CN112147192B - 一种金石墨烯和钯氧硫铟化铜检测胰岛素的电化学传感器的制备方法 - Google Patents

一种金石墨烯和钯氧硫铟化铜检测胰岛素的电化学传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种金石墨烯和钯氧硫铟化铜检测胰岛素的电化学传感器的制备方法，属于电化学传感器领域。本发明以金杂化石墨烯作为基底，以具有较大比表面积和导电性作为载体，以钯杂化的氧硫化铜作为二抗标记物，构建了信号增强型电化学传感器，实现了对胰岛素抗原的检测，测得传感器的线性检测范围为1.0 fg/mL～100 ng/mL，检测限为0.33 fg/mL。

Description

一种金石墨烯和钯氧硫铟化铜检测胰岛素的电化学传感器的 制备方法
技术领域
本发明涉及一种钯纳米粒子功能化氧硫铟化铜检测胰岛素的电化学免疫传感器的制备方法。具体是采用金杂化的石墨烯作为基底，钯纳米粒子功能化氧硫铟化铜作为传感平台，制备了一种检测胰岛素的信号增强型电化学免疫传感器，属于电化学免疫传感领域。
背景技术
胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。胰岛素是一种蛋白质类激素。体内胰岛素是由胰岛β细胞分泌的。在人体十二指肠旁边，有一条长形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布着许许多多的细胞群，叫做胰岛。胰腺中胰岛总数约有100～200万个。糖尿病患者，由于病毒感染、遗传基因、自身免疫等各种发病因素，其病理生理主要是由于胰岛素活性相对或绝对不足以及胰升糖素活性相对或绝对过多所致，也即B和A细胞双边激素功能障碍所致。胰岛素依赖型糖尿病胰岛素分泌细胞严重损害或完全缺如，内源性胰岛素分泌极低，需用外源性胰岛素治疗。非胰岛素依赖型糖尿病，胰岛素分泌障碍较轻，基础胰岛素浓度正常或增高，而糖刺激后胰岛素分泌则一般均较相应体重为低，即胰岛素相对不足。因此，对胰岛素的早期检测是非常重要的。
电化学免疫传感器是将免疫技术和电化学分析技术结合起来的，能够很好地应用到检测肿瘤标记物，同时利用抗原抗体的特异性结合制备的电化学免疫传感器能够很将理论与应用结合起来。电化学免疫分析技术通常是用来解决超痕量标记物等一系列难以解决的问题。因此，在电化学免疫传感器的构建过程中材料的选择对检测的灵敏度非常重要。近年来，随着纳米技术的发展越来越多的纳米技术走进人们的生活。纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺寸范围内（1-100 nm）或由它们作为基本单元构成的材料。它的纳米尺寸使其具有一系列的优点，如宏观量子隧道效应，量子尺寸效应，表面效应和小尺寸效应等。因此将纳米材料组合在一起提高其性能获得了越来越多的科学家的青睐。
发明内容
本发明的目的之一是合成金杂化的石墨烯和钯修饰的氧硫铟化铜纳米材料，在合成的过程中通过调节氨基化石墨烯和金纳米粒子的量，四氯钯酸钾以及钯纳米粒子和氧硫铟化铜的混合量合成不同形的纳米材料。
本发明的目的之二是合成金杂化石墨烯作为基底材料，钯修饰的氧硫铟化铜作为二抗标记物材料。其中，金杂化石墨烯具有好的大比表面积和优异导电性。钯修饰的氧硫铟化铜具有好的催化性能，从而增大催化信号。
本发明的目的之三是合成金杂化石墨烯和钯修饰的氧硫铟化铜纳米材料，其中在合成过程中通过调节金纳米粒子量以及，四氯钯酸钾以及钯纳米粒子和氧硫铟化铜的混合量合成不同的纳米材料并且比较其性能。
本发明的目的之四是以金杂化石墨烯作为基底材料可以负载大量抗体，钯修饰的氧硫铟化铜作为二抗标记物，以胰岛素抗原作为目标分析物，利用抗原和抗体之间的免疫反应，构建信号增强型电化学免疫传感器。根据二抗标记物负载抗原量以及修饰在电极表面前后电化学信号的变化，实现对胰岛素的定量检测。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1. 本发明所述的金杂化石墨烯和钯修饰的硫氧铟化铜用于检测胰岛素的电化学传感器的制备方法，所述电化学免疫传感器。制备步骤如下：
(1) 将直径为4 mm的玻碳电极分别用0.05、0.3和1.0 mm氧化铝粉打磨抛光至镜面，再超纯水洗涤干净；
（2）将3 µL、浓度为1.0 ~ 2.0 mg/mL的金杂化石墨烯溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
（3）继续滴涂3 µL、浓度为10 μg/mL的胰岛素抗体标准溶液于玻碳电极表面，4 ºC冰箱中孵育12 h，超纯水清洗；
