CN111220670A - 一种无酶电化学适体细胞传感器、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞检测技术领域，公开了一种无酶电化学适体细胞传感器、制备方法及应用。本发明通过原位生长法在玻碳电极工作区域电沉积金纳米粒子，通过肝癌细胞与捕获适体(巯基化的TLS11a)的特异性结合作用捕获目标肝癌细胞，进而将甲苯胺蓝(Tb)与血红素/G‑四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料负载在电极表面，催化过氧化氢产生还原电流，实现对肝癌细胞的灵敏、准确检测，具有重要临床应用价值。

Description

一种无酶电化学适体细胞传感器、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞检测技术领域，具体涉及一种无酶电化学适体细胞传感器、制备方法及应用，更具体涉及一种通过杂化纳米材料催化底物过氧化氢产生还原电流，从而检测肝癌细胞浓度，属于超灵敏的电化学细胞传感器的制备技术。
背景技术
甲胎蛋白(AFP)常被用作筛选和诊断原发性肝癌的生物标志物。然而，AFP作为肝癌标志物并不可靠，因为血清中AFP的浓度可能在许多其他肝病中更高。因此对于肝癌的监测，在临床研究中仅仅检测甲胎蛋白(AFP)的水平是不可信的。因此，准确灵敏检测分析肝癌细胞在肿瘤诊断和治疗中具有重要的临床意义。为了实现这个目标，有必要建立一个直接的方法来实现对人肝癌细胞的灵敏检测。到目前为止，已经引入了很多技术和方法来实现对癌细胞的检测，包括流式细胞术、免疫组化、质谱、聚合酶链反应(PCR)、微流控技术、电化学发光、荧光分析和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等。尽管这些方法被广泛使用，但其中许多方法耗时、耗力、成本高、需要复杂的仪器和高水平的专业技能。
相比之下，电化学生物传感器由于其易于操作、成本低、响应快等优点，越来越受到人们的关注，但在肝癌细胞(HepG2)中普遍存在灵敏度不高的问题。电化学生物传感器中信号标记物是影响检测灵敏度的重要因素。因此，设计可以可以用于检测肝癌细胞且能够放大电化学信号的信号标记物对于提高电化学生物传感器的灵敏度具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是通过原位生长法制备金纳米粒子修饰的玻碳电极，通过特定捕获适体与肝癌细胞的特异性结合作用，捕获目标癌细胞，将甲苯胺蓝(Tb)与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料负载在电极表面，催化过氧化氢产生还原电流，实现对肝癌细胞的灵敏、准确检测。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种无酶电化学适体细胞传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1.利用原位生长法在玻碳电极工作区域电沉积金纳米粒子，用二次水冲洗后在室温下干燥；
S2.将捕获适体修饰在步骤S1获得的玻碳电极的工作区域，采用牛血清白蛋白溶液封闭非特异性结合位点，然后利用所述捕获适体捕获肝癌细胞；
S3.将信号标记物分散在1mL水中，然后滴加在步骤S2获得的捕获有肝癌细胞的玻碳电极的工作区域内，在37℃下孵育1小时，并用磷酸盐缓冲溶液冲洗；
其中，所述信号标记物为甲苯胺蓝与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料。
优选的，所述信号标记物的制备包括以下步骤：
S31.将100μL浓度为2μM的巯基化的信号适体、50μL浓度为3mM的甲苯胺蓝与2mL浓度为2mg/mL的Fe3O4@Au核壳纳米粒子混合，在4℃下搅拌12个小时得到混合溶液A；
S32.将200μL浓度为0.5mg/mL血红素加入到所述混合溶液A中并在4℃下搅拌2小时，得到血红素/G-四联体结构的混合溶液B；
