be measured in real time.
  • FIG. 13 is a schematic conceptual diagram showing an example of an analysis apparatus according to the protein structure analysis method of the present embodiment.
  • this analysis device When this analysis device is roughly classified according to function, it can be divided into a light detection unit, a magnetic resonance unit, and a console unit.
  • the magnetic resonance unit (high-frequency magnetic field generation unit 20) mainly includes an electromagnet (not shown), an oscillator 21, a high-frequency coil 23, and a static magnetic field coil 24.
  • the electromagnet may be 50 gauss or less, but it is desirable that the magnetic field orientation can be controlled.
  • the oscillator 21 needs to be a high-frequency oscillator that can control oscillation at the nanosecond level.
  • the high frequency coil 23 is for causing ESR in the sample, and the static magnetic field coil 24 is for changing the static magnetic field in an arbitrary direction.
  • the console unit includes a workstation, a conversion circuit 31 and a modulation unit 30.
  • a workstation including a processing unit 40, an input device 50, and an output device 51 can be used.
  • the conversion circuit 31 is specifically a DAC (Digital-to-Analog-Converter), and the modulation unit 30 is specifically a pulse / delay generator.
  • the light detection unit and the magnetic resonance unit must be synchronized with picosecond to nanosecond accuracy using a DAC and a pulse / delay generator.
  • the workstation performs setting of the light detection unit and the magnetic resonance unit, and control of the DAC and the pulse / delay generator.
  • the workstation captures fluorescent signals detected by the light detection unit in real time, performs recursive device control, and analyzes measurement data.
  • the analysis method of the measurement data is not particularly limited. For example, a method of performing azimuth analysis by fitting between the high frequency region spectrum simulated from the energy eigenvalue of the spin Hamiltonian and the actually obtained measurement result, or the ODMR intensity A method for performing frequency analysis of a time domain signal can be used.
  • Example 1 In Example 1, Example 2 and Comparative Example 1 shown below, the ODMR strength was evaluated using nanodiamond powder obtained by the HPHT method.
  • Nanodiamond powder product name “Micron + MDA, 0-0.010 ⁇ m”, manufactured by Element Six
  • HPHT method was prepared as a starting material.
  • the nano diamond powder was dispersed in water and centrifuged at 15000 rpm for 20 minutes to classify the diamond particles.
  • the average particle size of the nanodiamond particles thus obtained was determined by a dynamic light scattering method using a laser diffraction / scattering particle size distribution meter (product name “Microtrac II”, manufactured by Nikkiso Co., Ltd.). At this time, the average particle size was 27.3 nm, and the standard deviation of the particle size distribution was 7.3 nm.
  • Step S13 of heat treatment in air Next, the surface was oxidized by heat treatment at 550 ° C. in air.
  • Step S2 of performing treatment for selectively increasing the modification rate of a functional group containing a hetero atom
  • 10 mg of the nanodiamond particles obtained as described above and 300 ⁇ l of borane-tetrahydrofuran complex product name, manufactured by ALDRICH
  • 5 ml of tetrahydrofuran was added, and the atmosphere was 70 ° C. under an argon atmosphere. Refluxed and stirred for 24 hours.
  • the supernatant was removed, washed with acetone and ultrapure water, and then dried to obtain nanodiamond particles containing NV centers with enhanced ODMR strength.
  • Example 2 In the production of nanodiamond particles including the NV center of Example 1, the reduction center was not performed, and the following oxidation treatment was performed, and the NV center with an increased ODMR strength was included in the same manner as in Example 1. Nano diamond particles were obtained.
  • Step S22 of performing oxidation treatment >> 11 mg of nanodiamond powder subjected to air heat treatment and 5 ml of a solution in which concentrated sulfuric acid and concentrated nitric acid were mixed at a volume ratio of 9: 1 were placed in a glass reactor and stirred at 75 ° C. for 72 hours. Next, the supernatant was removed, washed with ultrapure water, and dried to obtain nanodiamond particles.
  • Example 1 In the production of nanodiamond particles containing an NV center in Example 1, nanodiamond particles containing an NV center were obtained in the same manner as in Example 1 except that no reduction treatment was performed.
  • a powder consisting of a very small amount of nanodiamond particles is added to a powder of potassium bromide and mixed to obtain a uniform powder. Then, the mixed powder is put into a mold and pressed to obtain a disk-shaped measurement sample. . Next, the IR spectrum of each measurement sample was measured using a Fourier transform infrared spectrometer (model number “FT / IR-4200”, manufactured by JASCO Corporation). The result is shown in FIG.
  • ND.CH 2 OH represents the IR spectrum of the nanodiamond particles of Example 1
  • ND.COOH represents the IR spectrum of the nanodiamond particles of Example 2
  • N. .D shows the IR spectrum of the nanodiamond particles of Comparative Example 1.
  • the fluorescence microscope apparatus includes an optical microscope 10, a high-frequency magnetic field generation unit 20, a modulation unit 30, a processing unit 40, an input device 50, and an output device 51. Further, the optical microscope 10 includes a light source 11, an excitation filter 12, a dichroic mirror 13, a band filter 14, and an objective lens 15. Furthermore, the high frequency magnetic field generation unit 20 includes an oscillator 21, an amplification unit 22, and a high frequency coil 23. If the conversion circuit 31 and the static magnetic field coil 24 for changing the static magnetic field in an arbitrary direction are provided in this apparatus, the apparatus is the same as the analysis apparatus (see FIG. 13) used for the protein structural analysis described above. Become.
  • the light emitted from the light source 11 passes through the excitation filter 12 and becomes excitation light.
  • the excitation light is reflected by the dichroic mirror 13 and irradiated onto the sample stage 70 through the objective lens 15.
  • the fluorescence generated from the sample 71 excited by the excitation light is not reflected by the dichroic mirror 13 but goes straight to the detection unit 60 to measure the fluorescence emission amount.
  • the sample 71 is irradiated with a high-frequency magnetic field from the high-frequency magnetic field generator 20. By irradiating the high frequency magnetic field, ESR is generated in the sample 71, and the change in the fluorescence emission amount at that time is measured by the detection unit 60, so that the processing unit 40 can calculate the ODMR intensity by the above formula (I). It has become.
  • a powder sample composed of nanodiamond particles of Example 1 was suspended in water on a sample stage of the fluorescence microscope apparatus described above and applied to a slide glass.
  • the sample was irradiated with excitation light, and bright spots due to fluorescence emission of the nanodiamond particles were confirmed on the screen of the output device 51.
  • the ODMR intensity was measured by irradiating a high-frequency magnetic field to reduce the amount of fluorescence emission. The same measurement was performed on 100 particles.
  • Each numerical value shown in the column of measurement results in Table 1 is the cumulative frequency (%) of particles having an ODMR intensity of 100 particles or more (0.01 or more, 0.02 or more, 0.05 or more), The ODMR intensity arithmetic average value for 100 particles is shown.
  • FIG. 15 is a graph showing the relationship between the ODMR intensity and the existence probability of the particles, and the existence probability of particles having an ODMR intensity equal to or greater than the numerical value of the ODMR intensity shown on the horizontal axis is displayed on the vertical axis.
  • the round legend and the solid line show the results of Example 1
  • the triangular legend and the alternate long and short dash lines show the results of Example 2
  • the square legend and dotted lines show the results of Comparative Example 1. Yes. Note that the numerical values on the horizontal axis in FIG.
  • the nanodiamond particles of Example 1 and Example 2 have more particles having higher ODMR strength than the untreated nanodiamond particles of Comparative Example 1. It was included.
  • the nanodiamond particles of Example 1 included particles having an extremely high ODMR strength of 0.05 or more, which was not present at all in the comparative nanodiamond particles.
  • the nanodiamond particles of the examples contain NV centers, and the surface is modified with functional groups containing heteroatoms, so that the abundance of NV (-) increases and the ODMR strength increases. It was confirmed that
  • Example 3 In Example 3 and Comparative Example 2 shown below, ODMR strength was evaluated using nanodiamond powder obtained by the detonation method.
  • nano-diamond powder obtained by the detonation method (“NanoAmand (registered trademark) Aqueous colloid nm (Dispersed nm 5 nm-Bucky Diamond)”, manufactured by NanoCarbon Research stitute Institute, Ltd.) was prepared.
  • the particles contained in the nanodiamond powder are single particles, and the particle diameter ranges from about 4 nm to 5 nm.
  • nanodiamond particles according to Example 3 were obtained in the same manner as Example 1 except that Step S11 for classifying nanodiamond powder was not performed.
  • Comparative Example 2 The nanodiamond powder obtained by the above detonation method was heat-treated at 800 ° C. in a vacuum, and subsequently heat-treated at 550 ° C. in air to obtain nanodiamond particles according to Comparative Example 2. That is, the nanodiamond particles according to Comparative Example 2 were obtained in the same manner as in Example 3 except that the reduction treatment was not performed.
