CN105548555A - 一种基于无酶免疫传感器检测微囊藻毒素-lr的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微囊藻毒素-LR(MC-LR)的无酶免疫传感器的制备及其检测方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明在玻碳电极表面层层组装羧基化的碳纳米纤维和聚乙二醇，构筑高密度MC-LR抗原传感界面，合成金纳米粒子并制备金纳米粒子探针，采用间接竞争免疫分析原理，包被MC-LR抗原和MC-LR目标抗原竞争MC-LR抗体形成免疫复合物，将金纳米粒子探针与免疫复合物进行反应，电极表面键合的金纳米粒子氧化生成AuCl4 -，通过电化学测定AuCl4 -还原峰峰电流值的大小达到检测MC-LR的目的。本发明有利于高灵敏在线检测MC-LR，水样不必提纯处理，简单快速，检测体系无需酶的使用，降低了检测成本。

Description

一种基于无酶免疫传感器检测微囊藻毒素-LR的方法
技术领域
本发明属于免疫分析化学技术领域，特别涉及一种微囊藻毒素-LR的检测方法。
背景技术
1996年在巴西出现100多名急性肝功能故障、7个月内至少50人死于藻毒素产生的急性效应，引起举世关注。2007年5月，太湖蓝藻集中暴发而导致无锡部分地区自来水发臭，无法饮用。淡水水体中的蓝藻毒素已成为全球性的环境问题，世界各地经常发生蓝藻毒素中毒事件。最常见的蓝藻毒素是一种环状七肽毒素，即微囊藻毒素-LR(MC-LR)。由于该毒素对蛋白磷酸酶1和2A有显著的抑制作用，它可能对肝脏功能和结构造成极大的干扰。MC-LR是毒性最强的一种毒素，1998年，世界卫生组织(WTO)规定饮用水中的微囊藻毒素-LR含量不得高于1μg/L。因此，MC-LR的鉴定和定量检测在环境分析中具有重要的意义。
目前水体中的MC-LR的检测技术大多采用基于实验室分析的高效液相色谱、液相色谱-质谱及气象色谱-质谱联机检测方法，样品前处理过程复杂、耗时长，需要专业技术人员操作，检测费用高。
发明内容
本发明将碳纳米材料和聚乙二醇用于MC-LR的电化学免疫传感器的制备，并针对MC-LR高灵敏定量检测的需求，引入金纳米粒子的信号放大功能，构建超灵敏的MC-LR的电化学免疫分析方法，实现了MC-LR的无酶检测，降低了成本。
本发明的技术方案包括：羧基化碳纳米纤维修饰电极的制备、聚乙二醇的修饰、包被MC-LR抗原的修饰、金纳米粒子探针的制备、抗体和样品混合液的温育、抗体浓度的优化、金纳米粒子探针和免疫复合物的反应、电化学检测方法的构建、电化学检测条件的优化、标准曲线的绘制、实际样品的检测。
本发明中，基于无酶免疫传感器检测微囊藻毒素-LR的方法的具体步骤为：
(1)羧基化碳纳米纤维修饰电极的制备
a、将40mg直径30-100nm的碳纳米纤维分散在60mL溶质质量分数为30％的HNO3溶液中，混合超声搅拌均匀；
b、将步骤(1)a得到的混合液140℃油浴回流24h；
c、过滤、洗涤至pH为中性，得到水溶性较好的羧基化碳纳米纤维；
d、取5μL的1mg/mL步骤(1)c制备的羧基化碳纳米纤维的分散液均匀滴涂在直径3mm的表面洁净的玻碳电极表面，室温(25℃)下晾干，得到羧基化碳纳米纤维修饰电极，保存于4℃下备用；
(2)聚乙二醇的修饰
在步骤(1)制备的羧基化碳纳米纤维修饰电极表面均匀滴涂5μL的2mg/mL的聚乙二醇分散液，用于固定MC-LR，清洗晾干，保存于4℃备用；
(3)MC-LR抗原的修饰(包被MC-LR抗原)
在步骤(2)制备的电极表面滴加10μL浓度为500μg/L的MC-LR抗原溶液，在湿盒中温育1小时后，用pH为7.4的磷酸盐吐温缓冲液淋洗修饰电极后，再滴涂10μL的质量浓度为5％的牛血清蛋白溶液用于封闭电极上的未结合的活性位点，得到MC-LR免疫传感器，并保存于4℃备用，
其中，磷酸盐吐温缓冲液中Tween-20的质量浓度为0.05％，
牛血清蛋白可以跟所有位点都结合(包括特异性位点和非特异性位点)，当加入能进行特异性结合的其它蛋白后，由于特异性结合比非特异性结合更稳定，其它蛋白就会取代牛血清蛋白BSA所占据的特异性结合位点，而剩余的位点仍然被牛血清蛋白封闭，这样降低了位点与其他物质的吸附能力，减小了背景电流与误差造成的干扰，
(4)金纳米粒子探针的制备
a、将50mL质量浓度为0.01％氯金酸溶液加热至沸腾，剧烈搅拌下向其中迅速加入1.75mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，继续反应10min，即可得到粒径13nm的金纳米粒子胶体溶液；
