CN111638326B - 一种无酶聚合物免疫探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种无酶聚合物免疫探针及其制备方法和应用，属于生物传感技术领域；本发明中首先将金纳米粒子、壳聚糖和Fc纳米球悬浊液混合制备了金纳米粒子功能化的二茂铁二甲酸Fc@AuNPs，并将其与金黄色葡萄球菌抗体反应生成免疫探针，最后将免疫探针组装成传感器，用于检测金黄色葡萄球菌；所述传感器能够快速、高效、灵敏的检测牛奶中金黄色葡萄球菌；所述金黄色葡萄球菌的检测范围为1.62×102~1.62×108 CFU/mL，检测限为63 CFU mL‑1。

Description

一种无酶聚合物免疫探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，提供了一种无酶聚合物免疫探针及其制备方法和应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(S.aureus)是一种较为常见的致病菌。其以视频为繁殖载体，在代谢活动中产生肠毒素，进而通过食物链进入人体引起食物中毒；并且金黄色葡萄球菌会导致奶牛患乳腺炎，造成奶业严重经济损失。因此研究出快速、高效的检测方法具有实际研究意义。
金黄色葡萄球菌的检测方法主要有酶学显色检测法、免疫检测法、分子检测法等。基于特异性分泌酶进行显色培养的酶学显色检测法易出现检测结果的假阳性。基于全细胞或菌体特征性物质“抗体－抗原”结合识别原理的免疫检测法虽然特异性强，但是对所用生物制剂要求很高。基于基因扩增分析的分子检测法所需的检测费用太高。因此，亟需研究出一种能够满足现阶段食品安全需求的金黄色葡萄球菌检测方法
发明内容
本发明的目的在于提供一种无酶聚合物免疫探针及其制备方法和应用。本发明中，首先将金纳米粒子、壳聚糖和Fc纳米球悬浊液混合制备了金纳米粒子功能化的二茂铁二甲酸Fc@AuNPs，并将其与金黄色葡萄球菌抗体反应生成免疫探针，最后将免疫探针组装成传感器，用于检测金黄色葡萄球菌。所述传感器能够快速、高效、灵敏的检测牛奶中金黄色葡萄球菌。
为了解决上述问题，本发明首先提供了一种无酶聚合物免疫探针，所述免疫探针基于金纳米粒子功能化的二茂铁二甲酸(Fc@AuNPs)与金黄色葡萄球菌抗体组装而成。
本发明还提供了所述无酶聚合物免疫探针的制备方法，具体制备步骤如下所示：
(1)金纳米粒子(AuNPs)溶液的制备：
先取用适量HAuCl4溶液，加热并不断搅拌至沸腾，再向其中加入柠檬酸三钠溶液，继续加热至溶液颜色变深，然后停止加热，冷却到室温，最后放置冰箱保存，备用；
其中步骤(1)中HAuCl4溶液的摩尔浓度为0.3mM，柠檬酸三钠溶液中柠檬酸三钠的质量分数为1％，HAuCl4溶液与柠檬酸三钠的体积比为40:1。
(2)壳聚糖(CS)溶液的制备：
取一定量的壳聚糖与醋酸溶液混合，超声搅拌至溶解，制得壳聚糖溶液，储存于冰箱中备用；
其中，所述醋酸溶液为醋酸与二次蒸馏水配制，溶液中醋酸的质量分数为1％；制得的壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为1％。
(3)Fc纳米球悬浊液的制备：
将二茂铁二甲酸溶于适量甲醇，在自然光下照射2h并不断搅拌至混合溶液呈灰褐色，然后离心得到Fc纳米球沉淀，蒸馏水洗涤、过滤，然后将Fc纳米球固体分散于一定量超纯水中得到Fc纳米球悬浊液，储存于冰箱中备用；
所述二茂铁二甲酸在甲醇中的浓度为2mg mL-1，所述超纯水的用量为2～5mL。
(4)金纳米粒子功能化的二茂铁二甲酸(Fc@AuNPs)的制备
将Fc纳米球悬浊液与步骤(1)中的AuNPs溶液、步骤(2)中的壳聚糖溶液混合反应，反应中不断搅拌，反应结束后离心后取沉淀、蒸馏水洗涤、过滤，得到Fc@AuNPs固体，将其分散于一定量的超纯水中，得到Fc@AuNPs悬浊液，储存于冰箱中备用；
其中Fc纳米球悬浊液、AuNPs溶液、壳聚糖溶液的体积比范围为5：1～1.5：1～2，所述超纯水的用量为2～5mL。