  • the numerical values shown in the column of fluorescence emission amount and ODMR intensity in Table 2 are the fluorescence emission amount and ODMR intensity in the visual field images shown in FIG. 19 (Example 3) and FIG. 20 (Comparative Example 2).
  • the image shown in FIG. 19A shows a fluorescent image of nanodiamond particles according to Example 3.
  • FIG. 19A shows three bright spots due to fluorescence emission of nanodiamond particles can be confirmed in this visual field image.
  • FIG. 19B shows an ODMR image in the same visual field. In FIG. 19B, three bright spots corresponding to the bright spot in FIG. 19A can be clearly confirmed. Therefore, the nanodiamond particles according to Example 3 are ODMR active.
  • FIG. 20A is a fluorescent image of nanodiamond particles according to Comparative Example 2
  • FIG. 20B is an ODMR image of the nanodiamond particles.
  • the nanodiamond particles according to Comparative Example 2 are ODMR inert.

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Abstract

　ヘテロ原子を含む官能基で表面が修飾されておりＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子が提供される。このナノダイヤモンド粒子は化学修飾することにより生体内で利用できる蛍光分子プローブとすることができる。またこの蛍光分子プローブに含まれるＮＶセンターの回転運動を追跡することによりタンパク質の構造変化をリアルタイムで解析することができる。ヘテロ原子を含む官能基は、ヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれかの官能基、またはカルボキシル基とすることができる。

Description

ナノダイヤモンド粒子およびその製造方法ならびに蛍光分子プローブおよびタンパク質の構造解析方法
　本発明は、ナノダイヤモンド粒子およびその製造方法ならびに蛍光分子プローブおよびタンパク質の構造解析方法に関する。
　タンパク質の構造やタンパク質等生体分子の構造解析や機能解析に使用される蛍光分子プローブとしては、種々のものが知られている。たとえば、第一級アミンと特異的に反応して蛍光性を示すフルオレスカミン等を挙げることができる。そして、蛍光分子プローブで標的タンパク質を標識し蛍光顕微鏡等を用いて観測することによって、標的タンパク質の運動や配向等といった分子構造に関する各種情報を収集できる。そして、昨今、このような蛍光分子プローブに使用される蛍光物質としてナノダイヤモンド粒子が注目されている（たとえば、特開２０１１－１８０５７０号公報（特許文献１））。
特開２０１１－１８０５７０号公報
　生体内において、タンパク質は生命現象に深く関与している。そして、タンパク質の生体内における構造変化を追跡することは、タンパク質の機能を明らかにし、ひいては病気の発現や進行のメカニズムを明らかにする上で極めて重要である。従来、タンパク質の構造解析は、専ら「ｉｎ－ｖｉｔｒｏ」すなわち試験管内で行なわれてきた。しかし、実際にタンパク質が機能している生体内「ｉｎ－ｖｉｖｏ」と試験管内とでは、タンパク質を取り巻く環境が大きく異なることから試験管内で観測された結果がそのまま生体内での構造や機能に適用できる場面は限られており、生体内におけるタンパク質の構造解析方法の早期確立が望まれている。
　従来、タンパク質の構造解析には核磁気共鳴による分子構造解析法〔以下「ＮＭＲ（Nuclear Magnetic Resonance）法」とも記す〕や蛍光顕微鏡を用いた蛍光分子観察法等が主に用いられてきた。
　ＮＭＲ法は、非侵襲的な計測が可能であるとともに原子レベルでの高い空間分解能を有するため、立体構造に関する多くの情報を収集できる。しかしその反面、感度が低く、時間分解能も低いためリアルタイムでの観測は困難であった。
　蛍光分子観察法は、一分子計測が可能であるとともにリアルタイム観察・計測が可能である。しかしその反面、空間分解能が低く、いわゆる構造の揺らぎや構造変化を計測することが極めて困難であった。さらには蛍光分子プローブに用いられる蛍光物質に毒性がある場合も多く非侵襲的な計測に適していなかった。
　このように既存の方法によっては、生体内で非侵襲的に、かつタンパク質１分子の構造変化をリアルタイムで観測することは不可能であった。
　ところで、光検出磁気共鳴法〔以下「ＯＤＭＲ（Optically-Detected Magnetic Resonance）法」とも記す〕は、試料体の磁気共鳴を高感度に検出できる手段として知られている。ＯＤＭＲ法では、試料体に励起光および高周波磁場を同時に照射して蛍光発光量の変化を検知することにより磁気共鳴を高感度に検出する。これ以降、本明細書では、このような計測手段をＯＤＭＲ計測とも記す。
　近年、たとえば、特許文献１に記載された蛍光顕微鏡装置のように、磁気共鳴法と蛍光分子観察法とを融合させたＯＤＭＲ法を生体内におけるタンパク質の構造解析に応用する研究が進められている。そしてその中でナノダイヤモンド粒子の蛍光分子プローブとしての可能性が示されている。
　ダイヤモンド結晶中の窒素原子と空孔からなる複合欠陥（以下「ＮＶセンター」とも記す）を含むナノダイヤモンド粒子は、ＮＶセンターにおいて蛍光発光し、かつ磁気共鳴によって蛍光発光量を変化させることが知られている。ここで、ＮＶセンターとは、図１に示すように、ダイヤモンド結晶中の炭素原子１を置換した窒素原子２（Ｎ；Nitrogen）と、窒素原子２と隣接する空孔３（Ｖ；Vacancy）とからなる複合欠陥を示す。
　ＮＶセンターにおける蛍光には、蛍光の褪色やブリンキングが少なく、蛍光分析への適応性が高い。さらに、ナノダイヤモンド粒子は炭素原子からなる物質であるため、生体への毒性が極めて低いと考えられ、また標的タンパク質を標識するための粒子表面の化学修飾が容易であるため生体内で使用する蛍光分子プローブとして有望視されている。
　上記のようなＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ計測を行ない、蛍光発光量を縦軸、磁場周波数を横軸とした２次元座標に表示した場合、特定の高周波磁場において蛍光発光の減少ピークが観測される。ここで、本明細書では上記の２次元座標に表示されたスペクトルを「ＯＤＭＲスペクトル」とも記し、上記の減少ピークを「ＯＤＭＲシグナル」とも記す。
　そして、ＯＤＭＲ計測において、高周波磁場を照射したときの発光量をＬ（ＯＮ）とし、磁場を照射しないときの発光量Ｌ（ＯＦＦ）としたとき、下記式（Ｉ）によって算出される蛍光発光量の減少率を「ＯＤＭＲ強度」と定義する。
　（ＯＤＭＲ強度）＝１－｛Ｌ（ＯＮ）／Ｌ（ＯＦＦ）｝・・・（Ｉ）
　上記の減少ピーク（ＯＤＭＲシグナル）は静的な外部磁場に置かれたＮＶセンターでは分裂し、ピークの分裂幅はＮＶセンターの回転運動とともに変化するため、ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を蛍光分子プローブとして使用し、該蛍光分子プローブによって標的タンパク質を標識するとともにＯＤＭＲスペクトルを計測することにより、上記した既存の方法では実現できなかった生体内におけるタンパク質の精細かつリアルタイムの構造解析が実現できる可能性がある。
　ここで、上記のような生体内におけるタンパク質の構造解析方法が実現されるためには、極めて高いＯＤＭＲ強度を有するＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子が必要とされる。
　しかしながら、現状において、ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ強度は生体内での計測を安定的に行なうには十分ではなく、未だ上記のようなタンパク質の構造解析方法は確立されていない。そして、現在まで、ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ強度を高める方法が報告された例はない。
