CN115112734A - 一种用于vWF检测的电化学免疫传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于vWF检测的电化学免疫传感器及其制备方法和应用。所述用于vWF检测的电化学免疫传感器,包括反应装置和检测电极;所述反应装置用于检测细胞释放的vWF;所述检测电极用于检测vWF抗原。利用TCNQ(四氰基醌二甲烷)与Ni‑MOF结合的复合材料作为vWF捕获剂,提高电化学免疫传感器对vWF的响应灵敏度,并配合电化学装置,可用于帮助疾病的诊断。本发明所述的免疫传感器测定灵敏度高、准确度高,检测限低,低至0.972ng/mL,应用前景广阔。

Description

一种用于vWF检测的电化学免疫传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于电化学传感器技术领域,具体涉及一种用于vWF检测的电化学免疫传感器及其制备方法和应用。
背景技术
vWF是由巨核细胞和内皮细胞合成,并以多聚体的形式大量存储在内皮特异性细胞器WPB内。vWF主要的生物学功能是作为凝血因子VIII(FVIII)参与止血过程,当vWF缺乏或异常会导致血管性血友病,vWF可以介导血管损伤部位血小板的粘附和聚集,当血管内皮细胞(VECs)损伤时,vWF的释放量增加。由于vWF灵敏度和特异性高且分析稳定,被认为是VECs活化与损伤的标志物,它的准确测定对内皮功能障碍的治疗有重要意义。近年来vWF检测方法快速发展,常用的有凝胶电泳法、免疫放射计量试验和荧光共振能量转移法等,但以上所需设备昂贵,操作复杂且耗时长。
电化学免疫传感器具有操作简单、成本低、灵敏度高,选择性好等优点,在食品安全、境监测,临床诊断等多个领域都得到了广泛的应用,但生物分子缺少电化学活性,所以绝大多数的免疫传感器利用电子媒介体和酶标记的抗原或抗体来修饰电极,而酶分子在电极表面很容易变性,会影响检测导致测量结果不准确。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供一种用于vWF检测的电化学免疫传感器及其制备方法和应用。该传感器能够提高电化学免疫传感器对vWF的响应灵敏度,并配合电化学装置,测定细胞释放的vWF。
本发明采用Ni-MOF与TCNQ结合,将抗体固定在电极表面,基于抗体和抗原之间的特异性结合对修饰电极电化学响应的负面影响实现对vWF的定量检测。
本发明提供的技术方法如下:
第一方面,本发明提供一种用于vWF检测的电化学免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备Ni-MOF:将1,3,5-苯三甲酸(H3BTC)的DMF溶液加入到镍盐溶液中,混匀后,加热反应至完全,经离心、洗涤、除杂和干燥即得;
(2)制备Ni-MOF/TCNQ/SPE:将Ni-MOF分散于RO水中制成分散液;然后将分散液覆盖于洁净SPE电极工作电极表面,采用CV法电沉积Ni-MOF;再将TCNQ溶液滴涂到Ni-MOF/SPE工作电极,自然风干得到Ni-MOF/TCNQ/SPE;
(3)制备Ni-MOF/TCNQ/Ab/SPE:将vWF抗体(Ab)溶液滴加到Ni-MOF/TCNQ/SPE表面,在室温下孵育后,用牛血清白蛋白溶液在常温下封闭多余的Ni-MOFs/TCNQ上的活性位点,再使用缓冲溶液冲洗电极表面,自然晾干后得Ni-MOF/TCNQ/Ab/SPE。
进一步,所述步骤(1)中,镍盐、1,3,5-苯三甲酸的用量比为0.45-0.9mmol:2.25-9mmol。
进一步,所述步骤(1)中,镍盐为硫酸镍或硝酸镍。
进一步,所述步骤(1)中,加热温度为100-140℃,反应时间为18-24h。
进一步,所述步骤(2)中,分散液的浓度为1-7mg/mL;TCNQ溶液浓度为1-5mg/mL,滴涂量为1-3μL。
进一步,所述步骤(2)中,SPE电极包括反应池和丝网印刷电极;
所述反应池由PDMS构成;
所述反应池固定于丝网印刷电极上;
