CN104297473B - 一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器制备方法及应用 - Google Patents

一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感技术领域。基于rGO-MWCNT-Pd的三维立体结构，大的比表面积，良好的生物相容性和较高的催化效率等特点，显著提高了无标记猪细小病毒免疫传感器的灵敏度和稳定性。

Description

一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感技术领域。
背景技术
猪细小病毒会引起一种猪繁殖障碍病，猪细小病毒病，该病主要表现为胚胎和胎儿的感染和死亡，特别是初产母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎，但母猪本身无明显的症状。目前，该病在世界范围内广泛分布，在大多数感染猪场呈地方性流行，猪群感染后很难净化，从而造成了持续的经济损失，现已是我国较常见的猪病之一。因此猪细小病毒的快速灵敏检测就显得尤为重要。
免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特异性结合，显著提高了传感器的选择性。
电化学免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点。
近年来，零维的富勒烯，一维的碳纳米管以及二维石墨烯等碳基材料因其独特的性质而被广泛应用。本发明制备了三维的碳基杂化材料rGO-MWCNT，将rGO的优异的导电性和MWCNT大的比表面积结合起来，并且在其三维结构中插入了Pd纳米粒子，利用贵金属可以和抗体直接形成Pd-NH键，实现抗体在电极表面的固定；三维的rGO-MWCNT可以容纳更多的Pd纳米粒子，并且其自身也具有优异的电子传导能力，起到了增强电化学信号的作用。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程简单。
发明内容
本发明的目的之一是基于rGO-MWCNT-Pd纳米复合物，构建了一种无酶、无标记的电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是将该传感器应用于猪细小病毒的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器制备方法步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；滴加 6μL、0.5 ~ 2 mg/mL 的三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液于电极表面， 室温下晾干；
（2）滴加6 μL、5~10 μg/mL 的猪细小病毒抗体于电极表面，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为1~2%的BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（4）滴加6 μL、0.01~25 ng/mL的一系列不同浓度的猪细小病毒抗原标准溶液于电极表面，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干，制得一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器。
2. 三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液的制备，步骤如下：
（1）三维结构的rGO-MWCNT纳米复合物的制备
将20~40mg的多壁碳纳米管MWCNT 加入到30 mL、 1~3 mg/mL 的氧化石墨烯均匀分散的溶液中，超声30 min，将得到混合物置于50 mL 的高压反应釜中，加热到160~190℃，保持12 h，冷却到室温，制得三维结构的rGO-MWCNT纳米复合物，冷冻干燥12 h；
（2）三维结构的rGO-MWCNT-Pd 纳米复合物溶液的制备
在剧烈搅拌的条件下，将 1mL 、7~13 mmol/L 的K2PdCl4 和5 mg 的三维结构的rGO-MWCNT 纳米复合物加入到10 mL的超纯水中，冰浴30min，将得到混合物在7000 rpm下，离心分离5 min，用水洗涤，离心分离3次，35~50℃下真空干燥12h，制得三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物，用超纯水配制成0.5 ~ 2 mg/mL 的三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液。
3. 猪细小病毒的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的无标记猪细小病毒传感器为工作电极，在15 mL、40~60mmol/L、pH 6.0~8.0的铁氰化钾的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）用方波伏安方法对猪细小病毒抗原标准溶液进行检测，输入电压范围为-0.2~0.6 V，灵敏度10-4，扫描速度50 mV/s，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替猪细小病毒抗原的标准溶液进行检测。
本发明的有益成果
（1）        本发明将多壁碳纳米管MWCNT引入三维还原氧化石墨烯rGO 中，防止了rGO因为π-π作用力造成的导电性能降低；
（2）        本发明将多壁碳纳米管MWCNT引入三维还原氧化石墨烯rGO 中，形成的三维网状结构有利于电子传递，并且增大了比表面积，从而负载更多的Pd晶核，从而三维网状结构上得到大量的Pd纳米颗粒。由于Pd纳米颗粒可以直接和抗体结合，使其结合更多的抗体，显著提高了检测的灵敏度；
（3）本发明利用抗原、抗体的免疫反应，提高了检测方法的特异性。
（4） 本发明制备的电化学免疫传感器用于猪细小病毒检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测，对猪细小病毒检测限可达2.3 pg/mL。
具体实施方式
实施例1一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器制备方法
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；滴加 6μL、0.5mg/mL 的三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液于电极表面， 室温下晾干；
（2）滴加6 μL、5μg/mL 的猪细小病毒抗体于电极表面，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为1%的BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（4）滴加6 μL、0.01~25 ng/mL的一系列不同浓度的猪细小病毒抗原标准溶液于电极表面，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干，制得一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器。
实施例2一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器制备方法
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；滴加 6μL、1.0mg/mL 的三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液于电极表面， 室温下晾干；
（2）滴加6 μL、8 μg/mL 的猪细小病毒抗体于电极表面，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为1.5%的BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（4）滴加6 μL、0.01~25 ng/mL的一系列不同浓度的猪细小病毒抗原标准溶液于电极表面，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干，制得一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器。
实施例3  一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器制备方法
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；滴加 6μL、2 mg/mL 的三维结构的rrGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液于电极表面， 室温下晾干；
（2）滴加6 μL、10 μg/mL 的猪细小病毒抗体于电极表面，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为2%的BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（4）滴加6 μL、0.01~25 ng/mL的一系列不同浓度的猪细小病毒抗原标准溶液于电极表面，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干，制得一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器。
实施例4  三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液的制备
（1）三维结构的rGO-MWCNT纳米复合物的制备
将20mg的多壁碳纳米管MWCNT 加入到30 mL、 1 mg/mL 的氧化石墨烯均匀分散的溶液中，超声30 min，将得到混合物置于50 mL 的高压反应釜中，加热到160℃，保持12 h，冷却到室温，制得三维结构的rGO-MWCNT纳米复合物，冷冻干燥12 h；
（2） 三维结构的rGO-MWCNT-Pd 纳米复合物溶液的制备
在剧烈搅拌的条件下，将 1mL 、7 mmol/L 的K2PdCl4 和5 mg 的三维结构的rGO-MWCNT 纳米复合物加入到10 mL的超纯水中，冰浴30min，将得到混合物在7000 rpm下，离心分离5 min，用水洗涤，离心分离3次，35℃下真空干燥12h，制得三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物，用超纯水配制成0.5 mg/mL 的三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液。
实施例5  三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液的制备
（1）三维结构的rGO-MWCNT纳米复合物的制备
将30mg的多壁碳纳米管MWCNT 加入到30 mL、 2 mg/mL 的氧化石墨烯均匀分散的溶液中，超声30 min，将得到混合物置于50 mL 的高压反应釜中，加热到180℃，保持12 h，冷却到室温，制得三维结构的rGO-MWCNT纳米复合物，冷冻干燥12 h；
（2）三维结构的rGO-MWCNT-Pd 纳米复合物溶液的制备
在剧烈搅拌的条件下，将 1mL 、10mmol/L 的K2PdCl4 和5 mg 的三维结构的rGO-MWCNT 纳米复合物加入到10 mL的超纯水中，冰浴30min，将得到混合物在7000 rpm下，离心分离5 min，用水洗涤，离心分离3次，40℃下真空干燥12h，制得三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物，用超纯水配制成1.0 mg/mL 的三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液。
实施例6 三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液的制备
（1）三维结构的rGO-MWCNT纳米复合物的制备
将40mg的多壁碳纳米管MWCNT 加入到30 mL、3 mg/mL 的氧化石墨烯均匀分散的溶液中，超声30 min，将得到混合物置于50 mL 的高压反应釜中，加热到190℃，保持12 h，冷却到室温，制得三维结构的rGO-MWCNT纳米复合物，冷冻干燥12 h；
（2）三维结构的rGO-MWCNT-Pd 纳米复合物溶液的制备
在剧烈搅拌的条件下，将 1mL 、13 mmol/L 的K2PdCl4 和5 mg 的三维结构的rGO-MWCNT 纳米复合物加入到10 mL的超纯水中，冰浴30min，将得到混合物在7000 rpm下，离心分离5 min，用水洗涤，离心分离3次， 50℃下真空干燥12h，制得三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物，用超纯水配制成2 mg/mL 的三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液。
实施例7 猪细小病毒的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的无标记猪细小病毒传感器为工作电极，在15 mL、50 mmol/L、pH 6.0~8.0的铁氰化钾的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）用方波伏安方法对猪细小病毒抗原标准溶液进行检测，输入电压范围为-0.2~0.6 V，,灵敏度10-4，扫描速度50 mV/s，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替猪细小病毒抗原的标准溶液进行检测；
（4）猪细小病毒的线性范围0.010~25ng/mL，检测限2.3pg/mL。