　本発明はこのような現状に鑑みてなされたものであって、その目的とするところはＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を提供し、該ナノダイヤモンド粒子を化学修飾した蛍光分子プローブを用いて新規なタンパク質の構造解析方法を提供することにある。
　本発明のナノダイヤモンド粒子は、粒子表面が特定の官能基で修飾されることによって、粒子内部に存在するＮＶセンターのＯＤＭＲ強度が高められている。
　すなわち、本発明のナノダイヤモンド粒子は、ヘテロ原子を含む官能基で表面が修飾されており、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むことを特徴とする。
　ここで、上記ヘテロ原子を含む官能基は電子供与性官能基であることが好ましい。また、上記ヘテロ原子を含む官能基はヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれかであることが好ましい。また上記ヘテロ原子を含む官能基はカルボキシル基であってもよい。
　また、上記ナノダイヤモンド粒子は、平均粒径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることが好ましい。
　そして、上記ＯＤＭＲ強度とは、１～５ＧＨｚの高周波磁場を照射したときの励起光による蛍光発光量の減少率を示す。
　本発明のナノダイヤモンド粒子の具体的な利用形態としては、たとえばナノダイヤモンド粒子からなる粉末状試薬やナノダイヤモンド粒子を液体に分散させた試薬等を挙げることができる。
　さらに、本発明は上記のナノダイヤモンド粒子の製造方法にも係わり、該製造方法は、ナノダイヤモンド粒子を準備する工程と、該ナノダイヤモンド粒子表面に存在する官能基のうち１種以上のヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程と、を含む、ＯＤＭＲ強度が高められたナノダイヤモンド粒子の製造方法である。
　ここで、上記１種以上のヘテロ原子を含む官能基はヒドロキシル基および／またはヒドロキシアルキル基（ヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれか）であり、かつ上記処理を行なう工程は還元処理を行なう工程であることが好ましい。
　また、上記１種以上のヘテロ原子を含む官能基はカルボキシル基であり、かつ上記処理を行なう工程は酸化処理を行なう工程であってもよい。
　また、本発明は上記のナノダイヤモンド粒子を用いた蛍光分子プローブにも係わり、該蛍光分子プローブは、上記のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を化学修飾したものであることを特徴とする。この蛍光分子プローブは、たとえば粉末状の試薬や液体に分散させた試薬として利用することができる。
　さらに、本発明はタンパク質の構造解析方法にも係わり、該構造解析方法は、上記の蛍光分子プローブで標識した標的タンパク質に、励起光および１～５ＧＨｚの高周波磁場を照射して、蛍光発光量が減少するピーク磁場周波数を検知することで、該標的タンパク質の構造変化を検知するタンパク質の構造解析方法である。すなわち、該構造解析方法は蛍光分子プローブで標的タンパク質を標識する工程と、標識された標的タンパク質に励起光および１～５ＧＨｚの高周波磁場を照射して、蛍光発光量が減少するピーク磁場周波数を検知することによって標的タンパク質の構造変化を検知する工程と、を備える。
　ここで、上記ピーク磁場周波数は静的な外部磁場の下で分裂しており、その分裂幅の大きさから、蛍光分子プローブに含まれるＮＶセンターの回転運動を検知することができる。
　本発明のナノダイヤモンド粒子は、極めて高いＯＤＭＲ強度を示す。したがって、生体内における蛍光分子プローブとして利用可能であり、これを用いることによって生体内におけるタンパク質の精細かつリアルタイムの構造解析が実現できる可能性がある。
ダイヤモンド結晶中におけるＮＶセンターの概略概念図である。 ダイヤモンド結晶中における窒素原子と空孔の配置の一例を示す概略概念図である。 ＮＶセンターのエネルギー準位の一例を示す概念図である。 ダイヤモンド結晶中におけるＮＶ（－）を示す概略概念図である。 ダイヤモンド結晶中におけるＮＶ（０）を示す概略概念図である。 ＮＶ（－）のエネルギー準位の一例を示す概略概念図である。 ＮＶ（－）が蛍光発光する際のエネルギー準位の一例を示す概略概念図である。 本発明の実施形態に係わるＯＤＭＲスペクトルの一例を示す図である。 本発明の実施形態に係るタンパク質の構造解析方法におけるＯＤＭＲスペクトルの一例を示す図である。 本発明の実施形態に係わるナノダイヤモンド粒子のＩＲスペクトルの一例を示す図である。 本発明の実施形態に係わるＯＤＭＲ強度の評価に用いる蛍光顕微鏡装置の一例を示す概略概念図である。 本発明の実施形態に係るＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法を示すフローチャートである。 本発明の実施形態のタンパク質の構造解析方法に係わる解析装置を示す概略概念図である。 本発明の実施形態に係わるナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ強度の測定例を示すグラフである。 本発明の実施形態に係わるナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ強度の測定例を示すグラフである。 本発明の実施形態に係る蛍光分子プローブの合成スキームの一例を示す図である。 ナノダイヤモンド粒子を添加した細胞株の観察結果の一例を示す図である。 水溶液中のタンパク質の濃度とナノダイヤモンド粒子に吸着したタンパク質濃度との関係の一例を示すグラフである。 図１９（Ａ）は本発明の実施形態に係るナノダイヤモンド粒子の蛍光像を示す図であり、図１９（Ｂ）は本発明の実施形態に係るナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ像を示す図である。 図２０（Ａ）は従来のナノダイヤモンド粒子の蛍光像を示す図であり、図２０（Ｂ）は従来のナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ像を示す図である。 本発明の実施形態に係るタンパク質の構造解析方法の概略を示すフローチャートである。
　［実施形態１］
　以下、本発明の実施形態（以下「本実施形態」とも記す）についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　＜ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子＞
　以下、本実施形態のナノダイヤモンド粒子について説明する。本実施形態のナノダイヤモンド粒子はヘテロ原子を含む官能基で表面が修飾されており、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含んでいる。
　≪ナノダイヤモンド粉末≫
　原料となるナノダイヤモンド粉末の製造方法は特に制限されず、いかなる方法で製造されてもよい。ナノダイヤモンド粉末の製造方法としては、たとえばＣＶＤ法（化学蒸着法）、爆発法（爆轟法）、高温高圧法（ＨＰＨＴ法）等を挙げることができる。
　本実施形態のナノダイヤモンド粒子は、生体内におけるタンパク質の構造解析方法への利用を目的のひとつとしている。一般に、ＣＶＤ法、ＨＰＨＴ法によって得られたナノダイヤモンド粉末は幅広い粒度分布を有するため、適宜分級を行なって粒度分布を調整することが好ましい。ここで分級方法としては、たとえば超遠心法、サイズ排斥クロマトグラフィー等を好適に用いることができる。他方、爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末であれば分級操作を行なわずそのまま用いることができる。爆轟法ではその製法原理上、大粒子が生成されず、粒子径が４～５ｎｍ程度でありかつ粒子径の揃った粉末が得られるからである。
　生体内での使用を考慮するとナノダイヤモンド粒子の平均粒径は小さいほど好ましく、好ましくは５０ｎｍ以下であり、より好ましくは４０ｎｍ以下であり、最も好ましくは３０ｎｍ以下である。平均粒径が５０ｎｍを超過すると分散性が低下する傾向があり好ましくない。また、上記のように平均粒径は小さいほど好ましいが、ＮＶセンターを有しかつ高い結晶性を確保するという観点から１ｎｍ以上であることが好ましい。前述のように爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末は４～５ｎｍ程度の粒子径範囲を有することができる。そのため爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末は本実施形態のナノダイヤモンド粒子の原料として特に好適である。なお「平均粒径」は、たとえば動的光散乱法、レーザー回折法等によって測定することができる。
　≪ＮＶセンター≫
　本実施形態のナノダイヤモンド粒子は、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含んでいる。ここで、ＮＶセンターとは図１に示すように、ダイヤモンド結晶中の炭素原子１を置換した窒素原子２と窒素原子２と隣接する空孔３とからなる複合欠陥を示す。
　≪ＮＶセンターの生成≫
