CN117269288B - 一种用于glut1检测的电化学生物传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物免疫检测技术领域,具体涉及一种用于GLUT1检测的电化学生物传感器及其制备方法。电化学生物传感器包括电极,所述电极的表面依次修饰还原氧化石墨烯‑多壁碳纳米管复合材料和TBO‑GO‑Au‑Ab探针,所述TBO‑GO‑Au‑Ab探针由氧化石墨烯、金纳米颗粒、甲苯胺蓝O和GLUT1抗体复合组成。本发明的电化学传感器对活细胞GLUT1的检测表现出了卓越的性能,在浓度范围10‑105cells/mL内呈一定的线性关系,并具有良好的稳定性和选择性,最终实现了MCF7、MDA‑MB‑231、Hep G2、GBC‑SD、PANC‑1等多种肿瘤细胞GLUT1的检测。电化学生物传感器的构建对于评价肿瘤细胞的恶性程度,区分肿瘤细胞摄取葡萄糖的途径,降低医疗成本、推进电化学传感技术向临床的转化具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物免疫检测技术领域,具体涉及一种用于GLUT1检测的电化学生物传感器及其制备方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
GLUTs蛋白(glucose transporters)是一类负责人体细胞葡萄糖转运的膜转运蛋白,属于MFS(major facilitator superfamily)家族(TCDB ID:2.A.1.1.28)。目前共有14种GLUTs亚型被发现,它们分别被命名为GLUT1~GLUT12、HMIT和GLUT14。GLUT1蛋白(glucose transporter 1)是GLUTs家族最早被表征的蛋白之一,有着丰富的研究基础。GLUT1蛋白亦称为SLC2A1蛋白和HepG2葡萄糖转运蛋白,主要分布在细胞膜上。GLUT1蛋白在人类绝大多数正常细胞中均有表达,其中表达量最高的是血液中的红细胞以及血脑屏障组织,其次则是大脑。GLUT1蛋白在人体内主要负责细胞对基础型与组成型葡萄糖的摄取以及转运。存在于血脑屏障中的GLUT1蛋白可以确保大脑内葡萄糖的供应。
研究表明,肿瘤细胞中GLUT1过表达可以使肿瘤细胞己糖代谢增加,满足肿瘤存活、增殖足够的能量需求,使肿瘤细胞保持较高的侵袭性、活跃的生长和转移能力。GLUT1表达水平与肿瘤恶性程度密切相关,GLUT1表达阳性的肿瘤细胞侵袭性更强。肿瘤细胞中GLUT1过表达可以促进肿瘤细胞高糖酵解代谢,为肿瘤细胞的生存和增殖提供丰富的能量,从而促进肿瘤细胞的侵袭性、生长能力和转移能力。已有研究报道,可以通过改变GLUT1蛋白的表达与转运活性来抑制肿瘤细胞的营养供给达到治疗的目的。与葡萄糖摄取相关的调节因子RAS调节因子(小G蛋白)和PI3K蛋白(磷脂酰肌醇3-激酶)可以影响GLUT1蛋白的mRNA表达,促进GLUT1的转录过程,同时促进合成的GLUT1蛋白从胞内转运到细胞表面。由于GLUT1蛋白在肿瘤细胞细胞膜上大量表达,直接导致了肿瘤细胞对GLUT1抑制剂的敏感性相较于正常细胞显著增强。正常细胞进行有氧呼吸较肿瘤细胞的葡萄糖需求量小,因此可达到在对正常细胞葡萄糖供给影响较小的情况下降低肿瘤细胞葡萄糖摄入的药物疗效,从而实现对癌症的饥饿疗法。此外,高水平表达GLUT1的红细胞可作为氧气运输载体,当GLUT1受到抑制后,红细胞活性下降,其载氧量也下降,可以进一步剥夺肿瘤细胞的能量供给。GLUT1有望成为新的癌症治疗靶点,GLUT1抑制剂,如BAY-876,已被证明具有良好的肿瘤生长抑制作用,可作为结肠癌协同治疗药物。