所述检测电极包括基片;
所述基片上印制有导轨、工作电极、参比电极和辅助电极,无电极部分覆盖有绝缘层;
所述导轨电极由导电银油墨或导电碳油墨印制于基片上形成的三个并列导轨,由宽度不同的两矩形块组成,其中端部较宽用于连接电化学工作站,中间部分较窄用于连接各电极。
更进一步,所述步骤(2)中,所述工作电极为碳电极;参比电极为Ag/AgCl电极;辅助电极为碳电极;
其中,
工作电极主体为圆形块扩展连接至中间导轨电极较窄部分的末端;
参比电极为银/氯化银油墨印制在左侧导轨电极较窄部分的末端向中间电极延展形成的小段弧形环;
辅助电极主体为由左侧导轨极较窄部分的末端下部起始,环绕工作电极,至右侧导轨电极较窄部分末端形成的大段弧形环,靠近右侧电极的部分扩展至导轨电极上。
进一步,所述步骤(3)中,vWF抗体溶液的浓度为20-50μg/mL;牛血清白蛋白溶液的质量分数为1-3%。
金属有机骨架(MOFs)是由含金属节点和有机基团组成的一类新兴多孔材料,兼无机材料刚性特点与有机材料柔性特性相结合而具有超高比表面积、高孔隙率、优良的吸附性能与生物相容性,被认为是理想的生物传感材料之一。Cu、Ni等过渡金属离子由于其具有半满、全空、以及不完全充满的自旋轨道,使其在得失电子变化中表现突出,促使多变价态的过渡金属可与多样配体形成千变万化的材料。而对于客体来说相对合适的MOF孔道非常重要。其中Ni-MOF与vWF Ab孔径匹配良好,且生物相容性高。另一方面,大多数MOFs的导电性能较差,在MOFs中引入具有氧化还原活性掺杂剂是促进电荷转移的一种方法。TCNQ是π电子受体,TCNQ的渗透作用可被限制在Ni-MOF的多孔结构中,使Ni金属离子与TCNQ之间形成电荷转移复合物,作为多功能桥接配体,可以显著提高Ni-MOF的电导率和氧化还原活性。Ni-MOF材料具有高孔隙率和均匀立体结构,能提高选择性暴露更多Ni活性位点,提高复合材料修饰电极的电活性信号。相较于Cu-MOF,Ni-MOF与TCNQ结合能更明显地增加复合材料的电化学特性。
第二方面,本发明提供利用第一方面方法制备的电化学免疫传感器。
第三方面,本发明提供利用第二方面所述的电化学免疫传感器用于vWF检测的方法,包括以下步骤:
(1)以PBS为底液,将SPE电极连接到电化学工作站;
(2)用方波伏安法对一系列不同浓度vWF标准溶液特异性结合vWF的电极进行检测,记录SWV曲线图;
(3)绘制峰电流差值随vWF浓度的对数变化的曲线,拟合出线性表达式;
(4)将待测样品溶液代替vWF标准溶液进行检测,根据拟合线性表达式计算出溶液浓度。
进一步,所述步骤(2)中,扫描电位区间为-1~1V,扫描速度为50mV/s。
本发明的有益效果:
1)Ni-MOF/TCNQ/Ab(BSA)作为电化学免疫传感器的基底材料,提高了vWF在电化学传感器上的选择性和灵敏度,可检测细胞释放的vWF;
2)测定灵敏度高、准确度高,检测限低,低至0.972ng/mL;
3)易操作,简化测试;
4)所提用的电化学传感器可工业化生产,价格低廉,易于推广。
附图说明
图1为本发明电化学免疫传感器的结构示意图;其中:11-基片,12-导轨,13-参比电极,14-工作电极,15-辅助电极,16-绝缘层;21-反应池;
图2电化学免疫传感器配合使用的反应装置的示意图;
图3为Ni-MOF的XRD表征图;
图4为Ni-MOF、TCNQ、Ni-MOF/TCNQ复合材料的扫描电镜图;其中,A为TCNQ,B为Ni-MOF,C为Ni-MOF/TCNQ;
图5为血管内皮细胞(HUVECs)分别在Ni-MOF(A)、Cu-MOF(B)修饰的传感器上培养并用Calcein-AM标记的显微镜下照片;
图6分别为Ni-MOF、Cu-MOF、Ni-MOF/TCNQ、Cu-MOF/TCNQ修饰传感器的循环伏安曲线图;
图7为Ni-MOF/TCNQ复合材料修饰传感器在PBS缓冲液中比较抗原抗体特异性反应的方波伏安测试结果图;
图8为本发明方波伏安峰电流差值与lgc线性关系图;