　一般的に、上記のような方法でナノダイヤモンド粉末を製造した場合、ダイヤモンド結晶中には不純物として窒素原子が混入しており、同時に炭素原子が欠落した空孔も存在している。しかし、このままでは、たとえば図２に示すように窒素原子２と空孔３とが隣接した一対をなしておらずＮＶセンターとはなっていない。
　≪真空熱処理≫
　そこで、ナノダイヤモンド粉末を真空中７００℃～１０００℃の高温で熱処理することによって、窒素原子２と空孔３とを結合させることができる。これによりダイヤモンド結晶中に図１に示されるＮＶセンターが生成される。
　≪空気熱処理≫
　しかし、上記のように高温で真空熱処理した場合、粒子表面のダイヤモンド構造の一部がグラファイト化してしまう。このように、表面がグラファイトで覆われてしまうと、結晶内部にＮＶセンターを有していても、ナノダイヤモンド粒子は良好な蛍光発光を示さない。
　そこで、良好な蛍光発光を示すナノダイヤモンド粒子を得るためには、真空熱処理の後、さらに空気中４００℃～６００℃で熱処理して表面を酸化することを要する。
　≪ＮＶ（－）およびＮＶ（０）≫
　上記のようにして、ダイヤモンド結晶内部にＮＶセンターが生成されたナノダイヤモンド粒子は励起光を照射すると蛍光発光する。そして、励起光および高周波磁場を該ダイヤモンド粒子に同時照射して、電子スピン磁気共鳴〔以下「ＥＳＲ（Electron Spin Resonance）」とも記す〕を発生させると、蛍光発光量が減少する場合がある。
　この現象は、ＮＶセンターのうち、ＥＳＲ発生時に蛍光発光しないスピン状態を形成するＮＶ（－）の存在によって引き起こされる。以下、図３～８を用いて該現象を説明する。
　図３に示すように、ＮＶセンターの基底状態はスピン三重項（3Ａ）であり、励起状態はスピン三重項（3Ｅ）である。そして（3Ａ）と（3Ｅ）との間には波長６３７ｎｍに相当するエネルギーギャップが存在する。また（3Ａ）と（3Ｅ）との間にはスピン一重項（1Ａ1）が存在する。
　図４に示すように、ＮＶ（－）は、窒素原子２と隣接する空孔３に余分な電子５を獲得している。この電子の存在によって不対電子６が２個となり、Ｓ＝１のスピン状態を形成することができる。
　そのため、図６に示すように、ＮＶ（－）では、基底状態は静磁場を印加しない状態でも約２．８７ＧＨｚに相当するエネルギーギャップをもつＭｚ＝０の基底状態（Ａ1）とＭｚ＝±１の準基底状態（Ｅ）とに分裂している。したがって、約２．８７ＧＨｚの高周波磁場を照射するとゼロ磁場環境下でもＥＳＲを発生する。
　ここで、ＮＶ（－）にＥＳＲが発生した状態で、励起光を照射した際の緩和過程を図７に示す。励起光によってＭｚ＝±１の準基底状態（Ｅ）から励起された電子の一部は項間交差し、図７中の一点鎖線で示すようにスピン一重項（1Ａ1）を経て蛍光発光しない無輻射過程をたどる。すなわち、これが図８に示すような蛍光発光量の減少（ＯＤＭＲシグナル）として観測される。そして、無輻射過程をたどる電子が多いほどＯＤＭＲシグナルは大きくなる（換言すればＯＤＭＲ強度は高められる。）。
　他方、ＮＶ（０）には、図５に示すようにＮＶセンターに余分な電子５が存在しないためＳ＝１／２のスピン状態となる。そのため、ＮＶ（０）では、励起光を照射しても図３に示す（3Ａ）と（3Ｅ）との間の遷移しか起こらず無輻射過程をたどることはない。すなわちＯＤＭＲシグナルを示さない（ＯＤＭＲ不活性）。
　以上の説明から分かるように、ＮＶセンターのうちＮＶ（－）の存在率を増加させることができれば、ＯＤＭＲ強度を高めることができる。
　本発明者らは、ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子において、ＮＶ（－）の存在率を高める方法について鋭意研究を重ねた結果、ナノダイヤモンド粒子の表面を特定の官能基で修飾することによって、ＮＶ（－）の存在率を増加させることができるとともに、ＯＤＭＲ強度が飛躍的に高められることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本実施形態のナノダイヤモンド粒子は、ヘテロ原子を含む官能基で表面が修飾されることによって、ＮＶセンターのＯＤＭＲ強度が高められたナノダイヤモンド粒子である。
　≪ヘテロ原子を含む官能基≫
　本明細書において、ヘテロ原子とは、炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）以外の原子であり、かつ官能基中において該原子上に非共有電子対を有する原子を示す。このようなヘテロ原子としては、たとえば、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）等を挙げることができる。そして、ヘテロ原子を含む官能基としては、たとえば、ヒドロキシル基（－ＯＨ）、ヒドロキシアルキル基（－ＣＨ２ＯＨ、－ＲＯＨ：Ｒはアルキル基を示す。）、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、アミノ基（－ＮＨ２）、アルキルアミノ基（－ＮＨＲ、－ＮＲ２：Ｒはアルキル基を示す。）、チオール基（－ＳＨ）等を挙げることができる。
　≪電子供与性≫
　上記のヘテロ原子を含む官能基は電子供与性官能基であることが好ましい。ここで、本明細書において「電子供与性」とは、該ヘテロ原子上の非共有電子対によって引き起こされる共鳴効果による電子供与性を示す。
　電子供与性のヘテロ原子を含む官能基によって、ナノダイヤモンド粒子の表面を修飾することにより、ＮＶ（－）の発生を促進させることができる。
　そして、上記したヘテロ原子を含む官能基のうち、ヒドロキシル基、ヒドロキシアルキル基およびカルボキシル基は、本発明の効果が得られやすく、修飾官能基として好ましい。なお、カルボキシル基は電子吸引性を有する官能基であるが、本発明者の研究によればカルボキシル基でナノダイヤモンド粒子を修飾した場合であってもＮＶ（－）の存在率が高められることが明らかとなっている。
　≪表面修飾処理≫
　一般に、ナノダイヤモンド粒子の表面には多種多様な官能基が存在している。そのような官能基としては、たとえば、アルキル基、カルボキシル基、ケトン基、ヒドロキシル基、ビニル基、ラクトン基等の存在が知られている。
　本実施形態のナノダイヤモンド粒子は、このような官能基のうち１種以上のヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なうことにより製造することができる。
　ここで、ヘテロ原子を含む官能基は、ヒドロキシル基、ヒドロキシアルキル基およびカルボキシル基からなる群より選ばれた１種以上の官能基であることが好ましい。
　また、上記のような処理としては、たとえば、ナノダイヤモンド粒子表面に存在する官能基を、還元処理および／または酸化処理する方法を好適に用いることができる。
　ここで、上記の処理が還元処理である場合には、ヒドロキシル基および／またはヒドロキシアルキル基（ヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれか）によるナノダイヤモンド粒子表面の修飾率を選択的に高めることができる。還元処理の方法としては、従来公知のいかなる還元反応も採用することができる。たとえば、還元剤として、ボラン－テトラヒドロフラン混合溶液、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム、フェントン試薬等を用いて還元処理を行なってもよい。
　また、上記処理は酸化処理であってもよい。酸化処理である場合には、カルボキシル基によるナノダイヤモンド粒子表面の修飾率を選択的に高めることができる。酸化処理の方法としては、従来公知のいかなる酸化反応も採用することができる。たとえば、酸化剤として、濃硫酸と濃硝酸の混合溶液、ピランハ溶液、硫酸、硝酸、過塩素酸混合溶液等を用いて酸化処理を行なってもよい。
　≪表面修飾官能基の定性≫
　上記のように、表面修飾処理を行なった後に、ナノダイヤモンド粒子の表面に存在する官能基の定性を行なうことが好ましい。官能基の定性は、たとえば赤外分光スペクトル（以下「ＩＲスペクトル」とも記す）を測定することによって行なうことができる。たとえば、ナノダイヤモンド粒子を従来公知の錠剤法によって錠剤に成形して、ＩＲスペクトルを測定することができる。
　≪ＯＤＭＲ強度の評価≫
　ＯＤＭＲ強度の評価は、ナノダイヤモンド粒子に励起光を照射しながらＥＳＲを発生する高周波磁場を照射して蛍光発光量を計測するとともに、上記式（Ｉ）によってＯＤＭＲ強度を算出して行なうことができる。
　≪ＮＶ（－）の存在率の評価≫
　ＮＶ（－）の存在率の評価は、同条件で処理された一定数のナノダイヤモンド粒子について、個々の粒子について上記したＯＤＭＲ強度を求め、それらの相加平均を算出することによって行なうこともできる。ここで、信頼性の高い結果を得るためには、上記一定数は、たとえば５０～２００個程度とすることが好ましい。
　≪その他≫
　上記のように本実施形態のナノダイヤモンド粒子は高いＯＤＭＲ強度を有する。ここでＯＤＭＲ強度をさらに高めるとの観点から、ナノダイヤモンド粒子は結晶内部に希土類金属（たとえば、イッテルビウム（Ｙｂ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）等）を含まないことが好ましい。結晶中に希土類金属が導入されるとダイヤモンド結晶格子に歪みが生じ、ＯＤＭＲ強度が減退することがあるからである。またダイヤモンド結晶中に磁性元素（たとえば、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）等）も含まないことが好ましい。これらの磁性元素が生起する磁場がＯＤＮＲ強度の測定に悪影響を及ぼすことがあるからである。