S33.将50μL浓度为1wt％的牛血清白蛋白溶液加入到所述混合溶液B中反应30分钟，离心洗涤后，得甲苯胺蓝与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料，即信号标记物。
本发明中，巯基化的信号适体的序列为：5’-HS-(CH2)6-ACA GCA TCC CCATGT GAACAA TCG CAT TGT GAT TGT TAC GGT TTC CGC CTC ATG GAC GTG CTG-Spacer18-TTT GGGTAG GGC GGG TTG GG-3’，其中，TTT GGG TAG GGC GGG TTG GG为G-四联体形成的序列，Spacer-18连接由PEG组成，这样设计便于减少干扰。
优选的，所述利用原位生长法在玻碳电极工作区域电沉积金纳米粒子的具体步骤为：
S11.将玻碳电极分别用0.3μm粒径和0.05μm粒径的Al2O3粉末抛光打磨并用二次水冲洗，再在无水乙醇和二次水的混合溶液中超声清洗2分钟后再用二次水冲洗干净，用吸耳球吹干所述玻碳电极；
S12.将步骤S11处理过的玻碳电极置于浓度为1wt％的HAuCl4溶液中，在电位为-0.2V的条件下循环伏安扫描30秒，使金纳米粒子电沉积到玻碳电极表面。
优选的，所述捕获适体为巯基化的TLS11a适体，所述捕获适体的浓度为2～2.2μM。
本发明中，巯基化的TLS11a适体的序列为5’-HS-(CH2)6-ACA GCATCC CCA TGT GAACAATCG CAT TGT GAT TGT TAC GGT TTC CGC CTC ATG GAC GTG CTG-3’。
巯基化的TLS11a适体可以特异性识别HepG2细胞。
优选的，所述步骤S2具体为：将10μL捕获适体滴到沉积有金纳米粒子的玻碳电极工作区域，在4℃下孵育16小时，滴加10μL浓度为1wt％牛血清白蛋白溶液用于封堵非特异性结合位点，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后，继续滴加20μL不同浓度的肝癌细胞悬浮液，在37℃下孵育1小时，随后用磷酸盐缓冲溶液洗去未反应的肝癌细胞。
优选的，所述Fe3O4@Au核壳纳米粒子的粒径为380-385nm。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的无酶电化学适体细胞传感器。
本发明还提供了一种上述无酶电化学适体细胞传感器在肝癌细胞HepG2检测方面的应用。
优选的，所述应用具体为：基于所述无酶电化学适体细胞传感器，采用计时安培法结合电化学工作站对肝癌细胞HepG2检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)在玻碳电极表面电沉积金纳米粒子，增大了比表面积，提高了导电性和生物相容性，有利于固载更多的信号适体，降低检测限。
(2)利用Tb和hemin/G-四联体标记的Fe3O4@Au核壳纳米粒子作为纳米电催化剂，其中，Fe3O4@Au可作为纳米载体固载更多的电活性物质和识别探针，甲苯胺蓝(Tb)是一种常用的电子传递媒介来提供电化学信号。含有氨基的Tb和末端氨基修饰的信号适体可通过Au-N键偶联到Fe3O4@Au纳米粒子上，当引入hemin后，形成了大量的hemin/G-四联体DNA酶，可以共催化H2O2的还原，促进Tb的电子转移，进一步放大了电化学信号，进而提高检测的灵敏度。
(3)基于杂化纳米材料，利用信号放大策略，构建了用于检测肝癌细胞的无酶电化学细胞传感器，可以实现简单、高效、灵敏地检测肝癌细胞，在肝癌的早期诊断和治疗中具有重大的意义。
附图说明
图1为本发明中信号标记物的制备过程示意图；
图2为本发明中构建的无酶电化学适体细胞传感器的构建过程示意图；
图3为本发明中Fe3O4@Au核壳纳米粒子透射电镜图像和粒径分布图；
图4为本发明中不同的信号标记物制备的无酶电化学适体细胞传感器的计时电流响应曲线对比图：
图5为本发明中无酶电化学适体细胞传感器检测不同浓度的HepG2细胞的响应电流的线性曲线。
具体实施方式