b、取步骤(4)a得到的金纳米粒子胶体溶液用0.1M的K2CO3调至pH为9.0后，加入25μL的1mg/mL的羊抗鼠抗体，于室温搅拌2h；
c、将上述混合液先过滤，将得到的沉淀物用0.01M(pH7.4)磷酸缓冲溶液离心洗涤三次，用牛血清蛋白质量浓度1％的磷酸缓冲溶液分散，即得到标记羊抗鼠抗体的金纳米粒子(金纳米粒子探针)，保存于4℃备用，
金纳米粒子与羊抗鼠抗体进行结合的目的是通过羊抗鼠抗体能与MC-LR抗体结合进而引入信号探针金纳米粒子；再进行牛血清蛋白处理的目的：一是为了保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存，二是为防止或减小免疫金复合物的非特异吸附反应，
本发明中实现对MC-LR抗原高灵敏定量检测，是由于引入的羊抗鼠抗体能与MC-LR抗体结合，MC-LR抗体又能与MC-LR抗原特异性结合，因此，可以对MC-LR抗原进行定量检测；
(5)将5μL不同浓度的MC-LR抗原标准溶液或水样与5μL的MC-LR抗体溶液混合制备成温育液，将所得温育液滴到步骤(3)制备的MC-LR免疫传感器表面，并置于25℃湿盒中温育1h后，用0.01M的pH为7.4的PBST冲洗，保存于4℃备用，
作为优选：MC-LR抗体溶液为纯度为市售的1mg/ml的抗体溶液加水稀释120倍所得；
(6)将10μL步骤(4)制备的金纳米粒子探针的分散液滴涂到经过步骤(5)处理的电极表面，并置于25℃湿盒中温育1h后，用0.01M的pH为7.4的PBST冲洗，保存于4℃备用，
(7)电化学检测体系的构建
电化学检测MC-LR体系采用经典三电极工作体系：工作电极、参比电极和对电极，工作电极为经过步骤(6)处理的电极，对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极，测定液为2mL0.1M的HCl溶液，设置1.40V为氧化电位、30s为氧化时间；
(8)标准曲线的绘制
利用间接竞争免疫原理，温育液中MC-LR抗原与电极表面固定的MC-LR抗原竞争结合MC-LR抗体形成免疫复合物捕获金纳米粒子探针(Au-Ab2/anti-MC-LR/MC-LR)，金纳米粒子在0.1M的HCl溶液中被氧化生成AuCl4 -，随后AuCl4 -在电极表面被还原，建立还原峰峰电流值-MC-LR浓度标准曲线，
用固定抗原与待检抗原竞争性结合抗体，这里的竞争性结合指的是：温育液中抗原与抗体优先结合，竞争结合一部分抗体后，剩余抗体和固定在电极表面的抗原结合，所以最后金纳米粒子能被电极表面固定抗原所结合的抗体捕获，
因此，如果待测样本中无待检抗原，则检测信号最强；若有待检抗原，则检测信号随着待检抗原浓度的增加而减少，换句话说就是待检抗原的浓度与检测信号成反比，据此制作标准曲线，
(9)实际样品的检测
重复步骤(1)至步骤(7)的操作，只是将步骤(5)中所述的5μL不同浓度的MC-LR抗原标准溶液替换为5μL的待测水样；并根据步骤(8)中的方法进行电化学检测，根据测定到的还原峰峰电流值对应步骤(8)中建立的标准曲线，得出实际水样中MC-LR的浓度。
本发明的有益成果：在玻碳电极表面层层组装羧基化的碳纳米纤维和聚乙二醇，构筑高密度MC-LR抗原传感界面，合成金纳米粒子并构筑金纳米粒子探针，采用间接竞争免疫分析原理，包被MC-LR抗原和MC-LR目标抗原竞争结合MC-LR抗体形成免疫复合物，将金纳米粒子探针与免疫复合物进行反应，通过电化学测定金纳米粒子还原峰峰电流值的大小达到检测MC-LR的目的。该方法简单快速，成本低，灵敏度高，其检测限为1.68ng/L，利于MC-LR的在线检测。
附图说明
图1为MC-LR免疫传感器制备和检测原理示意图。
图2为MC-LR免疫传感器的脉冲伏安图(A)和金纳米粒子的还原峰峰电流值与MC-LR浓度的标准曲线图(B)。
具体实施方式
实施例1
羧基化碳纳米纤维的制备
a、将40mg直径60nm的碳纳米纤维分散在60mL溶质质量分数为30％的HNO3溶液中，混合超声搅拌均匀；
b、将步骤a得到的混合液140℃油浴回流24h；
c、过滤、洗涤至pH为7.0，得到水溶性较好的羧基化碳纳米纤维；
d、配制1mg/mL步骤c制备的羧基化碳纳米纤维的分散液；
实施例2
金纳米粒子及其标记羊抗鼠抗体的制备
a、将50mL质量浓度为0.01％氯金酸溶液加热至沸腾，剧烈搅拌下向其中迅速加入1.75mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，继续反应10min，即可得到粒径13nm的砖红色金纳米粒子胶体溶液；