(5)无酶聚合物免疫探针的制备：
将步骤(4)中制备的Fc@AuNPs悬浊液与金黄色葡萄球菌抗体混匀，在37℃下反应40min，反应过程中不断搅拌，反应结束后离心取沉淀，然后蒸馏水洗涤、过滤，最后将其分散于一定量的PBS溶液中，得到无酶聚合物免疫探针；
其中，所述金黄色葡萄球菌抗体浓度为80μg mL-1，Fc@AuNPs悬浊液与金黄色葡萄球菌抗体的体积比范围为5：1～1.5，所述PBS溶液的pH为7.4，添加量为2～5mL。
本发明还提供了一种免疫传感器，所述传感器包括工作电极、辅助电极和参比电极；所述工作电极含有无酶聚合物免疫探针；所述辅助电极为铂丝电极；所述参比电极为饱和甘汞电极。所述传感器的具体制备方法如下：
(1)工作电极的预处理
将裸玻碳电极依次用粒径为0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末反复打磨至镜面，再依次HNO3水溶液(HNO3和水的体积比为1:1)、质量浓度为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗3min：然后用0.5M H2SO4对裸电极进行循环伏安扫描，扫描范围为-0.4～0.8V，直至电极的循环伏安图稳定；再用质量浓度为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗180s，最后用氮气吹干备用。
(2)免疫传感器的组装
将预处理后的电极浸入到HAuCl4和H2SO4溶液中，在-0.2V电压下电沉积180s后用PBS冲洗电极表面，然后将抗体溶液滴加到电极表面，在4℃下反应1h之后用PBS冲洗电极；接着向上述电极表面滴加1％牛血清蛋白(BSA)溶液，温育30min后用PBS溶液清洗，然后将金黄色葡萄球菌溶液滴加在修饰抗体的电极表面，反应40min后用PBS清洗，最后将制备的无酶聚合物免疫探针滴加到电极表面，反应30min后用PBS清洗，得到基于无酶聚合物免疫探针而制备的工作电极；
将制备的工作电极、辅助电极铂丝电极和参比电极饱和甘汞电极作组装，得到免疫传感器。
步骤(2)中，所述HAuCl4的浓度为1mmol/L；所述H2SO4溶液的浓度为0.5mol/L；所述金黄色葡萄球菌抗体溶液的浓度为80μg mL-1；所述金黄色葡萄球菌溶液的浓度为1.62×105CFU mL-1；加至电极表面的抗体、金黄色葡萄球菌、BSA-PBS溶液、免疫探针的体积均为15μL。
本发明还提供了所述免疫传感器在检测牛奶中的金黄色葡萄球菌的应用；所述检测方法为将免疫传感器置于含不同浓度金黄色葡萄球菌的PBS溶液中进行差分脉冲伏安法(DPV)检测，以金黄色葡萄球菌浓度的对数为横坐标，对应的峰电流为纵坐标绘制标准曲线，进而得到相应的线性回归方程。
其中，所述差分脉冲伏安法检测的条件为：扫描电位为0.1-0.6V，电位阶差为4mV，频率为25Hz，振幅为60mV；所述金黄色葡萄球菌浓度为1.62×102～1.62×108CFU/mL时，检测的线性回归方程为：I＝0.7686lgC+1.5123，线性相关系数R2为0.994，最低检测限为63CFU mL-1。
原理：电化学免疫传感器是以抗原与抗体之间的特异性免疫反应为基础，将抗体作为分子识别元件固定在转换器上，利用电化学工作站将生物化学信号转换为电化学信号的一类电化学生物传感器。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
Fc是一种新型纳米材料，呈球形有较大的比表面积、较高的的导电率和电子传递性能。此外，AuNPs具有良好的生物相容性，可以捕获更多的抗体并放大电信号。Fc@AuNPs作为新型复合材料融合了两种材料的优良特性还具有特殊的电学稳定性易于生物交联和水溶性好的优点，在电学传感器设计中具有极大的应用前景。
本发明中利用差分脉冲伏安法来测定金黄色葡萄球菌，与现有技术中利用循环伏安法测定金黄色葡萄球菌相比，差分脉冲伏安法具有更高的灵敏度以及可以有效的消除背景信号的干扰。