　なお、本実施形態においてダイヤモンド結晶を構成する炭素には、自然界に存在するものを特に限定なく用いることができる。たとえば、天然に存在する炭素の安定な同位体として12Ｃおよび13Ｃがあるが、ダイヤモンド結晶中におけるこれらの存在比率も特に限定されるものではない。
　［実施形態２］
　このような本実施形態のナノダイヤモンド粒子は、以下のような製造方法によって製造される。換言すれば、以下のような製造方法によって製造されるナノダイヤモンド粒子は上記のような特性を示す。したがって、本実施形態のナノダイヤモンド粒子は極めて高いＯＤＭＲ強度を示すという優れた効果を有する。以下、本実施形態のナノダイヤモンド粒子の製造方法について説明する。
　＜ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法＞
　図１２に本実施形態のナノダイヤモンド粒子の製造方法のフローチャートを示す。当該製造方法は、ナノダイヤモンド粒子を準備する工程Ｓ１と、ナノダイヤモンド粒子の表面に存在する官能基のうち１種以上のヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程Ｓ２と、を含む。以下、各工程について説明する。
　≪ナノダイヤモンド粒子を準備する工程Ｓ１≫
　まず、工程Ｓ１では、ナノダイヤモンド粉末を分級する工程Ｓ１１と、ナノダイヤモンド粒子を真空中で熱処理する工程Ｓ１２と、ナノダイヤモンド粒子を空気中で熱処理する工程Ｓ１３と、を実施する。工程Ｓ１１を実施することによって、ナノダイヤモンド粒子は生体内での使用に好適な粒度分布に調整され、工程Ｓ１２を実施することによってナノダイヤモンド粒子の内部にＮＶセンターが生成される。さらに、工程Ｓ１３を実施することによって、ナノダイヤモンド粒子表面のグラファイト層を酸化し、蛍光性を示すＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を製造することができる。なお、前述のように爆轟法によって得られたダイヤモンド粉末を用いる場合は、分級する工程を省略することができる。
　≪ヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程Ｓ２≫
　次いで、工程Ｓ２では、上記工程Ｓ１で得られたナノダイヤモンド粒子に、粒子の表面に存在する官能基のうち１種以上のヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程として、還元処理を行なう工程Ｓ２１および／または酸化処理を行なう工程Ｓ２２を実施することによって、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を製造することができる。
　なお、本実施形態のナノダイヤモンド粒子の製造方法は、上記の工程Ｓ１（工程Ｓ１１～工程Ｓ１３）と工程Ｓ２（工程Ｓ２１および工程Ｓ２２の少なくともいずれか）とを含む限り、他の工程を含んでいてもよく、工程Ｓ１と工程Ｓ２とを含む限り本発明の効果は示される。
　ここで、他の工程としては、たとえば工程Ｓ２の後にナノダイヤモンド粒子を乾燥する工程を含むことができる。ただし、表面修飾がなされたナノダイヤモンド粒子を乾燥する場合は凍結乾燥を行なうことが望ましい。凍結乾燥によればナノダイヤモンド粒子が凝集してクラスターとなることを防止できるからである。これに対して、たとえば減圧乾燥を行なうとナノダイヤモンド粒子が凝集してクラスターとなるため好ましくない。
　本実施形態のナノダイヤモンド粒子は生体分子の構造解析に用いるため、前述のようにその粒子径は小さいことが好ましい。そして、本実施形態のナノダイヤモンド粒子は凝集体ではなく単一粒子であることが特に好ましい。その理由は次の通りである。
　後述するように本実施形態のタンパク質の構造解析方法では、ナノダイヤモンド粒子中のＮ－Ｖ軸ベクトルと外部磁場（静磁場）ベクトルとのなす角度を追跡することにより、Ｎ－Ｖ軸の回転運動を追跡する。ここでダイヤモンド結晶中のＮＶセンターは４つのＮ－Ｖ軸を有している。したがって、ナノダイヤモンド粒子の凝集体を蛍光分子プローブとして用いた場合は、凝集体の中で複数のナノダイヤモンド粒子が様々な方向（角度）で近距離に存在するため、複数のＮ－Ｖ軸も様々に配向することとなり、ＯＤＭＲシグナルの分解能が低下する。したがって、本実施形態のナノダイヤモンド粒子は単一粒子であることが好ましく、その製造方法には凝集体が発生しないプロセスを採用することが好ましい。
　［実施形態３］
　以下、上記に説明した本実施形態のナノダイヤモンド粒子の生体計測への具体的な適用例である蛍光分子プローブについて説明する。
　＜蛍光分子プローブ＞
　本実施形態の蛍光分子プローブは、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を化学修飾することによって得られる。
　ここで生体内での計測を考慮すると、蛍光分子プローブに使用されるナノダイヤモンド粒子としては、本実施形態のナノダイヤモンド粒子のうち粒径が１～１０ｎｍのものが好ましい。
　また、ＯＤＭＲ計測において十分なＳ／Ｎ比を確保し高い時間分解能を得るためには、本実施形態のナノダイヤモンド粒子のうちＯＤＭＲ強度が０．０２以上のナノダイヤモンド粒子が好ましく、ＯＤＭＲ強度が０．０５以上のナノダイヤモンド粒子がより好ましく、ＯＤＭＲ強度が０．１０以上のナノダイヤモンド粒子が特に好ましい。
　≪化学修飾≫
　ここで、化学修飾とは、標的タンパク質と特異的に結合する分子鎖をナノダイヤモンドに化学結合させることを示す。該分子鎖は、ダイヤモンド結晶をなす炭素原子と直接結合されていてもよく、ナノダイヤモンド粒子表面上の官能基と結合していてもよい。また該分子鎖は、標的タンパク質（目的タンパク質ともいう）に合わせて適宜選択することが好ましい。たとえば、後述する代謝型グルタミン酸受容体を標的とする場合、アンピシリン（Ampicillin、以下「Ａｍｐ」と略記することもある）等を用いることができる。
　≪非特異的な吸着の阻害方法≫
　上記の化学修飾は、標的タンパク質以外の生体高分子への非特異的な吸着を阻害する分子鎖を含むことが好ましい。そのような分子鎖の一例としては、たとえば高分岐ポリグリセロール（ＨＰＧ：Hyper branched Poly-Glycerol）を挙げることができる。化学修飾が非特異的な吸着を阻害する分子鎖を含むことにより、高選択的に標的タンパク質を標識することができる。
　図１６は、本実施形態の蛍光分子プローブの合成スキームの一例を示している。図１６に示すように、本実施形態の蛍光分子プローブは、次の（ｉ）～（ｉｉｉ）の手順に従って合成することができる。すなわち、本実施形態の蛍光分子プローブ１０１は、（ｉ）ナノダイヤモンド粒子１００の表面をたとえばヒドロキシル基によって修飾してＯＤＭＲ強度を高め、（ｉｉ）非特異的な吸着を阻害する分子鎖をヒドロキシル基等に結合させ、（ｉｉｉ）さらに標的タンパク質と特異的に結合する分子鎖で修飾することにより合成することができる。なお図１６では、非特異的な吸着を阻害する分子鎖としてＨＰＧを、標的タンパク質と特異的に結合する分子鎖としてＡｍｐを採用した例を示している。
　（実験例）
　ここで非特異的な吸着の阻害に成功した具体例を、実験例を用いて説明する。まず（ｉ）ナノダイヤモンド粒子をヒドロキシル基によって修飾しＯＤＭＲ強度の増強を行なった。次いで（ｉｉ）このナノダイヤモンド粒子に次の［ａ］～［ｃ］に示す分子鎖を結合させ（すなわち該分子鎖で表面修飾して）、表面修飾ナノダイヤモンド粒子を得た。
　［ａ］カルボキシル基
　［ｂ］ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：polyethylene glycol）
　［ｃ］ＨＰＧ
　以下のこの実験例での説明においては、上記符号［ａ］～［ｃ］に従い、カルボキシル基で表面修飾されたナノダイヤモンド粒子を「ＮＤ［ａ］」と記し、ＰＥＧで表面修飾されたナノダイヤモンド粒子を「ＮＤ［ｂ］」と記し、ＨＰＧで表面修飾されたナノダイヤモンド粒子を「ＮＤ［ｃ］」と記す。
　（実験例１）
　実験例１ではナノダイヤモンド粒子の細胞表面への非特異的な吸着を評価した。
　ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modi ed Eagle's Medium）培地中で培養されたＡ４３１（ヒト上皮様細胞癌由来細胞株）に対して、上記で得られたＮＤ［ａ］～［ｃ］を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加して、試験細胞株［ａ］～［ｃ］を作製した。ここで、たとえば試験細胞株［ａ］とはＮＤ［ａ］を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加した試験細胞株を示している。
　またこのとき、比較実験例としてＮＤ［ｃ］を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加したもの（試験細胞株［ｄ］）も合わせて作製した。