（4）继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）继续将6 μL、浓度为1 fg/mL～100.0 ng/mL的一系列不同浓度的胰岛素抗原标准溶液滴涂在电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（6）继续滴加2.0 mg/mL~3.0 mg/mL的钯修饰的硫氧铟化铜二抗标记物，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗。
2.本发明所述的一种金杂化石墨烯和钯修饰硫氧铟化铜用于检测胰岛素的电化学传感器的制备方法，所述金杂化石墨烯和钯修饰的氧硫铟化铜纳米材料的制备方法，步骤如下
（1）金杂化石墨烯的合成
1）金纳米粒子的合成
将100 mL的氯金酸（质量分数0.02 %）加热至沸腾，然后加入1.5 mL柠檬酸三钠（质量分数1%）沸腾的溶液后15 min左右变成明亮的红宝石色表明反应生成金纳米粒子，将上述溶液然冷却至室温。
2) 氨基化石墨烯的合成
氧化石墨烯的合成
0.6 g石墨粉和3.6 g高锰酸钾加入到含有硫酸和磷酸的三口烧瓶中（硫酸：磷酸=72:8 mL）,将上述反应在50℃的条件下反应12 h。将上述反应冷却至室温并加入到80 mL的冰水溶液中。将30%的双氧水逐滴加入上述冰溶液中并且搅拌30 min后反应得到的褐色分散液用8000 rpm离心30 min。用0.2 mol/L HCl溶液洗涤3次和乙醚洗涤一次，并且离心处理后真空干燥12 h 制得氧化石墨烯。
氨基化石墨烯的合成
将100 mg的氧化石墨烯加入到75 mL的超纯水中超声处理2h，向上述溶液中加入氨丙基三乙氧基硅烷，加热到70℃并且搅拌1.5 h，向上述溶液中加入100 μL 水合肼并在100℃条件下搅拌1 h,离心干燥制得氨基化石墨烯。
3) 氨基化石墨烯-金纳米粒子的合成
将1 mL的10 mg/mL的氨基化石墨烯与60 mL的金纳米粒子溶液混合振荡12 h，利用氨基化石墨烯表面基团和金纳米粒子特异性结合制得负载金纳米粒子的氨基化石墨烯
（2）钯修饰硫氧铟化铜的制备
1）花状氧硫化铜的制备
在磁力搅拌的条件下，将4.5 g 三水合硝酸铜和4.5 g氯化铟加入到500 mL水溶液中。再将1.5 g硫代乙酰胺加入到上述的500 mL溶液中。30 min后，将该溶液加热到90 ºC。接下来再加入0.12 mL肼搅拌2 h后得到沉淀固体，用去离子水洗涤直至洗涤液的pH为7后再用乙醇清洗数次去除有机物。将所得固体样品放在真空干燥箱中50 ºC下干燥24 h，研磨后得到花状氧硫铟化铜纳米材料
（2）钯纳米粒子的制备
钯纳米粒子是通过将四氯钯酸钾溶液加入到抗坏血酸和溴化钾的溶液中还原制备的。将105 mg的聚乙烯吡咯烷酮，80 mg～100 mg的抗坏血酸和600 mg～800 mg的溴化钾溶解在去离子水中, 将该溶液用油浴加热到90 ºC，并且保持10 min。然后用滴管逐滴加入含四氯钯酸钾（60 mg～80 mg）的3.0 mL水溶液，并且将这一反应在80 ºC保持3 h，洗涤离心后将其溶解在10 mL的去离子水中；
(3) 钯纳米粒子功能化氧硫铟化铜纳米材料的制备
将600 μL～800 μL的钯纳米粒子溶液加入到 2 mL的2.0 ~ 4.0 mg/mL的氧硫化铟化铜溶液中，在室温下振荡24 h, 离心分离后的产物经多次水洗去除多余的钯纳米粒子，再分散于去离子水中（2 mL）得到钯纳米粒子功能化花状氧硫铟化铜溶液。
3. 如权利要求1所述的1 fg/mL～100.0 ng/mL的一系列不同浓度的胰岛素标准溶液为从南京金斯瑞生物科技有限公司购得的1 mg/mL的胰岛素溶液用磷酸盐缓冲溶液稀释得到。
4. 如权利要求1所述的胰岛素的检测，其特征在于，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的一种基于金杂化石墨烯作为基底，钯纳米粒子功能化花状氧硫铟化铜电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL的pH 为4.0～9.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
（2）电化学工作站参数设置为，扫描电位为-0.2~-0.6 V，扫描速率设置为0.1 ~0.3 V/s
（3）使用10 mL的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液作为底液，通过差分脉冲伏安法检测不同浓度的胰岛素产生的电化学电流信号强度；所述磷酸盐缓冲溶液，其pH为7.4，用0.1mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L磷酸二氢钾配制；