目前,细胞上GLUT1的细胞生物学过程的检测采用的仍然是传统的生物学方法,比如Western-blotting、免疫荧光染色、细胞流式检测、吸光度检测等,这些检测方法不仅时间长、步骤繁琐、成本较高,而且需要破坏或者标记细胞。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本发明的目的是提供一种用于GLUT1检测的电化学生物传感器及其制备方法。本发明以还原氧化石墨烯-多壁碳纳米管复合材料作为电极的导电涂层,以TBO-GO-Au-Ab探针作为电化学探针,成功制备了用于细胞表面GLUT1表达检测的电化学传感器。该传感器对活细胞GLUT1的检测表现出了卓越的性能,在浓度范围10-105cells/mL内呈一定的线性关系,并具有良好的稳定性和选择性,最终实现了MCF7、MDA-MB-231、Hep G2、GBC-SD、PANC-1等多种肿瘤细胞GLUT1的检测。
为了实现上述目的,本发明是通过如下的技术方案来实现:
第一方面,本发明提供了一种用于GLUT1检测的电化学生物传感器,包括电极,所述电极的表面依次修饰还原氧化石墨烯-多壁碳纳米管复合材料和TBO-GO-Au-Ab探针,所述TBO-GO-Au-Ab探针由氧化石墨烯、金纳米颗粒、甲苯胺蓝O和GLUT1抗体复合组成。
优选的,所述TBO-GO-Au-Ab探针中氧化石墨烯作为支架,金纳米颗粒原位生长于氧化石墨烯上,甲苯胺蓝O和GLUT1抗体吸附于金纳米颗粒上。
优选的,所述电极为玻碳电极。
第二方面,本发明提供了一种如第一方面所述的用于GLUT1检测的电化学生物传感器的制备方法,将电极打磨、洗涤、干燥,在电极表面滴加还原氧化石墨烯-多壁碳纳米管复合材料悬浮液后干燥,再在电极表面滴加TBO-GO-Au-Ab探针悬浮液,并用BSA进行封闭。
优选的,还包括还原氧化石墨烯-多壁碳纳米管复合材料悬浮液的制备方法:
将氧化石墨烯溶解于水中,与水合肼进行加热反应,产物离心洗涤后超声分散于水中获得还原氧化石墨烯溶液;
将多壁碳纳米管与聚乙烯吡咯烷酮置于水中,经搅拌、超声后获得多壁碳纳米管溶液;
将还原氧化石墨烯溶液与多壁碳纳米管溶液混合在醋酸溶液中,超声后离心,在重复进行重悬超声,最后加入超纯水获得还原氧化石墨烯-多壁碳纳米管复合材料悬浮液。
优选的,还包括TBO-GO-Au-Ab探针悬浮液的制备方法,包括以下步骤:
在单层氧化石墨烯分散液中加入氯金酸溶液,加热搅拌至沸腾后滴加柠檬酸钠溶液,持续加热且搅拌19-21min后停止加热,搅拌至溶液冷却到室温,溶液离心后重复超纯水重悬、离心获得GO-Au,GO-Au于超纯水中重悬获得GO-Au溶液;
将甲苯胺蓝O溶液在搅拌下滴加到GO-Au溶液中,溶液离心后重复超纯水重悬、离心获得TVO-GO-Au,TBO-GO-Au于超纯水中重悬获得TBO-GO-Au溶液;
在TBO-GO-Au溶液中加入GLUT1抗体,室温下旋转摇床孵育后离心去除溶液上清,加入PBS重悬后再次离心,加入BSA封闭后离心,获得TBO-GO-Au-Ab探针,TBO-GO-Au-Ab探针重悬于PBS缓冲液中获得TBO-GO-Au-Ab探针悬浮液。
优选的,在TBO-GO-Au溶液中加入GLUT1抗体后溶液中GLUT1抗体的浓度为5-20μg/mL。
优选的,BSA的浓度为1%-5%。
第三方面,本发明提供了一种细胞表面GLUT1的检测方法,包括以下步骤:
将待测细胞滴加在如第一方面所述的用于GLUT1检测的电化学生物传感器表面,孵育后用PBS清洗,清洗后的电化学生物传感器作为工作电极在电解液为PBS溶液的三电极体系下进行差分脉冲伏安法检测,通过电流变化检测GLUT1的表达程度。
优选的,孵育时间为0.5-2h,差分脉冲伏安法的电压范围为-0.6V到-0.1V,振幅为50mV,电位阶跃为4mV。