以下实施例中用到的试剂和仪器：血红素(hemin)和甲苯胺蓝(Tb)购于sigma-Aldrich。柠檬酸钠(Na3Cit·2H2O，≥99.0％)、六水三氯化铁(FeCl3·6H2O，≥99.0％)、乙二醇(EG，≥99.0％)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、无水乙酸钠(NaAc，≥99.0％)、过氧化氢(H2O2)、牛血清白蛋白(BSA)和氨水(NH3·H2O，25wt％)购于国药化学试剂有限公司(中国，上海)。(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES，97.0％)购于阿拉丁化学试剂公司。本研究中的氨基化的TLS11a适体和信号适体由上海生工生物工程股份有限公司合成并纯化。电化学实验中的计时电流(i-t)和循环伏安(CV)的测定均采用的是CHI 660B电化学工作站(上海辰华仪器有限公司，上海)。
实施例1：
如图1所示，信号标记物(甲苯胺蓝与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料)的制备过程如下：
(1)氨基化的Fe3O4 NPs的制备：在搅拌的条件下将FeCl3(0.65g，4mM)和Na3Cit(0.2g，0.28mM)首先溶解于乙二醇(28mL)中以形成均匀的混合溶液。接下来，将NaAc(1.2g)加入到上述混合物中并用力搅拌。将混合物剧烈搅拌30分钟，然后转移到高温反应釜中在200℃下加热10小时。冷却至室温后，用乙醇和超纯水通过外加磁铁对产物进行多次洗涤并在50℃下干燥。将干燥的黑色Fe3O4粉末(0.02g)加入到无水乙醇(30mL)和超纯水(2mL)的混合溶液中并超声15分钟。随后，将2mL的氨水(25％)和200μL的APTES依次加入到上述溶液中并在室温下机械搅拌8小时。反应结束后，用去离子水和无水乙醇在外加磁铁的辅助下对制备的氨基化的Fe3O4 NPs进行多次洗涤。随后，将产物溶解于1mL二次水中。
(2)Au NPs的制备：将100mL的HAuCl4(1mM)溶液剧烈搅拌，并加热到100℃沸腾10分钟，然后将10mL的Na3Cit(38.8mM)水溶液快速加入上述溶液中并将溶液在100℃下继续搅拌约15分钟。溶液颜色从蓝色变为酒红色后，停止加热，将胶体溶液在室温下冷却15分钟后储存在4℃冰箱中。合成的Au NPs的浓度大约为1mM。
(3)氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的制备：将0.05g Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子超声溶于35mL乙醇和6mL水中，用氨水将pH调至9，然后加入20μL正硅酸四乙酯(TEOS)和100μL三乙氧基硅烷(APTES)，大力搅拌8小时。产物用乙醇和超纯水经磁力洗涤三次后，制备的产物在50℃下干燥即得。
(4)Fe3O4@Au核壳纳米粒子的制备：在室温下将1mL氨基化的Fe3O4 NPs(1mg mL-1)、10mLAu NPs溶液和1mL水机械搅拌3小时将Au NPs吸附到氨基化的Fe3O4 NPs表面。样品用PBS(pH 7.4)洗涤三次并溶于2mL水中，得到Fe3O4@Au溶液(1mg mL-1)。对Fe3O4@Au核壳纳米粒子表征结果见图3。图3中，A为Fe3O4@Au核壳纳米粒子的低倍透射电镜图，B为Fe3O4@Au核壳纳米粒子的高倍透射电镜图，C为Fe3O4@Au核壳纳米粒子的粒径分布图。从图3A中可以看出，Fe3O4@Au纳米复合材料是具有粒径均匀的球形结构且表面粗糙。从放大的TEM图像(图3B)中得到，大量的Au NPs成功地附着在Fe3O4NPs的表面。图3C表明Fe3O4@Au NPs的平均尺寸约为380-385nm。
(5)甲苯胺蓝与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料的制备：首先，将氨基化的信号适体(100μL，2μM)和Tb(50μL，3mM)与已制备好的Fe3O4@Au纳米复合物(2mL，2mgmL-1)混合并在4℃下温和地搅拌12个小时。接着，hemin(200μL，0.5mg mL-1)加入到上述混合溶液中并在4℃下搅拌2小时形成hemin/G-四联体结构。然后，为了封闭非特异性的吸附位点，将50μL的BSA(1％，w/w)溶液加入到上述混合物溶液中反应30分钟。最终的产物离心洗涤三次，重新分散在1mL水中，放置在4℃冰箱中保存备用。