本发明中构建的无酶电化学传感器是基于纳米材料修饰电极，利用Fc@AuNPs的电化学活性进行检测。因此，传感器检测性能受外界环境的影响较小，稳定性较好。此外，在此电化学传感器构建过程中，由于修饰电极的方法和纳米材料的用量可控，因此其重现性较高。相比于传统的分析检测方法，该技术用于牛奶中金黄色葡萄球菌的检测大大缩短了分析时间、操作简单、灵敏度高、成本低。与现有的其他电学传感器相比，本发明制备的传感器具有更高的灵敏度，更宽的检测范围。
附图说明
图1是实施例1中Fc纳米球的电镜图。
图2是实施例1中Fc@AuNPs的电镜图。
图3是检测不同浓度的金黄色葡萄球菌的DPV图由上至下依次为1.62×107，1.62×106，1.62×105，1.62×104，1.62×103，1.62×102，0。
图4是不同浓度金黄色葡萄球菌DPV峰电流的标准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，其目的在于更好的理解本发明的技术内涵，但是本发明的保护范围不限于以下的实施范围。
实施例1.制备无酶聚合物免疫探针
(1)金纳米粒子(AuNPs)的制备
先取用100mL 0.01％的HAuCl4溶液，加热并不断搅拌至沸腾，再向其中加入2.5mL1％的柠檬酸三钠，继续加热至溶液颜色变深，然后停止加热，冷却到室温，最后放置冰箱保存。
(2)壳聚糖(CS)溶液的制备
取1mL醋酸加入到99mL二次蒸馏水中稀释，取稀释后的醋酸溶液2mL，加入0.02g壳聚糖，超声搅拌至溶解，制得的壳聚糖溶液，将其置于4℃的冰箱中保存。
(3)Fc纳米球的制备
将50mg二茂铁二甲酸溶于25mL甲醇溶液得到橙色溶液，在自然光下照射2h并不断搅拌至混合溶液呈灰褐色，然后在8000rpm下离心10min，得到Fc纳米球固体，蒸馏水洗涤、过滤，然后将Fc纳米球固体分散于5mL超纯水中得到Fc纳米球悬浊液，储存于冰箱中备用。
采用透射电子显微镜对本步骤中制备得到的Fc纳米球考察得到如图1所示的Fc纳米球的电镜图，从中可以看到Fc纳米球粒径为180nm左右。
(4)金纳米粒子功能化的二茂铁二甲酸(Fc@AuNPs)的制备
将500μL步骤(3)中的Fc纳米球悬浊液与500μL步骤(1)中的AuNPs溶液、200μL步骤(2)中的壳聚糖(CS)溶液混合反应1h，反应过程中不断搅拌。将搅拌后的混合溶液离心取沉淀、蒸馏水洗涤三次，、过滤，得到Fc@AuNPs固体，将其分散于1mL的超纯水中，得到Fc@AuNPs悬浊液，储存于冰箱中备用。
采用透射电子显微镜对本步骤中制备得到的Fc@AuNPs纳米球考察后得到如图2所示的Fc@AuNPs的电镜图，从中可以看到Fc纳米球均匀表面包裹了大量AuNPs。
(5)无酶聚合物免疫探针的制备
取1mL步骤(4)中制备的Fc@AuNPs悬浊液与200μL 80μg·mL-1金黄色葡萄球菌抗体混匀置于37℃下反应40min并不断搅拌，然后离心取沉淀，然后蒸馏水洗涤、过滤，最后将其分散于400μL pH值为7.4的PBS溶液中，得到无酶聚合物免疫探针。
实施例2.免疫传感器的组装：
(1)工作电极的预处理
将裸玻碳电极依次用粒径为0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末反复打磨至镜面，再依次用体积比为1:1的HNO3水溶液、质量浓度为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗3min：然后用0.5M H2SO4对裸电极进行循环伏安扫描，扫描范围为-0.4-0.8V,直至电极的循环伏安图稳定；再用质量浓度为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗180s，最后用氮气吹干备用。
(2)工作电极的修饰和传感器的组装