上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下:
1.本发明的电化学生物传感器对活细胞GLUT1的检测表现出了卓越的性能,在浓度范围10-105cells/mL内呈一定的线性关系,并具有良好的稳定性和选择性。
2.由氧化石墨烯、金纳米颗粒、甲苯胺蓝O和GLUT1抗体复合组成的TBO-GO-Au-Ab探针对GLUTI1具有显著的荧光效应,还原氧化石墨烯-多壁碳纳米管复合材料显著增强电极的导电性与灵敏度,两者使电化学生物传感器具有卓越的性能。
3.电化学生物传感器检测结果与传统的流式细胞术、免疫印迹分析、细胞免疫荧光染色技术相一致,通过抑制剂证明了电化学生物传感器特异性检测GLUTI1的表达。
4.电化学生物传感器表现出对三种人肿瘤组织样本GLUT1检测的有效性。
5.电化学生物传感器的构建对于评价肿瘤细胞的恶性程度,区分肿瘤细胞摄取葡萄糖的途径,降低医疗成本、推进电化学传感技术向临床的转化具有重要意义。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明电化学生物传感器制备及检测的原理示意图;
图2为实施例1中(A)GO,(B)Au-GO,(C)TBO-GO-Au和(D)rGO-MWNCT的透射电镜图像;(E)GO、Au NPs、TBO、Au-GO和TBO-GO-Au的紫外-可见光谱图;(F)GO、TBO、Au-GO和TBO-GO-Au的红外光谱图;
图3中A为在10mM的K3[Fe(CN)]6中利用循环伏安法检测玻碳电极(GCE)、rGO修饰的玻碳电极(rGO)、MWCNT修饰的玻碳电极(MWCNT)、rGO-MWCNT修饰的玻碳电极(rGO-MWCNT)的氧化峰与还原峰值和电化学性能;B为在10mM铁氰化钾溶液中上述玻碳电极的的循环伏安图,扫描速率为10mV/s至200mV/s;C为氧化峰值电流(Ipa)与扫描速率的平方根(v1/2)的线性拟合以及还原峰值电流(Ipc)与扫描速率的平方根(v1/2)的线性拟合;
图4为实施例1中TBO的信号报告能力验证图,A为循环伏安法,B为差分脉冲伏安法;
图5为实施例2中(A)抗体浓度、(B)不同浓度的封闭液与(C)细胞孵育时间对电化学生物传感器性能的影响;
图6中A为差分脉冲伏安法对不同浓度的MCF-7细胞进行检测,B为电化学生物传感器对MCF-7细胞的检测灵敏度校准曲线,误差棒表示均值±标准差(n=3);
图7中A为MDA-MB-231、Hep G2、GBC-SD、MCF-7和PANC-1的免疫荧光染色图,比例尺为10μm;B为蛋白质免疫印迹分析显示结果;
图8中A为实施例3中免疫印迹法灰度值的统计,误差条代表一个标准偏差(n=3),B为实施例3中电化学生物传感器的检测浓度为1000cells/mL的结果,误差条代表一个标准偏差(n=3);
图9中A为正常MDA-MB-231(Control)、敲除GLUT1的MDA-MB-231(siRNA)、与阴性对照组MDA-MB-231(Negative)的葡萄糖摄取荧光图,比例尺为25μm;B为正常MDA-MB-231、敲除GLUT1的MDA-MB-231、与阴性对照组MDA-MB-231的GLUT1免疫印迹结果;C为正常MDA-MB-231、敲除GLUT1的MDA-MB-231实验组、与阴性对照组MDA-MB-231的电化学检测结果与显著性分析,***P<0.001,*P<0.05来源于检验,误差棒代表±s.d.(n=3);D,E分别为三组细胞的2-NBDG和GLUT1的流式分析结果直方图;