（4）根据所得电流值与胰岛素浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（5）依据工作曲线的绘制方法进行样品中胰岛素的检测，检测结果从工作曲线中查得。
本发明的有益成果
（1）金杂化石墨烯可以通过控制氨基化石墨烯和金纳米粒子的量合成不同金负载量的金杂化石墨烯。
（2）氧硫铟化铜具有大的比表面积和催化活性位点，其作为二抗标记物材料能够催化过氧化氢的分解产生更多的活性中间体，从而实现信号的放大。
（3）氧硫铟化铜可作为钯纳米粒子的载体，其中钯纳米粒子可以通过化学键均匀的分散在氧硫铟化铜的表面，能够固载更多的抗体而催化双氧水产生强的信号。
（4）将钯纳米粒子修饰的氧硫铟化铜与胰岛素标记物检测抗体孵化作为二抗标记物，利用贵金属的生物相容性和较高的催化性能，实现了对胰岛素的高灵敏度检测，避免了因酶的失活所带来的影响，提高了免疫传感器的重现性和稳定性。
（5）本发明制备的电化学免疫传感器用于胰岛素标志物的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。在1.0 fg/mL～100.0 ng/mL浓度范围内实现了对胰岛素的高选择性和高灵敏检测，检测限低至0.33 fg/mL。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1一种金杂化石墨烯和钯修饰的硫氧铟化铜用于检测胰岛素的电化学传感器的制备方法
(1) 将直径为4 mm的玻碳电极分别用0.05、0.3和1.0 mm氧化铝粉打磨抛光至镜面，再超纯水洗涤干净；
（2）将3 µL、浓度为1.0 mg/mL的金杂化石墨烯溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
（3）继续滴涂3 µL、浓度为10 μg/mL的胰岛素抗体标准溶液于玻碳电极表面，4 ºC冰箱中孵育12 h，超纯水清洗；
（4）继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）继续将6 μL、浓度为1 fg/mL～100.0 ng/mL的一系列不同浓度的胰岛素抗原标准溶液滴涂在电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（6）继续滴加2.0 mg/mL的钯修饰的硫氧铟化铜二抗标记物，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗。
实施例2一种金杂化石墨烯和钯修饰的硫氧铟化铜用于检测胰岛素的电化学传感器的制备方法
(1) 将直径为4 mm的玻碳电极分别用0.05、0.3和1.0 mm氧化铝粉打磨抛光至镜面，再超纯水洗涤干净；
（2）将3 µL、浓度为1.5 mg/mL的金杂化石墨烯溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
（3）继续滴涂3 µL、浓度为10 μg/mL的胰岛素抗体标准溶液于玻碳电极表面，4 ºC冰箱中孵育12 h，超纯水清洗；
（4）继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）继续将6 μL、浓度为1 fg/mL～100.0 ng/mL的一系列不同浓度的胰岛素抗原标准溶液滴涂在电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（6）继续滴加2.5 mg/mL的钯修饰的硫氧铟化铜二抗标记物，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗。
实施例3一种金杂化石墨烯和钯修饰的硫氧铟化铜用于检测胰岛素的电化学传感器的制备方法
(1) 将直径为4 mm的玻碳电极分别用0.05、0.3和1.0 mm氧化铝粉打磨抛光至镜面，再超纯水洗涤干净；
（2）将3 µL、浓度为2.0 mg/mL的金杂化石墨烯溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
（3）继续滴涂3 µL、浓度为10 μg/mL的胰岛素抗体标准溶液于玻碳电极表面，4 ºC冰箱中孵育12 h，超纯水清洗；
（4）继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）继续将6 μL、浓度为1 fg/mL～100.0 ng/mL的一系列不同浓度的胰岛素抗原标准溶液滴涂在电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（6）继续滴加3.0 mg/mL的钯修饰的硫氧铟化铜二抗标记物，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗。