图9为H2O2损伤的HUVECs细胞释放的vWF在传感器的电流差值,内插图:HUVECs在培养基中加入1mM H2O2后5h(A),10h(B),24h(C),36h(D)的显微镜图像。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明,本发明的内容完全不限于此。
本发明的使用的SPE电极结构如图1所示,包括印制电极的基片11,基片上印制三条导轨12、参比电极13、工作电极14、辅助电极15和绝缘层16。
其中:
导轨电极由导电银油墨或导电碳油墨印制于基片上形成的三个并列导轨,由宽度不同的两矩形块组成,其中端部较宽用于连接电化学工作站,中间部分较窄用于连接各电极;优选的,较宽部分2mm×5mm,较窄部分1mm×17mm。
工作电极主体为圆形块扩展连接至中间导轨电极较窄部分的末端;优选的,圆形块直径为2mm;扩展部分1mm×2mm。
参比电极为银/氯化银油墨印制在左侧导轨电极较窄部分的末端向中间电极延展形成的小段弧形环;优选的,参比电极为1/6圆弧,内径为4mm,外径为7mm。
辅助电极主体为由左侧导轨极较窄部分的末端下部起始,环绕工作电极,至右侧导轨电极较窄部分末端形成的大段弧形环,靠近右侧电极的部分扩展至导轨电极上;优选的,主体部分为2/3圆弧,内径4mm,外径为7mm,扩展部分1mm×5mm。
图2示出了使用状态示意图,使用方法如下:
1)将基底材料加入到丝网印刷电极上,将反应池21移至丝网印刷电化学传感器1表面的反应区域(包含工作电极、辅助电极及参比电极)正上方放置,反应池21的底部可将丝网印刷电化学传感器1的反应区域包含在内;
2)将培养液加在小池子里,然后电极测定细胞释放的vWF;
将丝网印刷电化学传感器1与电化学工作站相连接,通过电化学方法测定细胞释放vWF的含量。
实施例
制备vWF电化学免疫传感器,方法如下:
1)电极预处理
将SPE电极放置在装有1mM NaOH溶液的烧杯中超声相对清洗5分钟,超纯水直接清洗后用氮气吹干,接着将SPE电极放入装有1mM HCl溶液的烧杯中继续超声清洗5分钟,超纯水清洗后直接氮气吹干。取适量0.1M,PH=7.0的磷酸缓冲溶液覆盖于电极工作区域,采用循环伏安方法测试,测试完待基线稳定后用双蒸水冲洗干净后氮气吹干。
2)制备Ni-MOF纳米复合材料
称取0.45-0.9mmol NiSO4·6(H2O)加入5-10ml去离子水中搅拌使其溶解;再称取2.25-9mmol的1,3,5-苯三甲酸(H3BTC)加入5-10ml DMF溶液中,搅拌溶解后加入上述溶液中,继续搅拌15-20min使两溶液均匀混合,然后将混合溶液转移到对位聚苯(PPL)内胆中,将水热釜放入100-140℃的烘箱中反应18-24h。接着自然冷却后将液体离心,再用DMF和乙醇分别洗涤,除去未反应的试剂,之后在45-65℃下真空干燥,研磨、收集所得产物即为Ni-MOF。
3)制备表面涂覆有Ni-MOF/TCNQ复合材料的工作电极
将Ni-MOF超声分散于RO水中制成1-7mg/mL的分散液,分别将分散液覆盖于裸电极表面,采用CV法扫描1-10圈在工作电极表面电沉积Ni-MOF。将1-5wt%TCNQ超声分散于超纯水中制成1-5mg/mL的分散液,取2μL滴涂到Ni-MOF/SPE工作电极,自然风干得Ni-MOF/TCNQ/SPE。
4)制备表面涂覆有Ni-MOF/TCNQ/Ab(BSA)复合材料的工作电极。
取2μL 20-50μg/mL Ab溶液滴加至修饰电极表面,在室温下孵育1-6h后,用质量分数为1-3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液在常温下封闭多余的Ni-MOFs/TCNQ上的活性位点,以减少分析物或杂质的非特异性结合,30min后用PBS(PH 7.0)缓冲溶液冲洗电极表面,自然晾干后得Ni-MOF/TCNQ/Ab(BSA)/SPE。
5)组装vWF电化学免疫传感器
PDMS池子固定在步骤(4)中制得的表面涂覆有Ni-MOF/TCNQ/Ab(BSA)的工作电极上,与电化学工作站一起组装成vWF电化学免疫传感器。