b、取步骤a得到的金纳米粒子胶体溶液1mL用0.1M的K2CO3调至pH为9.0后，加入25μL的1mg/mL的羊抗鼠抗体，于室温搅拌2h；
c、将上述混合液先过滤，将得到的沉淀物用0.01M(pH7.4)磷酸缓冲溶液离心洗涤三次，用牛血清蛋白质量浓度1％的磷酸缓冲溶液300μL分散，即得到标记羊抗鼠抗体的金纳米粒子(金纳米粒子探针)，保存于4℃备用，制得的金纳米粒子标记抗体可在4℃保存一周左右而无明显活性降低；
实施例3
MC-LR免疫传感器的制备和检测步骤
直径3mm的玻碳电极分别经过0.3μm，0.05μm的Al2O3粉末上抛光后，依次在乙醇，去离子水中超声彻底洗涤，得到表面平滑光洁的电极，
在晾干的上述电极上滴涂5μL实施例1中制备的羧基化碳纳米纤维的分散液后，再滴涂5μL的2mg/mL的聚乙二醇-20000分散液，并于4℃饱和水蒸汽环境中放置过夜，通过物理吸附形成一层聚乙二醇薄膜；
在经过上述处理的修饰电极表面滴加10μL500μg/L的MC-LR抗原，25℃湿盒中物理吸附1h后，用pH为7.4的磷酸盐吐温缓冲液(0.05％Tween-20)淋洗修饰电极后，再滴涂10μL的质量浓度为5％的牛血清蛋白溶液(分散于0.01MpH7.4磷酸缓冲溶液中)用于封闭电极上的未结合的活性位点，再用0.01MpH7.4的PBST淋洗该修饰电极，得到MC-LR免疫传感器，并保存于4℃备用；
分别将5μL浓度为0.0025μg/L、0.025μg/L、0.05μg/L、0.25μg/L、0.5μg/L、2.5μg/L和5μg/L的MC-LR抗原标准溶液或水样与市售的1mg/ml的抗体溶液加水稀释120倍后所得的MC-LR抗体稀释液5μL，混合均匀制备成温育液，将所得温育液滴到上述MC-LR免疫传感器表面，将其置于25℃湿盒中温育1h，小心地用0.01MpH7.4PBST冲洗，保存于4℃备用；并将10μL实施例2制备的金纳米粒子探针滴涂到传感器表面，将其置于25℃湿盒中温育1h，小心地用0.01MpH7.4PBST冲洗，保存于4℃准备检测。
电化学检测MC-LR体系采用经典三电极工作体系：工作电极、参比电极和对电极，工作电极为经过上述处理的电极，对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极，测定液为2mL0.1M的HCl溶液，设置1.40V为氧化电位、30s为氧化时间；电化学检测采用示差脉冲伏安法，扫描电位从0.6V到0.1V，脉冲振幅50mV、脉冲宽度100ms。
实施例4
电化学免疫传感器的工作曲线的绘制
利用间接竞争免疫原理，温育液中MC-LR抗原与电极表面固定的MC-LR抗原竞争结合MC-LR抗体形成免疫复合物捕获金纳米粒子探针(Au-Ab2/anti-MC-LR/MC-LR)，电极上形成的免疫复合物捕获金纳米粒子探针，金纳米粒子在0.1M的HCl中被氧化生成AuCl4 -，随后，AuCl4 -在电极表面被还原。还原峰峰电流值随着温育液MC-LR浓度的增加而减小(图2A)。
如图2B所示，还原峰峰电流值的降低与温育溶液中待测MC-LR浓度对数在0.0025μg/L-5μg/L范围内成反比，线性相关系数为0.997，该免疫传感器的检出限为1.68ng/L。
实施例5
实际样品的检测
重复实施例1至实施例3的操作，只是将实施例3中的5μL不同浓度的MC-LR抗原标准溶液替换为5μL的待测水样，待测水样为太湖中两个区域的太湖水样；并根据实施例4中的方法进行电化学检测，根据测定到的还原峰峰电流值对应实施例4中建立的标准曲线，得出实际待测水样中MC-LR抗原的浓度分别为1.14±0.05μg/L和5.22±0.02μg/L。用回收率实验来鉴定所提出方法的可靠性，所得回收率均分别为98.0±1.4％和99.2±2.3％，说明此方法准确度很好，该方法能用于水样中MC-LR免疫分析。

Claims (8)

1.一种基于无酶免疫传感器检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：所述的方法为，
(1)羧基化碳纳米纤维修饰电极的制备；
(2)聚乙二醇的修饰；
(3)MC-LR抗原的修饰；
(4)金纳米粒子探针的制备；
(5)将5μL不同浓度的MC-LR抗原标准溶液与5μL的MC-LR抗体溶液混合制备成温育液，将所得温育液滴涂到步骤(3)制备的MC-LR免疫传感器表面，并置于25℃湿盒中温育1h后，用0.01M的pH为7.4的PBST冲洗，保存于4℃备用；