实施例4氧硫铟化铜以及钯纳米粒子的制备
1）花状氧硫化铜的制备
在磁力搅拌的条件下，将4.5 g 三水合硝酸铜和4.5 g氯化铟加入到500 mL水溶液中。再将1.5 g硫代乙酰胺加入到上述的500 mL溶液中。30 min后，将该溶液加热到90 ºC。接下来再加入0.12 mL肼搅拌2 h后得到沉淀固体，用去离子水洗涤直至洗涤液的pH为7后再用乙醇清洗数次去除有机物。将所得固体样品放在真空干燥箱中50 ºC下干燥24 h，研磨后得到花状氧硫铟化铜纳米材料
（2）钯纳米粒子的制备
钯纳米粒子是通过将四氯钯酸钾溶液加入到抗坏血酸和溴化钾的溶液中还原制备的。将105 mg的聚乙烯吡咯烷酮，80 mg的抗坏血酸和600 mg的溴化钾溶解在去离子水中, 将该溶液用油浴加热到90 ºC，并且保持10 min。然后用滴管逐滴加入含四氯钯酸钾（60 mg）的3.0 mL水溶液，并且将这一反应在80 ºC保持3 h，洗涤离心后将其溶解在10 mL的去离子水中；
(3) 钯纳米粒子功能化氧硫铟化铜纳米材料的制备
将600 μL的钯纳米粒子溶液加入到 2 mL的2.0 mg/mL的氧硫化铟化铜溶液中，在室温下振荡24 h, 离心分离后的产物经多次水洗去除多余的钯纳米粒子，再分散于去离子水中（2 mL）得到钯纳米粒子功能化花状氧硫铟化铜溶液。
实施例5氧硫铟化铜以及钯纳米粒子的制备
1）花状氧硫化铜的制备
在磁力搅拌的条件下，将4.5 g 三水合硝酸铜和4.5 g氯化铟加入到500 mL水溶液中。再将1.5 g硫代乙酰胺加入到上述的500 mL溶液中。30 min后，将该溶液加热到90 ºC。接下来再加入0.12 mL肼搅拌2 h后得到沉淀固体，用去离子水洗涤直至洗涤液的pH为7后再用乙醇清洗数次去除有机物。将所得固体样品放在真空干燥箱中50 ºC下干燥24 h，研磨后得到花状氧硫铟化铜纳米材料
（2）钯纳米粒子的制备
钯纳米粒子是通过将四氯钯酸钾溶液加入到抗坏血酸和溴化钾的溶液中还原制备的。将105 mg的聚乙烯吡咯烷酮，90 mg的抗坏血酸和700 mg的溴化钾溶解在去离子水中, 将该溶液用油浴加热到90 ºC，并且保持10 min。然后用滴管逐滴加入含四氯钯酸钾（70 mg）的3.0 mL水溶液，并且将这一反应在80 ºC保持3 h，洗涤离心后将其溶解在10 mL的去离子水中；
(3) 钯纳米粒子功能化氧硫铟化铜纳米材料的制备
将700 μL的钯纳米粒子溶液加入到 2 mL的3.0 mg/mL的氧硫化铟化铜溶液中，在室温下振荡24 h, 离心分离后的产物经多次水洗去除多余的钯纳米粒子，再分散于去离子水中（2 mL）得到钯纳米粒子功能化花状氧硫铟化铜溶液。
实施例6氧硫铟化铜以及钯纳米粒子的制备
1）花状氧硫化铜的制备
在磁力搅拌的条件下，将4.5 g 三水合硝酸铜和4.5 g氯化铟加入到500 mL水溶液中。再将1.5 g硫代乙酰胺加入到上述的500 mL溶液中。30 min后，将该溶液加热到90 ºC。接下来再加入0.12 mL肼搅拌2 h后得到沉淀固体，用去离子水洗涤直至洗涤液的pH为7后再用乙醇清洗数次去除有机物。将所得固体样品放在真空干燥箱中50 ºC下干燥24 h，研磨后得到花状氧硫铟化铜纳米材料。
（2）钯纳米粒子的制备
钯纳米粒子是通过将四氯钯酸钾溶液加入到抗坏血酸和溴化钾的溶液中还原制备的。将105 mg的聚乙烯吡咯烷酮， 100 mg的抗坏血酸和800 mg的溴化钾溶解在去离子水中, 将该溶液用油浴加热到90 ºC，并且保持10 min。然后用滴管逐滴加入含四氯钯酸钾（80 mg）的3.0 mL水溶液，并且将这一反应在80 ºC保持3 h，洗涤离心后将其溶解在10 mL的去离子水中；
(3) 钯纳米粒子功能化氧硫铟化铜纳米材料的制备
将800 μL的钯纳米粒子溶液加入到 2 mL的4.0 mg/mL的氧硫化铟化铜溶液中，在室温下振荡24 h, 离心分离后的产物经多次水洗去除多余的钯纳米粒子，再分散于去离子水中（2 mL）得到钯纳米粒子功能化花状氧硫铟化铜溶液。
实施例7 胰岛素的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的一种基于金杂化石墨烯作为基底，钯纳米粒子功能化花状氧硫铟化铜电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL的pH 为4.0～9.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
（2）电化学工作站参数设置为，扫描电位为-0.2~-0.6 V，扫描速率设置为0.1 V/s