　上記の各試験細胞株を２時間培養した後、生理食塩水で洗浄した。そして、各試験細胞株に含まれる細胞に吸着したナノダイヤモンド粒子を明視野顕微鏡で観察して、細胞膜へのナノダイヤモンド粒子の非特異的な吸着の有無を確認した。その結果を図１７に示す。
　図１７は、明視野顕微鏡を用いて１０倍の倍率で各試験細胞株を観察した観察視野画像、および４０倍の倍率で各試験細胞株を観察した観察視野画像である。図１７中、「ａ．ＮＤ－ＣＯＯＨ」は試験細胞株［ａ］を示し、「ｂ．ＮＤ－ＰＥＧ」は試験細胞株［ｂ］を示し、「ｃ．ＮＤ－ＨＰＧ」は試験細胞株［ｃ］を示し、「ｄ．ＮＤ－ＨＰＧ」は試験細胞株［ｄ］をそれぞれ示している。また「ｅ．ｃｏｎｔｒｏｌ」はコントロール細胞、すなわちナノダイヤモンド粒子が添加されていない細胞株を示している。
　図１７に示すように、「ａ．ＮＤ－ＣＯＯＨ」および「ｂ．ＮＤ－ＰＥＧ」では視野中に黒点が存在しており、細胞膜へのナノダイヤモンド粒子の非特異的な吸着が起こっていることが分かる。これに対して「ｃ．ＮＤ－ＨＰＧ」および「ｄ．ＮＤ－ＨＰＧ」では、このような非特異的な吸着は確認できず、「ｅ．ｃｏｎｔｒｏｌ」（コントロール細胞）と比較しても殆ど差異が確認できなかった。すなわち、ＨＰＧでナノダイヤモンド粒子を表面修飾することにより、ナノダイヤモンド粒子による細胞表面への非特異的な吸着を阻害できることが確認された。
　（実験例２）
　実験例２ではタンパク質のナノダイヤモンド粒子への非特異的な吸着を評価した。
　まずリゾチーム水溶液に上記ＮＤ［ａ］～［ｃ］を２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、試験水溶液［ａ］～［ｃ］を作製した。ここで、たとえば試験水溶液［ａ］とはＮＤ［ａ］が２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加されたリゾチーム水溶液を示している。
　次いで、各水溶液においてナノダイヤモンド粒子の表面に吸着したタンパク質（リゾチーム）の量を波長２８０ｎｍにおける吸光度を計測することにより算出した。その結果を図１８に示す。
　図１８は、実験例２において、水溶液中に存在するリゾチームの濃度と、ナノダイヤモンド粒子の表面に非特異的に吸着したリゾチームの濃度の関係を示すグラフである。図１８中、横軸はナノダイヤモンド粒子を添加する前の初期リゾチーム濃度を示し、縦軸はナノダイヤモンド粒子の表面に吸着したリゾチーム濃度を示している。また、図１８中、丸型の凡例はＮＤ［ａ］での結果を、三角型の凡例はＮＤ［ｂ］での結果を、四角型の凡例はＮＤ［ｃ］での結果をそれぞれ示している。なお各濃度に対して測定は複数回行なっており、結果の標準偏差をエラーバーとして表示している。また図１８中の曲線は結果を分かりやすく表示するため補助的に付している。
　図１８から明らかなように、ＮＤ［ａ］およびＮＤ［ｂ］では初期リゾチーム濃度が増加するに従い、ナノダイヤモンド粒子の表面へのリゾチームの非特異的な吸着が多くなる傾向が確認された。これに対して、ＮＤ［ｃ］（ＨＰＧで表面修飾されたナノダイヤモンド粒子）では、初期リゾチーム濃度が増加してもナノダイヤモンド粒子の表面に吸着したリゾチーム量はゼロ（０）近傍で推移していた。すなわち、ＨＰＧでナノダイヤモンド粒子を表面修飾することにより、標的タンパク質以外のタンパク質（この例ではリゾチーム）のナノダイヤモンド粒子への非特異的な吸着が阻害できることが確認された。
　≪標的タンパク質≫
　本実施形態において観測対象となる標的タンパク質としては、たとえば代謝型グルタミン酸受容体（以下「ｍＧｌｕＲ」とも記す）等を挙げることができる。これまでの構造生物学における知見から、ｍＧｌｕＲは細胞内においてシグナルを伝達する際、２量体のコンフォメーションを変化させていると予想されている。しかしこれまでに、この構造変化を実際に観測した例は報告されていない。本実施形態の蛍光分子プローブおよび後述する本実施形態のタンパク質の構造解析方法によれば、上記の構造変化を初めて観測できる可能性が高い。
　［実施形態４］
　以下、上記の蛍光分子プローブを用いた本実施形態のタンパク質の構造解析方法について説明する。
　＜タンパク質の構造解析方法＞
　図２１は本実施形態のタンパク質の構造解析方法の概略を示すフローチャートである。図２１に示すように、本実施形態のタンパク質の構造解析方法は、本実施形態の蛍光分子プローブで標識した標的タンパク質に励起光および１～５ＧＨｚの高周波磁場を照射して、蛍光スペクトルが減少するピーク磁場周波数を検知することによって標的タンパク質の構造変化を検知するタンパク質の構造解析方法である。すなわち、本実施形態のタンパク質の構造解析方法は、蛍光分子プローブで標的タンパク質を標識する工程Ｓ１０１と、標識された標的タンパク質に励起光および１～５ＧＨｚの高周波磁場を照射して、蛍光発光量が減少するピーク磁場周波数を検知することによって標的タンパク質の構造変化を検知する工程Ｓ１０２と、を備える。
　そして、図９に示すように、上記ピーク磁場周波数は静的な外部磁場のもとで分裂しており、その分裂幅の大きさから、上記蛍光分子プローブに含まれるＮＶセンターの回転運動を検知することができ、標的タンパク質の構造変化を追跡することができる。
　≪蛍光分子プローブで標的タンパク質の標識する工程Ｓ１０１≫
　蛍光分子プローブによって、標的タンパク質を標識するためには、まず標的タンパク質とタグとなるタンパク質（以下、「タグ－タンパク質」とも記す）を融合する。たとえば、上記に例示したｍＧｌｕＲを標的とする場合、バクテリア由来β－ラクタマーゼの変異体（以下「ＢＬタグ」とも記す）をタグ－タンパク質として採用することができる。
　たとえば、ｍＧｌｕＲおよびＢＬタグの塩基配列をコードしたＤＮＡをリポフェクション法により、ＨｅＬａ細胞内にトランスフェクションすることによって、ＨｅＬａ細胞内に、ｍＧｌｕＲおよびＢＬタグが融合したタンパク質を発現させることができる。
　このとき、蛍光分子プローブとしては、ＢＬタグと特異的に反応するＡｍｐを化学修飾したナノダイヤモンド粒子を用いることができる。そして、ＢＬタグとナノダイヤモンド粒子とをＡｍｐを介して結合させることによって、ｍＧｌｕＲをナノダイヤモンド粒子で標識することができる。
　≪標的タンパク質の構造変化を検知する工程Ｓ１０２≫
　上記のようにして、標識された標的タンパク質の構造解析は、ＯＤＭＲ計測によって、蛍光分子プローブに含まれるダイヤモンド結晶内のＮ－Ｖ軸の回転運動を検出することにより行なうことができる。
　（Ｎ－Ｖ軸）
　ここで、Ｎ－Ｖ軸とは、ダイヤモンド結晶内のＮＶセンターにおいて、窒素原子（Ｎ）と隣接する空孔（Ｖ）とを結ぶ直線軸を示す。ＮＶセンターは、該Ｎ－Ｖ軸上に磁気モーメントμNVを有している。
　（回転運動の検出）
　図９に示すＯＤＭＲスペクトルのように、ナノダイヤモンド粒子に含まれるＮＶ（－）のＯＤＭＲシグナルはゼーマン効果により静的な外部磁場の下で２つに分裂している。分裂した２つのＯＤＭＲシグナルは約２．８７ＧＨｚを中心として対称となる。これは、縮退していたＭｚ＝±１のエネルギー準位がゼーマン効果によりＭｚ＝＋１とＭｚ＝－１の２つのエネルギー準位に分裂していることを示している。このとき、ＯＤＭＲシグナルの分裂幅をΔωとすると、ΔωはＮ－Ｖ軸と静磁場とのなす角θに対応して変化する。
　したがって、たとえば図９に示すＯＤＭＲスペクトルにおけるピークの分裂幅Δωから、Ｎ－Ｖ軸と静磁場とのなす角θを下記式（ＩＩ）によって算出することができる。
　θ＝ｃｏｓ-1（ｈΔω／μNVＢ0）・・・（ＩＩ）
　式（ＩＩ）は、Ｎ－Ｖ軸ベクトルと静磁場ベクトルとの内積を示し、式（ＩＩ）中、θはＮ－Ｖ軸と静磁場とのなす角を示し、ｈは換算プランク定数を示し、ΔωはＯＤＭＲスペクトルのピークの分裂幅を示し、μNVはＮＶセンターの磁気モーメントを示し、Ｂ0は静磁場強度を示す。
　なおここで、ピークの分裂幅Δωは、ＯＤＭＲスペクトルにおける２つの蛍光発光量の減少ピークの各ピーク頂点の周波数を、ω1、ω2(ω1とω2は、ω1＞ω2の関係を満たす)とすると、Δω＝ω1－ω2により算出される。
　したがって、Δωの経時変化を追跡することで、Ｎ－Ｖ軸の回転運動を追跡可能である。これにより、たとえば、ＮＶ（－）を含むナノダイヤモンド粒子を用いた蛍光分子プローブでタンパク質の特定部位を標識した場合、該部位の回転運動を追跡可能であり、ひいては該タンパク質の構造変化が追跡可能となる。
　たとえば、上記したようにｍＧｌｕＲを本実施形態の蛍光分子プローブで標識すれば、ｍＧｌｕＲの２量体のコンフォメーションをリアルタイムに計測できる。
　≪解析装置≫
　上記に説明したタンパク質の構造解析は次のような解析装置によって行なうことができる。図１３は本実施形態のタンパク質の構造解析方法に係わる解析装置の一例を示す概略概念図である。この解析装置を機能毎に大別すると、光検出部と、磁気共鳴部と、コンソール部とに分けることができる。
　光検出部は、一分子蛍光計測が可能な蛍光顕微鏡から構成される。たとえば、図１３に示すように光学顕微鏡１０および蛍光検出が可能な検出部６０から構成することができる。ここで検出部６０には、蛍光検出器としては超高感度であり定量性の高いアバランシュフォトダイオードまたは電子増倍型冷却ＣＣＤカメラを用いることが望ましい。