实施例2：无酶电化学适体细胞传感器的制备
如图2所示，首先，GCE分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光打磨并用二次水冲洗，再在无水乙醇和二次水的混合溶液中超声几分钟并用二次水冲洗干净，用吸耳球吹干电极备用。将处理过的GCE在HAuCl4溶液中(w/w,1％)在-0.2V进行循环伏安扫描30秒，将金纳米粒子电沉积到玻碳电极表面，用二次水冲洗三次并在室温下干燥备用。接下来，将巯基化的TLS11a适体(10μL，2μM)滴加到Au NPs修饰的玻碳电极表面并在4℃下孵育16小时。其后将10μL的BSA(1％，w/w)溶液滴加到上述修饰过的玻碳电极表面并孵育40分钟来封闭剩余的活性位点并用PBS冲洗几次。接着将20μL不同浓度的细胞悬浮液与细胞捕获界面在37℃下孵育1小时来捕获目标细胞。最后，将信号标记物(甲苯胺蓝与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料)分散在1mL水中，然后取10μL滴加在捕获过细胞的玻碳电极的工作区域内，在37℃下孵育1小时，并用磷酸盐缓冲溶液冲洗几次。
实施例3：不同信号标记物的信号放大策略比较
为了探究所建立的细胞传感器的信号放大性能，制备了四种信号标记物分别检测相同浓度的HepG2细胞。这四种信号标记物分别是：a.信号适体修饰的金纳米粒子形成的纳米标记物(Au NPs-signal aptamer-BSA)；b.信号适体修饰的Fe3O4@Au核壳纳米粒子形成的纳米标记物(Fe3O4@Au-signal aptamer-BSA)；c.血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au核壳纳米粒子形成的纳米标记物(hemin/G-四联体标记的Fe3O4@Au-BSA)；d.甲苯胺蓝和血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au核壳纳米粒子形成的纳米标记物(hemin/G-四联体标记的Fe3O4@Au-BSA)。将不同的信号标记物制备的无酶电化学适体细胞传感器的计时电流响应曲线两两比较，结果如图4所示。图4中，A为信号标记物a与信号标记物b制备的无酶电化学适体细胞传感器的计时电流响应曲线对比图，B为信号标记物b与信号标记物c制备的无酶电化学适体细胞传感器的计时电流响应曲线对比图，C为信号标记物c与信号标记物d制备的无酶电化学适体细胞传感器的计时电流响应曲线对比图。如图4A所示，与Au NPs-signal aptamer-BSA相比，Fe3O4@Au-signal aptamer-BSA作为信号标记物构建的细胞传感器表现出更强的电流信号响应。这是因为Fe3O4@Au纳米复合物对H2O2的还原具有很好的催化能力。当用hemin/G-四联体标记的Fe3O4@Au-BSA作为信号标记物时，电化学信号进一步明显增加(图4B)，由于hemin/G-四联体作为一种过氧化物模拟酶，也可以催化H2O2的还原。值得注意的是，当用Tb和hemin/G-四联体同时标记Fe3O4@Au-BSA作为信号标记物，与其他三种信号标记物相比，其电流响应信号变化最大(图4C)。可能的原因是Fe3O4@Au和hemin/G-四联体共催化H2O2，从而促进了Tb电子转移以及放大电化学信号。因此，Tb和hemin/G-四联体同时标记Fe3O4@Au-BSA作为信号标记物对于构建细胞传感器的信号放大作用最强。
实施例4：肝癌细胞电化学检测
选择-0.4V作为检测电位，采用三电极体系，利用计时安培法记录电流测量值。在背景电流稳定后，在温和搅拌下将H2O2溶液(10μL，5M)注入PBS(pH7.4，10mL)中，记录电流变化。分析结果如图5所示，在肝癌细胞浓度为50cells mL-1到5×107cells mL-1区间内，计时电流信号大小与细胞浓度对数值呈线性相关，其相关系数为0.998，检测限为20cells mL-1。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 南通大学