将预处理后的电极浸入到1mmol L-1HAuCl4和0.5mol L-1H2SO4溶液中，在-0.2V电压下电沉积180s后用PBS冲洗电极表面，然后将15μL 1.62×105CFU mL-1的金黄色葡萄球菌抗体溶液滴加到电极表面，在4℃下反应1h后用PBS冲洗，接着在电极表面滴加15μL含1％牛血清蛋白(BSA)的PBS溶液，温育30min后用PBS清洗，然后将15μL 1.62×105CFU mL-1金黄色葡萄球菌溶液滴加在修饰抗体的电极，反应40min后用PBS清洗，最后将制备的免疫探针滴加到电极表面，反应30min后用PBS清洗，得到基于免疫探针而制备的工作电极。
将制备的工作电极、辅助电极铂丝电极和参比电极饱和甘汞电极作组装，得到免疫传感器。
实施例3.金黄色葡萄球菌的检测
(1)绘制标准曲线：
将实施例2中制备的免疫传感器置于PBS缓冲溶液中进行差分脉冲伏安法(DPV)分别检测浓度为0、1.62×102、1.62×103、1.62×104、1.62×105、1.62×106、1.62×107和1.62×108的金黄色葡萄球菌溶液的电流情况，检测条件为：扫描电位0.1-0.6V，电位阶差4mV，频率25Hz，振幅60mV，并记录对应的峰电流。
图3为本实施例中不同浓度的金黄色葡萄球菌在0.1-0.6V电压下的DPV图，图中曲线由下至上分别为浓度为0、1.62×102、1.62×103、1.62×104、1.62×105、1.62×106、1.62×107和1.62×108的金黄色葡萄球菌溶液的电流情况。
以金黄色葡萄球菌浓度的对数为横坐标，该浓度所对应的峰电流为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线如图4所示。然后通过分析计算得出线性回归方程为I＝0.7686lgC+1.5123，线性检测范围为1.62×102～1.62×108CFU mL-1，最低检测限为63CFU mL-1。本发明所制备的传感器与现有的传感器相比，在检测金黄色葡萄球菌时具有更高的灵敏度和更宽的检测范围。
(2)检测效果的验证：
其中回收率为传感器检测出金黄色葡萄球菌浓度与金黄色葡萄球菌标准品浓度之比。回收率可以说明所制得传感器的准确度，越接近100％，说明准确度越高。
(3)实际样品的检测
本实验中对在保质期内和开封后放置30天的纯牛奶和酸奶(均为蒙牛品牌，购自江苏大学校园超市)分别做加标回收实验。
a.保质期内对两种样品的检测：
开封前先用酒精棉擦拭封口处，开封后设试验组1-4，4个试验组的加标样品采用以下制备过程：首先将1mL样品用PBS稀释至10mL，从中取1mL样品稀释液并分别加入一定量的金黄色葡萄球菌标准溶液，然后分别实施例2中制备的免疫传感器和平板涂布法对试验组1-4中平板涂布前的样品进行检测。
表1加标样品的配方
通过计算，测得1-4样品的回收率分别为90.2％，104.5％，88.7％，108.5％，由此可知该免疫传感器准确度较高。
b.开封后样品的检测：
分别将开封后的纯牛奶与酸奶放置30天，然后设试验组5-8，4个试验组的加标样品采用以下制备过程：首先将1mL样品用PBS稀释至10mL，从中取1mL样品稀释液并分别加入一定量的金黄色葡萄球菌标准溶液，然后分别实施例2中制备的免疫传感器和平板涂布法对试验组5-8中平板涂布前的样品进行检测。
表2加标样品的配方
通过计算，测得5-8样品的回收率分别为92.3％，90.4％，89.8％，106.2％。
实施例4.特异性试验
本实施例中考察了实施例2中制备的免疫传感器的检测特异性，将浓度为106CFU/mL金黄色葡萄球菌作为试验组，大肠杆菌、李斯特菌、副溶血弧菌三种干扰菌和空白作为对照组，其中干扰菌的浓度为106CFU/mL，然后用实施例2中制备的免疫传感器分别检测试验组和对照组的响应电流。
检测结果显示，金黄色葡萄球菌标准溶液的响应电流为5.92μA，大肠杆菌、李斯特菌、副溶血弧菌和空白的响应电流分别0.75、0.82、0.79和0.9μA，金黄色葡萄球菌+大肠杆菌、金黄色葡萄球菌+李斯特菌和金黄色葡萄球菌+副溶血弧菌的响应电流为5.72、5.86和5.96μA。