　磁気共鳴部（高周波磁場発生部２０）は主に電磁石（図示せず）、発振器２１、高周波コイル２３および静磁場コイル２４から構成される。電磁石は５０ガウス以下のもので構わないが、磁場方位の制御が可能であることが望ましい。発振器２１はナノ秒レベルで発振を制御できる高周波発振器である必要がある。また高周波コイル２３は試料にＥＳＲを生起させるためのものであり、静磁場コイル２４は静磁場を任意の方向に変更するためものである。
　コンソール部はワークステーション、変換回路３１および変調部３０から構成される。ワークステーションには、たとえば処理部４０、入力装置５０および出力装置５１を備えるものを用いることができる。また変換回路３１は具体的にはＤＡＣ（Digital to Analog Converter）であり、変調部３０は具体的にはパルス／ディレイジェネレータである。
　この解析装置において、光検出部と磁気共鳴部とは、ＤＡＣおよびパルス／ディレイジェネレータを用いてピコ秒～ナノ秒の精度で同期される必要がある。ワークステーションは光検出部と磁気共鳴部とのセッティング、ならびにＤＡＣおよびパルス／ディレイジェネレータの制御を行なう。またワークステーションは、光検出部で検出された蛍光信号をリアルタイムで取り込み再帰的な装置制御を行なうとともに、計測データの解析を行なうものである。
　計測データの解析方法は特に制限されないが、たとえばスピンハミルトニアンのエネルギー固有値からシミュレートされる高周波数領域スペクトルと実際に得られた計測結果との間でフィッティングによる方位解析を行なう方法、あるいはＯＤＭＲ強度の時間領域信号の周波数解析を行なう方法等を用いることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　［実施例１］
　以下に示す実施例１、実施例２および比較例１ではＨＰＨＴ法によって得られたナノダイヤモンド粉末を用いてＯＤＭＲ強度の評価を行なった。
　＜ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造＞
　≪ナノダイヤモンド粒子を準備する工程Ｓ１≫
　まず、出発原料として、ＨＰＨＴ法によって得られたナノダイヤモンド粉末（製品名「Ｍｉｃｒｏｎ＋ＭＤＡ、０－０．０１０μｍ」、エレメントシックス社製）を準備した。
　（分級する工程Ｓ１１）
　このナノダイヤモンド粉末を水中に分散させ、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心してダイヤモンド粒子の分級を行なった。このようにして得られたナノダイヤモンド粒子の平均粒径を、レーザー回折・散乱式粒度分布計（製品名「Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ　ＩＩ」、日機装株式会社製）を用いて動的光散乱法によって求めた。このとき平均粒径は２７．３ｎｍであり、粒度分布の標準偏差は７．３ｎｍであった。
　（真空中で熱処理する工程Ｓ１２）
　次いで、分級処理によって得たナノダイヤモンド粒子を真空中８００℃で熱処理してダイヤモンド結晶内にＮＶセンターを生成した。
　（空気中で熱処理する工程Ｓ１３）
　次いで、空気中５５０℃で熱処理して表面を酸化した。
　≪ヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程Ｓ２≫
　（還元処理を行なう工程Ｓ２１）
　上記のようにして得たナノダイヤモンド粒子１０ｍｇと、ボラン－テトラヒドロフランコンプレックス（製品名、ＡＬＤＲＩＣＨ社製）３００μｌとを、ガラス製反応器に入れ、さらにテトラヒドロフラン５ｍｌを加え、アルゴン雰囲気下で、７０℃で還流して、２４時間攪拌した。次いで、上澄み液を除去し、アセトン、超純水で洗浄した後、乾燥してＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を得た。
　［実施例２］
　実施例１のＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造において、還元処理を実施せず、以下の酸化処理を実施した以外は、実施例１と同様にして、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を得た。
　≪酸化処理を行なう工程Ｓ２２≫
　空気熱処理を経たナノダイヤモンド粉末１１ｍｇと、濃硫酸と濃硝酸を体積比９：１で混合した溶液５ｍｌとを、ガラス製反応器に入れ７５℃で７２時間攪拌した。次いで、上澄み液を除去し超純水で洗浄した後、乾燥してナノダイヤモンド粒子を得た。
　［比較例１］
　実施例１のＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造において、還元処理を実施しなかった以外は、実施例１と同様にしてＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を得た。
　＜ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の評価＞
　≪修飾官能基の定性≫
　上記のようにして得られた実施例１、実施例２および比較例１のナノダイヤモンド粒子の表面に存在する官能基の定性（ＩＲスペクトルの測定）を以下のようにして行なった。ここで、実施例１または実施例２については、還元処理後または酸化処理後のナノダイヤモンド粒子を試料とした。一方、比較例１のナノダイヤモンド粒子については、真空熱処理後、空気熱処理前のナノダイヤモンド粒子を試料とした。これは、空気熱処理後にＩＲ測定を行なうと、グラファイトの酸化によって生じた夾雑物質により測定の精度が低下するためである。
　まず、臭化カリウムの粉末に、極少量のナノダイヤモンド粒子からなる粉末を加え、混合して均一な粉末とした後、該混合粉末を成形型に入れ、プレスしてディスク状の測定試料とした。次いで、フーリエ変換型赤外分光測定装置（型番「ＦＴ／ＩＲ－４２００」、日本分光社製）を用いて、各測定試料のＩＲスペクトルを測定した。その結果を図１０に示す。
　図１０中、「Ｎ．Ｄ－ＣＨ２ＯＨ」は実施例１のナノダイヤモンド粒子のＩＲスペクトルを示し、「Ｎ．Ｄ－ＣＯＯＨ」は実施例２のナノダイヤモンド粒子のＩＲスペクトルを示し、「Ｎ．Ｄ」は比較例１のナノダイヤモンド粒子のＩＲスペクトルを示す。
　図１０に示すとおり、比較例１のナノダイヤモンド粒子では、アルキル基、ケトン基、エーテル基、ヒドロキシル基、ビニル基、ラクトン基等の多様な官能基に由来するピークが観測された。これに対して、実施例１（還元処理）のナノダイヤモンド粒子は、ヒドロキシアルキル基由来のピーク（１２５８ｃｍ-1、２９５６－２９２７ｃｍ-1）が観測でき、その他の官能基に由来するピークは比較例１（未処理）に比べ相対的に減少していた。また、実施例２（酸化処理）のナノダイヤモンド粒子は、カルボキシル基に由来するピーク（１７７８ｃｍ-1）が明りょうに観測でき、その他の官能基に由来するピークは比較例１（未処理）に比べ相対的に減少していた。すなわち、実施例１のナノダイヤモンド粒子は表面がヒドロキシル基および／またはヒドロキシアルキル基で修飾されており、実施例２のナノダイヤモンド粒子は表面がカルボキシル基で修飾されていることが確認できた。
　≪ＯＤＭＲ強度およびＮＶ（－）存在率の評価≫
　次に、実施例１、実施例２および比較例１のＯＤＭＲ強度を以下のようにして評価した。
　まず、図１１を用いてＯＤＭＲ強度の評価に用いる蛍光顕微鏡装置を説明する。該蛍光顕微鏡装置は、光学顕微鏡１０と、高周波磁場発生部２０と、変調部３０と、処理部４０と、入力装置５０と、出力装置５１と、を備えている。さらに、光学顕微鏡１０は、光源１１と、励起フィルタ１２と、ダイクロイックミラー１３と、バンドフィルタ１４と、対物レンズ１５と、を備えている。またさらに、高周波磁場発生部２０は、発振器２１と、増幅部２２と、高周波コイル２３と、を備えている。なお、この装置に変換回路３１と静磁場を任意の方向に変更するための静磁場コイル２４を設けると、先に説明したタンパク質の構造解析に用いる解析装置（図１３参照）と同様のものとなる。
　光源１１から出た光は励起フィルタ１２を通過し励起光となる。励起光はダイクロイックミラー１３によって反射され対物レンズ１５を通して試料台７０に照射される。励起光によって励起された試料７１から発生した蛍光は、ダイクロイックミラー１３によって反射されず、直進して検出部６０へと向かい蛍光発光量が計測される。また、試料７１には高周波磁場発生部２０より高周波磁場が照射される。高周波磁場を照射することにより試料７１にＥＳＲが発生し、その際の蛍光発光量の変化を検出部６０で計測することで、処理部４０にて上記式（Ｉ）によりＯＤＭＲ強度を算出できるようになっている。
　まず、上記した蛍光顕微鏡装置の試料台に、実施例１のナノダイヤモンド粒子からなる粉末試料を水に懸濁しスライドガラスに塗布した。該試料に励起光を照射して出力装置５１の画面上にナノダイヤモンド粒子の蛍光発光による輝点を確認した。次いで、高周波磁場を照射し蛍光発光量を減少させＯＤＭＲ強度を計測した。同様の計測を粒子１００個について行なった。
　上記と同様にして、実施例２および比較例１のナノダイヤモンド粒子についても、粒子１００個のＯＤＭＲ強度を測定した。その結果を表１ならびに図１４および図１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の測定結果の欄に示す各数値は、粒子１００個中ＯＤＭＲ強度が一定値以上（０．０１以上、０．０２以上、０．０５以上）である粒子の累積度数（％）と、粒子１００個についてのＯＤＭＲ強度の相加平均値とを示している。