图3为Ni-MOF的XRD表征图,从图中可以看出Ni-MOF在2θ=10.777°、17.779°、20.142°、26.706°、31.345°、35.283°、37.384°、42.373°、44.824°、56.377°、59.090处出现了较强的材料特征衍射峰,说明Ni-MOFs晶体被成功合成。
图4为实施例2中制备的Ni-MOF、Ni-MOF/TCNQ复合材料及TCNQ的扫描电镜图,从图4A中可见矩形的TCNQ晶体;图4B中可见Ni-MOFs晶体呈光滑规则的棒状结构;图4C中可见TCNQ嵌入Ni-MOF中。
图5为血管内皮细胞(HUVECs)分别在Ni-MOF(A)、Cu-MOF(B)修饰的传感器上培养并用Calcein-AM标记的显微镜下照片。从图中可见,相较于Cu-MOF(图5B),Ni-MOF的细胞呈现有伪足的拉伸的多边形状态,形态较好(5A)。
图6分别为Ni-MOF、Cu-MOF、Ni-MOF/TCNQ、Cu-MOF/TCNQ修饰传感器的循环伏安曲线图。
图7为Ni-MOF/TCNQ复合材料修饰传感器在PBS缓冲液中比较抗原抗体特异性反应的方波伏安测试结果图,从图中可以看出Ni-MOFs/TCNQ在-1~1V扫描范围有明显还原峰,具有良好还原电活性信号。由于抗体与电极表面相结合,蛋白质不导电形成绝缘层,阻碍电子传递速度,因此Ni-MOFs/TCNQ/Ab的还原峰电流降低。在Ni-MOFs/TCNQ/Ab的表面孵育Ag后,由于Ag与Ab特异性结合形成免疫复合物绝缘层产生空间位阻效应阻挡了电子向电极传递速度,使Ni-MOFs/TCNQ/Ab/Ag的峰电流进一步下降。
图9为H2O2损伤细胞释放的vWF在传感器的电流差值,内插图:HUVECs在培养基中加入1mM H2O2后5h,10h,24h,36h的显微镜图像。
应用实施例1
利用实施例中的电化学免疫传感器及配合使用的反应装置观察电化学免疫传感器对vWF的电化学响应。
测定条件:测定介质为0.1M PBS缓冲液。
测定方法:方波伏安法,电位扫描范围-1~1V。响应测定结果如图8所示,电化学免疫传感器对vWF浓度在1-200ng范围内的浓度范围内呈良好的线性拟合关系(R=0.9883),检测限为0.972ng/mL(S/N=3)。
图8为本发明方波伏安峰电流差值与lgc线性关系图。
结果表明:采用本发明的装置用于检测vWF浓度线性关系良好,检测限低,准确度高,可用于快速检测。
应用实施例2
电化学免疫传感器检测H2O2损伤血管内皮细胞中释放的vWF。24孔板于每个孔加入20×104数量吹打均匀的HUVECs悬液,培养24h后弃掉培养基,加入含H2O2的高糖培养基使其终浓度为1mM。
图9为H2O2损伤细胞释放的vWF在传感器的电流差值,内插图:HUVECs在培养基中加入1mM H2O2后5h,10h,24h,36h的显微镜图像。正常培养HUVECs 24h时,细胞状态正常;细胞受H2O2氧化损伤5h后,细胞处于分离状态,形态由梭形变为球形,当细胞受H2O2刺激时间增加,10h后细胞间呈彼此分离状态,球形细胞数量增加。24h后,细胞几乎呈现出囊泡状,36h后,细胞死亡,出现大量细胞碎片。
分别取加入H2O2后不同时间段的细胞培养液滴加至Ni-MOFs/TCNQ/Ab传感器的工作电极上,使用SWV测量峰电流差值△I。图中发现△I在5-24h范围内随着损伤时间增加,vWF含量增加,说明细胞损伤程度越大,释放的vWF量越多,当损伤增加至36h时,vWF含量减少。
结果表明:采用本发明的装置用于检测细胞释放的vWF。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明保护的范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改,等同替换和改进等,均应包含在发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于vWF检测的电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备Ni-MOF:将1,3,5-苯三甲酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液加入到镍盐溶液中,混匀后,加热反应至完全,经离心、洗涤、除杂和干燥即得;