图10中A、B、C分别为在0.01M PBS中分别对不同浓度的正常MDA-MB-231、敲除GLUT1的MDA-MB-231、与阴性对照组MDA-MB-231进行差分脉冲伏安法检测,单位(cells/mL);D、E、F分别为GLUT1电化学细胞传感器对正常MDA-MB-231、敲除GLUT1的MDA-MB-231、与阴性对照组MDA-MB-231检测灵敏度的标准曲线,误差条表示均值±标准差(n=3);
图11中A为正常组(Control)、药物处理组(Medication)和对照组(DMSO)MDA-MB-231细胞的葡萄糖摄取实验结果,比例尺为25μm;B为正常组、药物处理组和对照组MDA-MB-231细胞的电化学检测GLUT1表达量的结果与显著性分析,0.01M PBS中,细胞浓度为10000cells/mL,ns p>0.05,(n=3);C、D分别为正常组、药物处理组和DMSO对照组MDA-MB-231细胞的2-NBDG与GLUT1的流式细胞术分析结果直方图;
图12中A为实施例6中对MDA-MB-231细胞、BSA、多巴胺、甘氨酸和葡萄糖的检测结果图,细胞浓度为10000cells/mL,多巴胺、甘氨酸和葡萄糖浓度为1mg/mL;B为传感器的抗干扰实验结果,PBS中添加BSA、多巴胺、甘氨酸和葡萄糖,多巴胺、甘氨酸和葡萄糖浓度为1mg/mL,结果为三次平行实验的统计;
图13中A为传感器一周的电化学信号的检测结果(n=3);B为传感器的复现性,五个批次的实验结果统计,结果为三次平行实验的统计;
图14中A为人肿瘤组织与正常组织免疫组化图;B为人肿瘤组织与正常组织免疫印迹结果;C为为肝癌组织、正常肝组织的差分脉冲伏安法检测结果,0.01M PBS;D为肝癌组织、正常肝组织电化学检测结果的统计(n=3);E为胰腺癌组织、正常胰腺组织的差分脉冲伏安法检测结果,0.01M PBS;F为胰腺癌组织、正常胰腺组织电化学检测结果的统计(n=3);G为胆囊癌组织、正常胆囊组织的差分脉冲伏安法检测结果,0.01M PBS;H为胆囊癌组织、正常胆囊组织电化学检测结果的统计(n=3)。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
本申请中使用的试剂及药品信息如表1所示。
本申请中使用的GLUT1的siRNA的序列为CUGUGGGCCUUUUCGUUAATT(5’-3’),如SEQID NO.1所示,阴性对照siRNA的序列为UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(5’-3’),如SEQ ID NO.2所示。
实施例1
GO-Au的制备:将3mL 0.5mg/mL的单层氧化石墨烯分散液置于5mL的烧杯中,加入200μL浓度为1%的氯金酸溶液,在加热搅拌器上搅拌并加热至沸腾。然后滴加400μL柠檬酸钠溶液(浓度为0.1M),持续加热且搅拌20min,20min后停止加热,持续搅拌直至溶液冷却到室温。将获得的GO-Au复合物13000r/min离心10min,去除上清,加入超纯水重悬,再次离心。重复3-5次,最后用超纯水重悬,避光4℃保存备用。
TBO-GO-Au的制备:将5mg TBO溶于1mL超纯水中制备成TBO溶液。取制备的GO-Au复合溶液1mL置于烧杯中,将20μL浓度为5mg/mL的TBO溶液逐步滴加到烧杯中,边加边搅拌,15300r/min离心10min,去除上清,加入超纯水重悬,再次离心。重复3-5次,最后用1mL超纯水重悬,避光4℃保存备用。
TBO-GO-Au-Ab探针的制备:取1mL上述TBO-GO-Au复合材料溶液,向其中加入15μgGLUT1抗体,室温下旋转摇床孵育4h,或者4℃旋转摇床过夜。12000r/min离心10min,去上清,加入PBS重悬,再次12000r/min离心10min。获得的抗体加入4% BSA封闭30min消除非特异结合位点,12000r/min离心10min,除去BSA,成品重新悬浮在1mL PBS缓冲液中,避光4℃保存备用。