（3）使用10 mL的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液作为底液，通过差分脉冲伏安法检测不同浓度的胰岛素产生的电化学电流信号强度；所述磷酸盐缓冲溶液，其pH为7.4，用0.1mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L磷酸二氢钾配制；
（4）根据所得电流值与胰岛素浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（5）依据工作曲线的绘制方法进行样品中胰岛素的检测，检测结果从工作曲线中查得。
实施例8 胰岛素的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的一种基于金杂化石墨烯作为基底，钯纳米粒子功能化花状氧硫铟化铜电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL的pH 为4.0～9.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
（2）电化学工作站参数设置为，扫描电位为-0.2~-0.6 V，扫描速率设置为0.2 V/s
（3）使用10 mL的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液作为底液，通过差分脉冲伏安法检测不同浓度的胰岛素产生的电化学电流信号强度；所述磷酸盐缓冲溶液，其pH为7.4，用0.1mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L磷酸二氢钾配制；
（4）根据所得电流值与胰岛素浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（5）依据工作曲线的绘制方法进行样品中胰岛素的检测，检测结果从工作曲线中查得。
实施例9 胰岛素的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的一种基于金杂化石墨烯作为基底，钯纳米粒子功能化花状氧硫铟化铜电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL的pH 为4.0～9.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
（2）电化学工作站参数设置为，扫描电位为-0.2~-0.6 V，扫描速率设置为0.3 V/s
（3）使用10 mL的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液作为底液，通过差分脉冲伏安法检测不同浓度的胰岛素产生的电化学电流信号强度；所述磷酸盐缓冲溶液，其pH为7.4，用0.1mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L磷酸二氢钾配制；
（4）根据所得电流值与胰岛素浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（5）依据工作曲线的绘制方法进行样品中胰岛素的检测，检测结果从工作曲线中查得。
应用实施例1和2构建的传感器按照实施例7和8的检测方法对胰岛素抗原溶液进行了检测，测得传感器的线性检测范围为1.0 fg/mL～100 ng/mL，检测限为0.33 fg/mL。

Claims (4)

1.一种金石墨烯和钯氧硫铟化铜检测胰岛素的电化学传感器的制备方法，其特征在于，电化学免疫传感器的制备包括以下步骤:
（1）将直径为4 mm的玻碳电极分别用0.05、0.3和1.0 mm氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；
（2）将3 µL、浓度为1.0 ~ 2.0 mg/mL的金石墨烯溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
（3）继续滴涂3 µL、浓度为10 μg/mL的胰岛素抗体标准溶液于玻碳电极表面，4 ºC冰箱中孵育12 h，超纯水清洗；
（4）继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液用于封闭非特异性活性位点，4ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（5）继续将6 μL、浓度为1 fg/mL～100.0 ng/mL的一系列不同浓度的胰岛素抗原标准溶液滴涂在电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；
