CN111721826A - 一种基于镧系金属自发光Eu-MOFs的竞争型免疫传感器的制备方法 - Google Patents

一种基于镧系金属自发光Eu-MOFs的竞争型免疫传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于新型自发光纳米多孔材料Au@Eu‑MOFs的竞争型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，属于电化学发光传感器领域，首次以自发光纳米多孔材料Au@Eu‑MOFs为电化学发光信号源，利用Ni x Fe (1‑x) (CO) y (OH) z • w H2O纳米花较传统二维片状材料拥有大的比表面积、暴露更多的活性位点增加抗体的固载量，根据不同浓度抗原引起的电化学发光信号强度的不同，实现对呕吐毒素DON的检测。

Description

一种基于镧系金属自发光Eu-MOFs的竞争型免疫传感器的制 备方法
技术领域
本发明涉及一种基于镧系金属自发光Eu-MOFs的竞争型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用。具体涉及自发光标记纳米材料Au@Eu-MOFs和花状基底纳米材料Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O的制备及其在电致化学发光传感器中的应用。利用花状结构Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O较单纯二维基底材料富含更多的活性位点可负载更多的抗体的特性，以及金纳米颗粒优良的生物兼容性及自发光Eu-MOFs纳米材料大的比表面积、高的孔隙率达到放大传感器光信号输出及拓宽检测线性范围的目的。本发明属于电化学发光检测技术领域。
背景技术
呕吐毒素的主要成分为水溶性脱氧雪腐镰刀菌醇（DON），是一种有毒次生代谢产物，是谷物产品中最常见对的真菌毒素之一，属于单端孢霉烯族化合物。单端孢霉烯族化合物的种类共有150多种，是一类强有力免疫抑制剂，会引起的典型症状为牲畜采食量降低，在这类毒素中DON是其中最重要的一种毒素。此外，不仅可以引起牲畜的不良反应，对人体也有一定的危害作用，而且作为一种潜在的有机污染物对水环境质量构成了严重威胁，已被欧盟分类标准为三级致癌物。故寻找一种可以简便快捷灵敏的DON检测方法有着重要意义。电化学发光方法消耗低、容易控制、灵敏度高且检测限低，具有电化学和化学发光两种方法的优势，是一种环境友好型方法。因此本发明设计了一种竞争型电致化学发光免疫分析方法用于谷物食品中DON的检测。
在本发明中，首次使用一种新型自发光纳米多孔材料Au@Eu-MOFs作为标记材料引入到电化学发光领域。一般传统的电致化学发（ECL）会依赖于Ru(bpy)3 2+、鲁米诺等典型的具有发光性能的发光体，其实验操作需要首先找到适合负载这些发光体的功能材料，如具较大的孔隙率、尺寸合适的孔径以及表面是否有可连接的官能团和可进行静电吸附的电荷，并设法将这些功能材料和发光体复合到一起。这样虽然可以达到化学发光的效果，但负载其表面的发光体经常会因为结合力不强导致脱落，对传感器的稳定性影响非常大，从而输出不确定的检测结果。所以，采用自发光材料来构建化学发光传感器就可以非常有效的避免这一困扰。镧系金属元素通常有很强的荧光发射，其中一些像Eu离子的荧光寿命较长可达到1~2 ms。经实验证明，基于镧系金属Eu元素合成的Eu-MOFs有着非常强烈的ECL发射行为。将金纳米颗粒修饰到其表面后，也会曾强ECL发射强度。这不仅保障了Au@Eu-MOFs可以输出强且稳定的ECL信号，大大简化了实验步骤，而且还提高了其生物相容性。另外我们利用Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O纳米花作为基底材料，较二维片状、球状或n面体材料具有更大的比表面积，可以暴露更多的活性位点来连接DON抗体。从而可以更加精准的捕获DON，大大的提高ECL免疫传感器的灵敏度。本发明的原理是基于DON标准溶液和DON抗体的结合能力大大强于Au@Eu-MOFs标记的DON-BSA偶联抗原，随着DON标准溶液浓度的变大，和DON抗体结合的Au@Eu-MOFs标记偶联抗原就越少，ECL发光强度逐渐减弱。此外，本发明设计的竞争型免疫传感器也为其它真菌毒素分析物的检测提供了一种新方法。目前基于自发光纳米材料Au@Eu-MOFs构建竞争型ECL免疫传感器来检测己烯雌酚的方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种更简单可靠的基于自发光纳米材料Au@Eu-MOFs的电致化学发光免疫传感器的制备方法和应用，实现对真菌毒素DON的快速、灵敏、特异、高效检测。
本发明的技术方案如下：
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1. 纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O、自发光纳米多孔材料Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原孵化物溶液的制备
（1）纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O的制备
将130 mg ~ 170 mg六水合硝酸镍、130 mg ~ 170 mg九水合硝酸铁、20 mg ~ 30 mg尿素和60 mg ~ 80 mg柠檬酸三钠加入10 mL ~ 30 mL超纯水中，磁力搅拌5 min，得到Ni和Fe比率为1:1的混合溶液，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，140 ℃ ~ 160 ℃反应24 h ~ 72 h，得到棕褐色产物，超纯水和乙醇分别洗涤两次，40 ℃ ~ 60 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O；
（2）自发光纳米多孔材料Au@Eu-MOFs的制备
将30 mg ~ 40 mg六水合氯化铕和5 mmoL ~ 15 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的混合溶液中，磁力搅拌1 h ~ 3 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，140 ℃ ~ 160 ℃反应6 h ~ 18 h，乙醇和超纯水分别洗涤两次，40 ℃ ~ 60 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Eu-MOFs，将30 mg ~ 50 mg纳米多孔Eu-MOFs分散在50 mL超纯水中，加入1 mL ~ 3 mL、1% ~ 3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入4 mg ~6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70 mg ~ 90 mg还原剂柠檬酸三钠，0.5 mg ~ 1 mg硼氢化钠，室温下搅拌8 h ~ 12 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Eu-MOFs；
（3）Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原孵化物溶液的制备
将6 mg ~ 10 mg的Au@Eu-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入4 μL ~ 6 μL、6 mg/mL的DON-BSA偶联抗原，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h ~ 24 h，4 ℃离心分离洗去未结合的DON-BSA偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2 h ~ 4 h封闭DON-BSA偶联抗原表面的非特异性活性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH 7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL的Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原溶液，储存于4 ℃中备用。
2. 一种基于镧系金属自发光Au@Eu-MOFs的竞争型免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将6 µL、0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O纳米花水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；
（3）将2 μL ~ 4 μL、10 mg NHS和20 mg EDC的混合溶液滴于电极表面用来活化Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O表面的羧基基团，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，晾干；