　また図１４は、粒子１００個についてのＯＤＭＲ強度の測定結果を示すグラフであり、ＯＤＭＲ強度が高いものから粒子を降順に並べて結果を表示したものである。図１４中、実線は実施例１の結果を示し、一点鎖線は実施例２の結果を示し、点線は比較例１の結果を示している。
　また図１５は、ＯＤＭＲ強度と粒子の存在確率との関係を示すグラフであり、横軸に示すＯＤＭＲ強度の数値以上のＯＤＭＲ強度を有する粒子の存在確率を縦軸に表示している。図１５中、丸型の凡例および実線は実施例１の結果を示し、三角型の凡例および一点鎖線は実施例２の結果を示し、四角型の凡例および点線は比較例１の結果を示している。なお図１５の横軸の数値は１００倍にして表示している。
　表１ならびに図１４および図１５から明らかなように、未処理である比較例１のナノダイヤモンド粒子に比較して、実施例１および実施例２のナノダイヤモンド粒子では高いＯＤＭＲ強度を有する粒子が数多く含まれていた。特に実施例１のナノダイヤモンド粒子は、比較例のナノダイヤモンド粒子では全く存在しなかったＯＤＭＲ強度が０．０５以上という極めて高いＯＤＭＲ強度を有する粒子を含むものであった。
　以上の結果より、実施例のナノダイヤモンド粒子はＮＶセンターを含み、ヘテロ原子を含む官能基で表面が修飾されていることを以って、ＮＶ（－）の存在率が増加しＯＤＭＲ強度が高められていることが確認できた。
　［実施例３］
　以下に示す実施例３および比較例２では、爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末を用いてＯＤＭＲ強度の評価を行なった。
　まず、爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末（「NanoAmand（登録商標） Aqueous colloid (Dispersed 5nm-Bucky Diamond)」、NanoCarbon Research Institute, Ltd.製）を準備した。このナノダイヤモンド粉末に含まれる粒子は単一粒子であり、その粒子径の範囲は４ｎｍ～５ｎｍ程度である。
　次に、ナノダイヤモンド粉末を分級する工程Ｓ１１を行なわないことを除いては実施例１と同様にして実施例３に係るナノダイヤモンド粒子を得た。
　［比較例２］
　上記の爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末を真空中８００℃で熱処理し、続いて空気中５５０℃で熱処理することにより比較例２に係るナノダイヤモンド粒子を得た。すなわち、比較例２に係るナノダイヤモンド粒子は還元処理を行なわない以外は実施例３と同様にして得られたものである。
　≪ＯＤＭＲ強度の評価≫
　以上のようにして得られた実施例３および比較例２に係るナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ強度を前述した蛍光顕微鏡（図１１参照）を用いて評価した。結果を図１９および図２０ならびに表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２中の蛍光発光量およびＯＤＭＲ強度の欄に示す数値は、図１９（実施例３）および図２０（比較例２）に示す視野画像中における蛍光発光量およびＯＤＭＲ強度である。図１９（Ａ）に示す画像は実施例３に係るナノダイヤモンド粒子の蛍光像を示している。図１９（Ａ）に示すように、この視野画像にはナノダイヤモンド粒子の蛍光発光による輝点が３点確認できる。また図１９（Ｂ）は同視野におけるＯＤＭＲ像を示している。図１９（Ｂ）には、図１９（Ａ）の輝点に対応して３点の輝点が明りょうに確認できる。したがって実施例３に係るナノダイヤモンド粒子はＯＤＭＲ活性である。
　他方、図２０（Ａ）は比較例２に係るナノダイヤモンド粒子の蛍光像であり、図２０（Ｂ）は同ナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ像である。図２０（Ａ）にはナノダイヤモンド粒子の蛍光発光による輝点が確認できるが、図２０（Ｂ）には輝点が確認できない。したがって比較例２に係るナノダイヤモンド粒子はＯＤＭＲ不活性である。
　以上の結果から、爆轟法によって得られたダイヤモンド粒子であっても、ヘテロ原子を含む官能基で表面を修飾することによって、ＮＶ（－）の存在率が増加しＯＤＭＲ強度が高められていることが確認できた。
　以上のように本発明の実施形態および実施例について説明を行なったが、上述の各実施形態および実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。
　今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
　１　炭素原子、２　窒素原子、３　空孔、４　窒素原子の非共有電子、５　余分な電子、６　炭素原子の不対電子、１０　光学顕微鏡、１１　光源、１２　励起フィルタ、１３　ダイクロイックミラー、１４　バンドフィルタ、１５　対物レンズ、２０　高周波磁場発生部、２１　発振器、２２　増幅部、２３　高周波コイル、２４　静磁場コイル、３０　変調部、３１　変換回路、４０　処理部、５０　入力装置、５１　出力装置、６０　検出部、７０　試料台、７１　試料、１００　ナノダイヤモンド粒子、１０１　蛍光分子プローブ。

Claims (14)

  1. 　ヘテロ原子を含む官能基で表面が修飾されている、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
  2. 　前記ヘテロ原子を含む官能基は、電子供与性官能基である、請求項１に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
  3. 　前記ヘテロ原子を含む官能基は、ヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれかである、請求項１または請求項２に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
  4. 　前記ヘテロ原子を含む官能基は、カルボキシル基である、請求項１に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
  5. 　前記ナノダイヤモンド粒子は、平均粒径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
  6. 　前記ＯＤＭＲ強度は、１～５ＧＨｚの高周波磁場を照射したときの、励起光による蛍光発光量の減少率である、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
  7. 　請求項１～請求項６のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子からなる粉末状試薬、または前記ナノダイヤモンド粒子を液体に分散させた試薬。
  8. 　ナノダイヤモンド粒子を準備する工程と、
    　前記ナノダイヤモンド粒子の表面に存在する官能基のうち１種以上のヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程と、を含む、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法。
  9. 　前記ヘテロ原子を含む官能基はヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれかであり、かつ前記処理を行なう工程は還元処理を行なう工程である、請求項８に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法。
  10. 　前記ヘテロ原子を含む官能基はカルボキシル基であり、かつ前記処理を行なう工程は酸化処理を行なう工程である、請求項８に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法。
  11. 　請求項１～請求項６のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を化学修飾した、蛍光分子プローブ。
  12. 　請求項１１に記載の蛍光分子プローブからなる粉末試薬、または前記蛍光分子プローブを液体に分散させた試薬。
  13. 　請求項１１に記載の蛍光分子プローブで標的タンパク質を標識する工程と、
    　標識された前記標的タンパク質に励起光および１～５ＧＨｚの高周波磁場を照射して、蛍光発光量が減少するピーク磁場周波数を検知することによって前記標的タンパク質の構造変化を検知する工程と、を備える、タンパク質の構造解析方法。
  14. 　前記検知する工程において、前記ピーク磁場周波数は静的な外部磁場の下で分裂しており、
    　前記検知する工程は、前記ピーク磁場周波数の分裂幅の大きさから、前記蛍光分子プローブに含まれるＮＶセンターの回転運動を検知する工程を含む、請求項１３に記載のタンパク質の構造解析方法。
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