还原氧化石墨烯-多壁碳纳米管复合材料(rGO-MWCNT)悬浮液的制备:首先制备还原氧化石墨烯(rGO),10mL超纯水,10mg氧化石墨烯(GO),超声。待GO溶解后移入搅拌水浴锅中加热至90℃,加入200μL 50%的水合肼,水浴加热搅拌2h。获得的材料12000r/min,10min离心清洗2次,除去上清,重新加入超纯水,超声分散。10mL超纯水中加入10mg多壁碳纳米管(MWCNTs),5mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)置于烧杯中,搅拌4h,再超声2h,对MWCNTs进行分散。将获得的还原氧化石墨烯溶液与多壁碳纳米管溶液体积比1:1混合在终浓度为5%的醋酸溶液中(加入少量氯化钠),在超声洗涤仪中超声2h,获得的rGO-MWCNT溶液15300r/min,离心10min,除去上清,加入超纯水重悬,再次15300r/min,离心10min。重复3-5次,用超纯水定容至10mL,4℃保存备用。
玻碳电极(GCE)的前期处理:首先对GCE进行抛光处理,去除GCE表面的氧化膜层,将氧化铝粉撒在抛光机上,对GCE进行打磨,待到完成后,将打磨好的GCE浸泡在超纯水和无水乙醇(体积比为1:1)混合液中超声洗涤2-3min,以便清除其他吸附杂质,氮气干燥后备用。
修饰GCE获得:将10μL rGO-MWCNT悬浮液直接滴加在GCE的电极表面,干燥后即完成修饰。修饰完成后,再在电极上滴加TBO-GO-Au-Ab探针,并用4%BSA进行30min的封闭,获得电化学生物传感器。
电化学生物传感器的制备与检测原理如图1所示。
TBO-GO-Au-Ab作为电化学探针用来提高电极的电化学性能,因此首先对TBO-GO-Au-Ab探针进行了表征。如图2中的A-C所示,在透射电子显微镜的观察下,可以清晰地看到TBO-GO-Au-Ab探针合成过程中各个组分的结构与形态,获得的氧化石墨烯尺寸为200nm左右。10nm左右的金纳米粒子均匀分散在氧化石墨烯的表面,这样有利于均匀的吸附抗体。以小尺寸的氧化石墨烯(GO)作为探针的支架,在其上原位生成金纳米粒子用来吸附GLUT1抗体,同时可吸附TBO作为电化学探针的信号分子。使用rGO-MWCNT纳米复合材料作为玻碳电极的修饰材料来提高电极的电化学性能。如图2中的D所示,在透射电子显微镜的观察下,可以清晰地看到rGO-MWCNT纳米复合材料的结构与形态。多壁碳纳米管均匀地分散在还原氧化石墨烯上,表现出良好的稳定结构,增加了电极表面的接触面积与导电性能。
此外,为了表征TBO-GO-Au-Ab探针的成功制备,通过紫外-可见光谱进行了验证。如图2中的E所示,图中展示了TBO-GO-Au-Ab探针各种组份的特征吸收峰,金纳米粒子(AuNPs)的特征峰在519nm左右,氧化石墨烯的特征峰在230nm左右,TBO-GO-Au复合材料在620nm及280nm左右出现了TBO的振动峰,这证实了TBO-GO-Au复合材料的修饰成功。此外,还应用红外光谱进行了验证(图2中的F)。氧化石墨烯谱中~1728cm-1和~1620cm-1处的波峰分别是C-C和C-O的拉伸振动。在~1400cm-1的Au-GO光谱中出现了一个新峰,是由柠檬酸三钠中CH2-的弯曲振动产生的,TBO在3429cm-1、1832cm-1和1756cm-1的N-H、C=N和C=S振动,这些也验证了TBO-GO-Au复合材料的成功修饰。
将rGO溶液滴加在GCE表面获得还原氧化石墨烯(rGO)修饰的玻碳电极,将MWCNT溶液滴加在GCE表面获得多壁碳纳米管(MWCNT)修饰的玻碳电极,将rGO-MWCNT悬浮液滴加在GCE表面获得还原氧化石墨烯-多壁碳纳米管纳米复合材料(rGO-MWCNT)修饰的玻碳电极进行研究。