（4）将6 μL、8 μg/mL ~ 12 μg/mL的DON抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过酰胺反应和基底材料连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
（5）将2 μL ~ 4 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
（6）将6 μL、一定浓度的DON标准溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4℃晾干；
（7）将6 μL、0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL的Au@Eu-MOFs标记DON-BSA孵化抗原溶液滴加到电极表面，4 ℃晾干，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Eu-MOFs的竞争型电致化学发光免疫传感器。
3. 电致化学发光传感器用于待测样品的电化学发光检测：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光传感器修饰的玻碳电极为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 V，循环伏安扫描电位范围为0~ 1.4 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的含浓度为1 mmol/L ~ 12 mmol/L三丙胺的PBS缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的DON标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替标准溶液进行测定。
本发明的有益成果
（1）首次以自发光纳米材料Au@Eu-MOFs用于电致化学发光传感器的构建中，利用Au@Eu-MOFs高且稳定的发光效率来提高传感器光信号的稳定输出，从而获得更高的灵敏度；
（2）采用Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O纳米花作为基底材料，较二维片状、球状或n面体材料具有更大的比表面积，可以暴露更多的活性位点来连接DON抗体，更加精准的捕获DON分子，同样可以大大提高传感器的灵敏度；
（3）本发明首次将自发光纳米多孔Au@Eu-MOFs和RNi x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O纳米花相结合用于电致化学发光传感器的构建，基于此构建的传感器可应用于真菌毒素DON的临床检测，具有操作简单，检测快速，信号线性范围宽（0.05 μg/mL ~ 30 μg/mL）和检出限低（0.017 μg/mL）的优点。
实施例1
纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O、自发光纳米多孔材料Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原孵化物溶液的制备
（1）纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O的制备
将130 mg六水合硝酸镍、130 mg九水合硝酸铁、20 mg尿素和60 mg柠檬酸三钠加入10mL超纯水中，磁力搅拌5 min，得到Ni和Fe比率为1:1的混合溶液，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，140 ℃反应24 h，得到棕褐色产物，超纯水和乙醇分别洗涤两次，40 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O；
（2）自发光纳米多孔材料Au@Eu-MOFs的制备
将30 mg六水合氯化铕和5 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的混合溶液中，磁力搅拌1 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，140 ℃反应6 h，乙醇和超纯水分别洗涤两次，40 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Eu-MOFs，将30 mg纳米多孔Eu-MOFs分散在50 mL超纯水中，加入1 mL、1%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入4 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70 mg还原剂柠檬酸三钠，0.5 mg硼氢化钠，室温下搅拌8 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Eu-MOFs；
（3）Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原孵化物溶液的制备
将6 mg的Au@Eu-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入4 μL、6 mg/mL的DON-BSA偶联抗原，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h，4 ℃离心分离洗去未结合的DON-BSA偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2 h封闭DON-BSA偶联抗原表面的非特异性活性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH 7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5 mg/mL的Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原溶液，储存于4 ℃中备用。
实施例2
纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O、自发光纳米多孔材料Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原孵化物溶液的制备
（1）纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O的制备
将150 mg六水合硝酸镍、150 mg九水合硝酸铁、25 mg尿素和70 mg柠檬酸三钠加入20mL超纯水中，磁力搅拌5 min，得到Ni和Fe比率为1:1的混合溶液，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，150 ℃反应48 h，得到棕褐色产物，超纯水和乙醇分别洗涤两次，50 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O；
（2）自发光纳米多孔材料Au@Eu-MOFs的制备
将35 mg六水合氯化铕和10 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的混合溶液中，磁力搅拌2 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，150 ℃反应12 h，乙醇和超纯水分别洗涤两次，50 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Eu-MOFs；
将40 mg纳米多孔Eu-MOFs分散在50 mL超纯水中，加入2 mL、2%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入5 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入80 mg还原剂柠檬酸三钠，0.75 mg硼氢化钠，室温下搅拌10 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Eu-MOFs；
（3）Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原孵化物溶液的制备
将8 mg的Au@Eu-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入5 μL、6 mg/mL的DON-BSA偶联抗原，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化18 h，4 ℃离心分离洗去未结合的DON-BSA偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化3 h封闭DON-BSA偶联抗原表面的非特异性活性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH 7.5的PBS缓冲溶液中，制得2.5 mg/mL的Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原溶液，储存于4 ℃中备用。
实施例3
纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O、自发光纳米多孔材料Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原孵化物溶液的制备
（1）纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O的制备
将170 mg六水合硝酸镍、170 mg九水合硝酸铁、30 mg尿素和80 mg柠檬酸三钠加入30mL超纯水中，磁力搅拌5 min，得到Ni和Fe比率为1:1的混合溶液，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，160 ℃反应72 h，得到棕褐色产物，超纯水和乙醇分别洗涤两次，60 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O；
（2）自发光纳米多孔材料Au@Eu-MOFs的制备
将40 mg六水合氯化铕和15 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的混合溶液中，磁力搅拌3 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，160 ℃反应18 h，乙醇和超纯水分别洗涤两次，60 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Eu-MOFs；
将50 mg纳米多孔Eu-MOFs分散在50 mL超纯水中，加入3 mL、3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入90 mg还原剂柠檬酸三钠，1 mg硼氢化钠，室温下搅拌12 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Eu-MOFs；
（3）Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原孵化物溶液的制备
将10 mg的Au@Eu-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入6 μL、6 mg/mL的DON-BSA偶联抗原，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化24 h，4 ℃离心分离洗去未结合的DON-BSA偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化4 h封闭DON-BSA偶联抗原表面的非特异性活性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH 7.5的PBS缓冲溶液中，制得5 mg/mL的Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原溶液，储存于4 ℃中备用。
实施例4
一种基于镧系金属自发光Au@Eu-MOFs的竞争型免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将6 µL、0.5 mg/mL Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O纳米花水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；
（3）将2 μL、10 mg NHS和20 mg EDC的混合溶液滴于电极表面用来活化Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O表面的羧基基团，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，晾干；
（4）将6 μL、8 μg/mL的DON抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过酰胺反应和基底材料连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
（5）将2 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
（6）将6 μL、一定浓度的DON标准溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4℃晾干；
（7）将6 μL、0.5 mg/mL的Au@Eu-MOFs标记DON-BSA孵化抗原溶液滴加到电极表面，4 ℃晾干，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Eu-MOFs的竞争型电致化学发光免疫传感器。
实施例5
一种基于镧系金属自发光Au@Eu-MOFs的竞争型免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将6 µL、2.5 mg/mL Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O纳米花水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；
（3）将3 μL、10 mg NHS和20 mg EDC的混合溶液滴于电极表面用来活化Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O表面的羧基基团，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，晾干；
（4）将6 μL、10 μg/mL的DON抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过酰胺反应和基底材料连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
（5）将3 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
（6）将6 μL、一定浓度的DON标准溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4℃晾干；
（7）将6 μL、2.5 mg/mL的Au@Eu-MOFs标记DON-BSA孵化抗原溶液滴加到电极表面，4 ℃晾干，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Eu-MOFs的竞争型电致化学发光免疫传感器。
实施例6
一种基于镧系金属自发光Au@Eu-MOFs的竞争型免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将6 µL、5 mg/mL Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O纳米花水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；
（3）将4 μL、10 mg NHS和20 mg EDC的混合溶液滴于电极表面用来活化Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O表面的羧基基团，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，晾干；
（4）将6 μL、12 μg/mL的DON抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过酰胺反应和基底材料连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
（5）将4 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
（6）将6 μL、一定浓度的DON标准溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4℃晾干；
（7）将6 μL、5 mg/mL的Au@Eu-MOFs标记DON-BSA孵化抗原溶液滴加到电极表面，4 ℃晾干，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Eu-MOFs的竞争型电致化学发光免疫传感器。
实施例7
电致化学发光传感器用于DON的电化学发光检测：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光传感器修饰的玻碳电极为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 V，循环伏安扫描电位范围为0~ 1.4 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的含浓度为10 mmol/L三丙胺的PBS缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的DON标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替标准溶液进行测定。
实施例8
大麦提取液样品中DON的检测
大麦提取液样品1 mL，向其中加入不同浓度的DON溶液，采用标准加入法测定样品中DON的平均回收率，结果见表1.