<120> 一种无酶电化学适体细胞传感器、制备方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
acagcatccc catgtgaaca atcgcattgt gattgttacg gtttccgcct catggacgtg 60
ctg 63
<210> 2
<211> 83
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
acagcatccc catgtgaaca atcgcattgt gattgttacg gtttccgcct catggacgtg 60
ctgtttgggt agggcgggtt ggg 83

Claims (9)

1.一种无酶电化学适体细胞传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.利用原位生长法在玻碳电极工作区域电沉积金纳米粒子，用二次水冲洗后在室温下干燥；
S2.将捕获适体修饰在步骤S1获得的玻碳电极的工作区域，采用牛血清白蛋白溶液封闭非特异性结合位点，然后利用所述捕获适体捕获肝癌细胞；
S3.将信号标记物分散在1mL水中，然后滴加在步骤S2获得的捕获有肝癌细胞的玻碳电极的工作区域内，在37℃下孵育1小时，并用磷酸盐缓冲溶液冲洗；
其中，所述信号标记物为甲苯胺蓝与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述信号标记物的制备包括以下步骤：
S31.将100μL浓度为2μM的巯基化的信号适体、50μL浓度为3mM的甲苯胺蓝与2mL浓度为2mg/mL的Fe3O4@Au核壳纳米粒子混合，在4℃下搅拌12个小时得到混合溶液A；
S32.将200μL浓度为0.5mg/mL血红素加入到所述混合溶液A中并在4℃下搅拌2小时，得到血红素/G-四联体结构的混合溶液B；
S33.将50μL浓度为1wt％的牛血清白蛋白溶液加入到所述混合溶液B中反应30分钟，离心洗涤后，得甲苯胺蓝与血红素/G-四联体标记的Fe3O4@Au纳米复合材料，即信号标记物。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述利用原位生长法在玻碳电极工作区域电沉积金纳米粒子的具体步骤为：
S11.将玻碳电极分别用0.3μm粒径和0.05μm粒径的Al2O3粉末抛光打磨并用二次水冲洗，再在无水乙醇和二次水的混合溶液中超声清洗2分钟后再用二次水冲洗干净，用吸耳球吹干所述玻碳电极；
S12.将步骤S11处理过的玻碳电极置于浓度为1wt％的HAuCl4溶液中，在电位为-0.2V的条件下循环伏安扫描30秒，使金纳米粒子电沉积到玻碳电极表面。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述捕获适体为巯基化的TLS11a适体，所述捕获适体的浓度为2～2.2μM。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：将10μL捕获适体滴到沉积有金纳米粒子的玻碳电极工作区域，在4℃下孵育16小时，滴加10μL浓度为1wt％牛血清白蛋白溶液用于封堵非特异性结合位点，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后，继续滴加20μL不同浓度的肝癌细胞悬浮液，在37℃下孵育1小时，随后用磷酸盐缓冲溶液洗去未反应的肝癌细胞。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述Fe3O4@Au核壳纳米粒子的粒径为380-385nm。
7.根据权利要求1～6任一项所述制备方法制备得到的无酶电化学适体细胞传感器。
8.根据权利要求7所述的无酶电化学适体细胞传感器在肝癌细胞HepG2检测方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：基于所述无酶电化学适体细胞传感器，采用计时安培法结合电化学工作站对肝癌细胞HepG2检测。
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