(6)将10μL步骤(4)制备的金纳米粒子探针的分散液滴涂到经过步骤(5)处理的电极表面，并置于25℃湿盒中温育1h后，用0.01M的pH为7.4的PBST冲洗，保存于4℃备用；
(7)电化学检测体系的构建；
(8)标准曲线的绘制
利用间接竞争免疫原理，建立还原峰峰电流值-MC-LR浓度标准曲线；
(9)实际样品的检测
重复步骤(1)至步骤(7)的操作，只是将步骤(5)中所述的5μL不同浓度的MC-LR抗原标准溶液替换为5μL的待测水样；并根据步骤(8)中的方法进行电化学检测，根据测定到的还原峰峰电流值对应步骤(8)中建立的标准曲线，得出实际水样中MC-LR的浓度。
2.如权利要求1所述的基于无酶免疫传感器检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：步骤(1)中羧基化碳纳米纤维修饰电极的制备方法为，
a、将40mg直径30-100nm的碳纳米纤维分散在60mL溶质质量分数为30％的HNO3溶液中，混合超声搅拌均匀；
b、将步骤a得到的混合液140℃油浴回流24h；
c、过滤、洗涤至pH为中性，得到水溶性较好的羧基化碳纳米纤维；
d、取5μL的1mg/mL步骤c制备的羧基化碳纳米纤维的分散液均匀滴涂在直径3mm的表面洁净的玻碳电极表面，室温下晾干，得到羧基化碳纳米纤维修饰电极，保存于4℃下备用。
3.如权利要求1所述的基于无酶免疫传感器检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：步骤(2)中聚乙二醇的修饰方法为，
在步骤(1)制备的羧基化碳纳米纤维修饰电极表面均匀滴涂5μL的2mg/mL的聚乙二醇分散液，用于固定MC-LR，清洗晾干，保存于4℃备用。
4.如权利要求1所述的基于无酶免疫传感器检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：步骤(3)中MC-LR抗原的修饰方法为，
在步骤(2)制备的电极表面滴加10μL浓度为500μg/L的MC-LR抗原溶液，在湿盒中温育1小时后，用pH为7.4的磷酸盐吐温缓冲液淋洗修饰电极后，再滴涂10μL的质量浓度为5％的牛血清蛋白溶液用于封闭电极上的未结合的活性位点，得到MC-LR免疫传感器，并保存于4℃备用。
5.如权利要求1所述的基于无酶免疫传感器检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：步骤(4)中金纳米粒子探针的制备方法为，
a、将50mL质量浓度为0.01％氯金酸溶液加热至沸腾，剧烈搅拌下向其中迅速加入1.75mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，继续反应10min，即可得到粒径13nm的金纳米粒子胶体溶液；
b、取步骤a得到的金纳米粒子胶体溶液用0.1M的K2CO3调至pH为9.0后，加入25μL的1mg/mL的羊抗鼠抗体，于室温搅拌2h；
c、将上述混合液先过滤，将得到的沉淀物用0.01M、pH为7.4的磷酸缓冲溶液离心洗涤三次，用牛血清蛋白质量浓度1％的磷酸缓冲溶液分散，即得到标记羊抗鼠抗体的金纳米粒子，即金纳米粒子探针，保存于4℃备用。
6.如权利要求1所述的基于无酶免疫传感器检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：步骤(7)中电化学检测体系的构建方法为，
电化学检测MC-LR体系采用经典三电极工作体系：工作电极、参比电极和对电极，工作电极为经过步骤(6)处理的电极，对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极，测定液为2mL0.1M的HCl溶液。
7.如权利要求4所述的基于无酶免疫传感器检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：所述的磷酸盐吐温缓冲液中Tween-20的质量浓度为0.05％。
8.如权利要求1所述的基于无酶免疫传感器检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的MC-LR抗体溶液为纯度为市售的1mg/ml的抗体溶液加水稀释120倍所得。
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