从结果中可以发现，免疫传感器检测干扰菌溶液和不加菌的溶液时的响应电流相差不大，当其检测金黄色葡萄球菌是电流信号显著增加；而免疫传感器用于检测金黄色葡萄球菌和干扰菌的混合液时，电流信号相比只检测干扰菌溶液时的电流信号显著增加，但其电流响应值与只检测金黄色葡萄球菌相比，没有明显的变化。因此，本发明制备的免疫传感器具有良好的检测特异性。
实施例5.重现性试验
本实施例中考察了免疫传感器的重现性，在同一批次中制备了8个免疫传感器，分别用8个免疫传感器检测相同浓度的金黄色葡萄球菌，测试结果的相对标准偏差(RSD)为5.7％，表明该传感器具有良好的重现性。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种无酶聚合免疫探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）Fc@AuNPs的制备：
将Fc纳米球悬浊液与AuNPs溶液、壳聚糖溶液混合反应，反应过程中不断搅拌，反应结束后离心取沉淀、将沉淀用蒸馏水洗涤、过滤后，得到金纳米粒子功能化的二茂铁二甲酸Fc@AuNPs固体，将其分散于一定量的超纯水中，得到Fc@AuNPs悬浊液，储存于冰箱中备用；所述Fc纳米球悬浊液、AuNPs溶液、壳聚糖溶液的体积比5 ：1~1.5：1~2，所述超纯水的用量为5 mL；所述反应时间为1h；
（2）无酶聚合物免疫探针的制备：
将步骤（1）中制备的Fc@AuNPs悬浊液与金黄色葡萄球菌抗体混匀，在37 ℃下反应40min，反应过程中不断搅拌， 反应结束后离心取沉淀，然后蒸馏水洗涤、过滤，最后将其分散于一定量的PBS溶液中，得到无酶聚合物免疫探针；所述金黄色葡萄球菌抗体浓度为80 μg/mL，Fc@AuNPs悬浊液与金黄色葡萄球菌抗体的体积分别为5 mL、1 mL，所述PBS溶液pH值为7.4，其添加量为2 mL。
2.一种权利要求1所述方法制备的无酶聚合物免疫探针，其特征在于，所述免疫探针基于金纳米粒子功能化的二茂铁二甲酸Fc@AuNPs与金黄色葡萄球菌抗体组装而成。
3.一种基于权利要求2所述无酶聚合物免疫探针制备的免疫传感器，其特征在于，所述传感器包括工作电极、辅助电极和参比电极；所述工作电极中含有无酶聚合物免疫探针；所述辅助电极为铂丝电极；所述参比电极为饱和甘汞电极。
4.根据权利要求3所述的免疫传感器，其特征在于，采用如下方法制备：将预处理后的电极浸入到HAuCl4和H2SO4溶液中电沉积，接着用PBS冲洗电极表面，然后分别向电极表面滴加金黄色葡萄球菌抗体溶液、含1%牛血清蛋白的PBS溶液、金黄色葡萄球菌溶液和免疫探针，滴加后均进行一段时间的反应，反应后用PBS清洗，得到基于免疫探针制备的工作电极；
将制备的工作电极、辅助电极铂丝电极和参比电极饱和甘汞电极作组装，得到免疫传感器。
5. 根据权利要求4所述的免疫传感器，其特征在于，步骤（2）中，所述HAuCl4的浓度为1mmol L-1 ；所述H2SO4溶液的浓度为0.5 mol/L；所述金黄色葡萄球菌抗体溶液的浓度为80µg mL-1；所述金黄色葡萄球菌溶液的浓度为1.62×105 CFU mL-1；所述金黄色葡萄球菌抗体溶液、含1%牛血清蛋白的PBS溶液、金黄色葡萄球菌溶液和免疫探针的体积均为15μL。
6.权利要求3所述的免疫传感器在检测金黄色葡萄球菌中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为检测牛奶中的金黄色葡萄球菌。
8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：免疫传感器标准曲线的建立和实际牛奶样品的检测；所述标准曲线为：当金黄色葡萄球菌浓度为1.62×102~1.62×108 CFU mL-1时，检测的线性回归方程为：I=0.7686lgC+1.5123，线性相关系数R 2为0.994,最低检测限为63 CFU mL-1。
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