（6）继续滴涂2.0 mg/mL~3.0 mg/mL的钯氧硫铟化铜二抗标记物，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗。
2.如权利要求1所述的一种金石墨烯和钯氧硫铟化铜检测胰岛素的电化学传感器的制备方法，所述金石墨烯和钯氧硫铟化铜材料的制备方法，步骤如下：
（1）金石墨烯的合成
1）金纳米粒子的合成
将质量分数为0.02%的100 mL的氯金酸加热至沸腾，然后加入质量分数为1%的1.5 mL柠檬酸三钠沸腾的溶液后15 min变成明亮的红宝石色表明反应生成了金纳米粒子，将上述溶液冷却至室温；
2）氨基化石墨烯的合成
氧化石墨烯的合成
0.6 g石墨粉和3.6 g高锰酸钾加入到含有72 mL的硫酸和8 mL的磷酸的三口烧瓶中，将上述反应在50 ℃的条件下反应12 h，将上述反应冷却至室温并加入到80 mL的冰水溶液中；将30%的双氧水逐滴加入上述冰溶液中并且搅拌30 min后反应得到的褐色分散液在8000 rpm的条件下离心30 min，用0.2 mol/L的HCl溶液洗涤3次且用乙醚洗涤一次，离心处理后真空干燥12 h制得氧化石墨烯；
氨基化石墨烯的合成
将100 mg的氧化石墨烯加入到75 mL的超纯水中超声处理2 h，向上述溶液中加入氨丙基三乙氧基硅烷加热到70 ℃并且搅拌1.5 h，向上述溶液中加入100 μL的水合肼并在100℃条件下搅拌1 h，离心干燥制得氨基化石墨烯；
3）氨基化石墨烯-金纳米粒子的合成
将1 mL的10 mg/mL的氨基化石墨烯与60 mL的金纳米粒子溶液混合振荡12 h，利用氨基化石墨烯表面基团和金纳米粒子特异性结合制得负载金纳米粒子的氨基化石墨烯；
（2）钯氧硫铟化铜的制备
1）花状氧硫化铜的制备
在磁力搅拌的条件下，将4.5 g三水合硝酸铜和4.5 g氯化铟加入到500 mL水溶液中，再将1.5 g硫代乙酰胺加入到上述的500 mL溶液中，30 min后，将该溶液加热到90 ℃；接下来再加入0.12 mL肼搅拌2 h后得到沉淀固体，用去离子水洗涤直至洗涤液的pH为7后再用乙醇清洗数次去除有机物；将所得固体样品放在真空干燥箱中50 ºC下干燥24 h，研磨后得到花状氧硫铟化铜纳米材料；
2）钯纳米粒子的制备
钯纳米粒子是通过将四氯钯酸钾溶液加入到抗坏血酸和溴化钾的溶液中还原制备的；将105 mg的聚乙烯吡咯烷酮，80 mg～100 mg的抗坏血酸和600 mg～800 mg的溴化钾溶解在去离子水中，将该溶液用油浴加热到90 ºC，并且保持10 min；然后用滴管逐滴加入含四氯钯酸钾的3.0 mL水溶液，并且将这一反应在80 ºC保持3 h，洗涤离心后将其溶解在10 mL的去离子水中；
3）钯纳米粒子功能化氧硫铟化铜纳米材料的制备
将600 μL～800 μL的钯纳米粒子溶液加入到 2 mL的氧硫化铟化铜溶液中，在室温下振荡24 h，离心分离后的产物经多次水洗去除多余的钯纳米粒子，再分散于2 mL去离子水中得到钯纳米粒子功能化花状氧硫铟化铜溶液。
3.如权利要求1所述的一种金石墨烯和钯氧硫铟化铜检测胰岛素的电化学传感器的制备方法，1 fg/mL～100.0 ng/mL之间不同浓度的胰岛素标准溶液是将南京金斯瑞生物科技有限公司购得的1 mg/mL的胰岛素溶液用磷酸盐缓冲溶液稀释而得到。
4.如权利要求1所述的制备方法所制备的电化学传感器的检测方法，其特征在于，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的一种基于金石墨烯作为基底，钯氧硫铟化铜电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL的pH 为4.0～9.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
（2）电化学工作站参数设置为，扫描电位为-0.2~-0.6 V，扫描速率设置为0.1 ~0.3 V/s；
（3）使用10 mL的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液作为底液，通过差分脉冲伏安法检测不同浓度的胰岛素产生的电化学电流信号强度；所述磷酸盐缓冲溶液，其pH为7.4，用0.1 mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L磷酸二氢钾配制；
（4）根据所得电流值与胰岛素浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（5）依据工作曲线的绘制方法进行样品中胰岛素的检测，检测结果从工作曲线中查得。
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