表1 样品中DON的检测结果
Figure 91649DEST_PATH_IMAGE001
表1检测结果可以看出，大麦提取液样品中DON检测结果的回收率在95.0 ~ 105%范围内，表明本发明可以用于谷物样品的检测，方法的精密度高，结果准确可靠。

Claims (2)

1.一种基于镧系金属自发光Eu-MOFs的竞争型免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：
（1）纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O的制备
将130 mg ~ 170 mg六水合硝酸镍、130 mg ~ 170 mg九水合硝酸铁、20 mg ~ 30 mg尿素和60 mg ~ 80 mg柠檬酸三钠加入10 mL ~ 30 mL超纯水中，磁力搅拌5 min，得到Ni和Fe比率为1:1的混合溶液，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，140 ℃ ~ 160 ℃反应24 h ~ 72 h，得到棕褐色产物，超纯水和乙醇分别洗涤两次，40 ℃ ~ 60 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到纳米花状Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O；
（2）自发光纳米多孔材料Au@Eu-MOFs的制备
将30 mg ~ 40 mg六水合氯化铕和5 mmoL ~ 15 mmoL硼酸加入N, N-二甲基甲酰胺（DMF）:超纯水为7:3的混合溶液中，磁力搅拌1 h ~ 3 h，转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，140 ℃ ~ 160 ℃反应6 h ~ 18 h，乙醇和超纯水分别洗涤两次，40 ℃ ~ 60 ℃真空干燥箱干燥12 h，即得到白色产物Eu-MOFs，将30 mg ~ 50 mg纳米多孔Eu-MOFs分散在50 mL超纯水中，加入1 mL ~ 3 mL、1% ~ 3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入4 mg ~6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70 mg ~ 90 mg还原剂柠檬酸三钠，0.5 mg ~ 1 mg硼氢化钠，室温下搅拌8 h ~ 12 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@Eu-MOFs；
（3）Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原孵化物溶液的制备
将6 mg ~ 10 mg的Au@Eu-MOFs分散于1 mL pH 7.5的PBS中，加入4 μL ~ 6 μL、6 mg/mL的DON-BSA偶联抗原，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h ~ 24 h，4 ℃离心分离洗去未结合的DON-BSA偶联抗原，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2 h ~ 4 h封闭DON-BSA偶联抗原表面的非特异性活性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH 7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL的Au@Eu-MOFs标记DON-BSA偶联抗原溶液，储存于4 ℃中备用；
（4）分别用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（5）将6 µL、0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O纳米花水溶液滴涂至电极表面，室温下晾干；
（6）将2 μL ~ 4 μL、10 mg NHS和20 mg EDC的混合溶液滴于电极表面用来活化Ni x Fe (1-x) (CO) y (OH) z • w H2O表面的羧基基团，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，晾干；
（7）将6 μL、8 μg/mL ~ 12 μg/mL的DON抗体溶液孵化滴涂到电极表面通过酰胺反应和基底材料连接，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
（8）将2 μL ~ 4 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液滴涂到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；（9）将6 μL、一定浓度的DON标准溶液滴加到电极表面，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；
（10）将6 μL、0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL的Au@Eu-MOFs标记DON-BSA孵化抗原溶液滴加到电极表面，4 ℃晾干，用pH 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于自发光Au@Eu-MOFs的竞争型电致化学发光免疫传感器。
2.如权利要求1所述制备方法制得的一种基于镧系金属自发光Eu-MOFs的竞争型免疫传感器对谷物中DON的检测，其特征在于，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器修饰的玻碳电极为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.4 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的含浓度为1 mmol/L ~ 12 mmol/L三丙胺的PBS缓冲溶液中，通过电化学发光方法，检测对不同浓度的PCT溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替PCT溶液进行测定。
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