(2)制备Ni-MOF/TCNQ/SPE:将Ni-MOF分散于RO水中制成分散液;然后将分散液覆盖于洁净SPE电极工作电极表面,采用CV法电沉积Ni-MOF;再将四氰基醌二甲烷溶液滴涂到Ni-MOF/SPE工作电极,自然风干得到Ni-MOF/TCNQ/SPE;
(3)制备Ni-MOF/TCNQ/Ab/SPE:将vWF抗体溶液滴加到Ni-MOF/TCNQ/SPE表面,在室温下孵育后,用牛血清白蛋白溶液在常温下封闭多余的Ni-MOFs/TCNQ上的活性位点,再使用缓冲溶液冲洗电极表面,自然晾干后得Ni-MOF/TCNQ/Ab/SPE。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中,镍盐、1,3,5-苯三甲酸的用量比为0.45-0.9mmol:2.25-9mmol。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中,加热温度为100-140℃,反应时间为18-24h。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中,分散液的浓度为1-7mg/mL;TCNQ溶液浓度为1-5mg/mL,滴涂量为1-3μL。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中,SPE电极包括反应池和丝网印刷电极;
所述反应池由PDMS构成;
所述反应池固定于丝网印刷电极上;
所述检测电极包括基片;
所述基片上印制有导轨、工作电极、参比电极和辅助电极,无电极部分覆盖有绝缘层;
所述导轨电极由导电银油墨或导电碳油墨印制于基片上形成的三个并列导轨,由宽度不同的两矩形块组成,其中端部较宽用于连接电化学工作站,中间部分较窄用于连接各电极。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中,所述工作电极为碳电极;参比电极为Ag/AgCl电极;辅助电极为碳电极;
其中,
工作电极主体为圆形块扩展连接至中间导轨电极较窄部分的末端;
参比电极为银/氯化银油墨印制在左侧导轨电极较窄部分的末端向中间电极延展形成的小段弧形环;
辅助电极主体为由左侧导轨极较窄部分的末端下部起始,环绕工作电极,至右侧导轨电极较窄部分末端形成的大段弧形环,靠近右侧电极的部分扩展至导轨电极上。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中,vWF抗体溶液的浓度为20-50μg/mL;牛血清白蛋白溶液的质量分数为1-3%。
8.一种用于vWF检测的电化学免疫传感器,其特征在于:采用权利要求1-7任一项所述的方法制备。
9.权利要求8所述的电化学免疫传感器用于vWF检测的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)以PBS为底液,将SPE电极连接到电化学工作站;
(2)用方波伏安法对一系列不同浓度vWF标准溶液特异性结合vWF的电极进行检测,记录SWV曲线图;
(3)绘制峰电流差值随vWF浓度的对数变化的曲线,拟合出线性表达式;
(4)将待测样品溶液代替vWF标准溶液进行检测,根据拟合线性表达式计算出溶液浓度。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)中,扫描电位区间为-1~1V,扫描速度为50mV/s。
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