Claims (2)

1.一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；滴加 6μL、0.5 ~ 2 mg/mL 的三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液于电极表面， 室温下晾干；
（2）滴加6 μL、5~10 μg/mL 的猪细小病毒抗体于电极表面，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为1~2%的BSA溶液于电极表面，封闭电极表面上非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；
（4）滴加6 μL、0.01~25 ng/mL的一系列不同浓度的猪细小病毒抗原标准溶液于电极表面，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干，制得一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器；
所述三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液，制备步骤如下：
（1）三维结构的rGO-MWCNT纳米复合物的制备
将20~40mg的多壁碳纳米管MWCNT 加入到30 mL、 1~3 mg/mL 的氧化石墨烯均匀分散的溶液中，超声30 min，将得到混合物置于50 mL 的高压反应釜中，加热到160~190℃，保持12 h，冷却到室温，制得三维结构的rGO-MWCNT纳米复合物，冷冻干燥12 h；
（2）三维结构的rGO-MWCNT-Pd 纳米复合物溶液的制备
在剧烈搅拌的条件下，将 1mL 、7~13 mmol/L 的K2PdCl4 和5 mg 的三维结构的rGO-MWCNT 纳米复合物加入到10 mL的超纯水中，冰浴30min，将得到混合物在7000 rpm下，离心分离5 min，用水洗涤，离心分离3次，35~50℃下真空干燥12h，制得三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物，用超纯水配制成0.5 ~ 2 mg/mL 的三维结构的rGO-MWCNT-Pd纳米复合物溶液。
2.如权利要求1 所述的制备方法制备的一种三维结构rGO-MWCNT-Pd无标记猪细小病毒传感器的应用，其特征在于，步骤如下：
使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的无标记猪细小病毒传感器为工作电极，在15 mL、40~60 mmol/L、pH 6.0~8.0的铁氰化钾的PBS缓冲溶液中进行测试；
用方波伏安方法对猪细小病毒抗原标准溶液进行检测，输入电压范围为-0.2~0.6 V，灵敏度10-4，扫描速度50 mV/s，绘制工作曲线；
将待测样品溶液代替猪细小病毒抗原的标准溶液进行检测。
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