在10mM铁氰化钾溶液中,使用循环伏安法(50mV/s,-0.1V~0.6V,工作电极:修饰或未修饰的GCE,对电极:铂丝电极,参比电极:Ag/AgCl(饱和KCl)。)对未修饰的玻碳电极,rGO修饰的玻碳电极,MWCNT修饰的玻碳电极,以及rGO-MWCNT修饰的玻碳电极进行研究。结果如图3中的A显示,四种电极都具有明显可见的氧化还原峰,且rGO-MWCNT纳修饰的玻碳电极具有更高的电化学活性,这说明合成的rGO-MWCNT纳米复合材料可以显著增强电极的导电性与灵敏度。
为研究基底材料修饰电极的动力学,分析了氧化还原电流与扫描速率之间的关系。在10mM的铁氰化钾溶液中,将rGO-MWCNT修饰的电极作为工作电极,通过扫描速率从10mV/s到200mV/s的扫描速率来检测其电化学性能(图如图3中的B所示)。结果表明氧化还原反应的峰值随着扫描速率的正相关且存在线性关系。此外,氧化峰与还原峰的位置在不断拉远。基于这些结果,分析扫描速率的平方根(v1/2)与还原峰(Ipc)和氧化峰(Ipa)值电流之间的关系进行研究并进行了线性拟合(图3中的C)。确定最终线性方程为Y=22.950X-12.720与Y=-23.529X+13.043,一系列的实验数据证明,电化学信号是扩散控制表面反应的结果。
为了验证TBO-GO-Au-Ab作为探针的可行性与基底材料的互作能力,分别利用循环伏安法和差分脉冲伏安法(-0.6V~0.1V,振幅:50mV,电位阶跃:4mV)对TBO的信号报告能力在PBS中进行了验证,结果如图4所示,TBO具有明显的信号峰,而基底材料对信号进行了放大,而当TBO不存在的情况下不会产生明显的特征峰,基于以上实验结果,选择结果区分更为明显的差分脉冲伏安法作为检测的实验方法。
实施例2
为了更好的进行细胞检测,对探针进行了优化。探针上抗体的浓度与封闭探针的BSA的浓度直接影响着构建的电化学传感平台的性能,因此,对抗体浓度与BSA浓度对TBO-GO-Au-Ab探针的影响进行了研究。在实施例1中TBO-GO-Au-Ab探针合成时使用的抗体量(抗体加入TBO-GO-Au复合材料溶液的浓度分别未5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL和20μg/mL),之后利用所构建的电化学生物传感器进行评估,得到的结果如图5中的A所示,抗体浓度为5μg/mL至15μg/mL时电流差值逐步上升,超过15μg/mL后开始下降,这可能与抗体在电极上的饱和程度有关。最终选择的浓度为15μg/mL。
接下来,对封闭用的BSA的浓度(1%-5%)对电化学生物传感器性能的影响进行研究,显示结果(图5中的B),低浓度的BSA可能导致封闭不完全,信号不稳定,而高浓度的BSA会影响信号的大小,依照实验结果分析,最终选择的封闭的BSA浓度为4%。
此外还对探针与细胞的孵育时间进行了优化探索,细胞的孵育时间也是影响电化学细胞传感器检测的一项重要条件,时间过短会导致孵育不完全,而时间太长会影响细胞活性。在0.5h-2h的时间范围内对细胞孵育时间进行了探索,结果如图5中的C所示,在0.5h到1h的时间段里,电化学信号随着孵育时间而上升,而在1h到2h的孵育时间段里,电化学信号的变化趋于平缓。基于以上实验,为了尽可能减少细胞活性丧失,决定最终的细胞孵育时间为1h。
基于本实施例的结果,后续实施例中GLUT1的电化学检测方法如下:
工作电极为实施例,对电极:铂丝电极,参比电极:Ag/AgCl(饱和KCl)。将细胞滴加在实施例1制备的电化学生物传感器上,孵育1h,然后用PBS清洗一次,在PBS(pH=7.4)中进行差分脉冲伏安法检测。电压范围-0.6V~0.1V,振幅50mV,电位阶跃4mV。工作电极为细胞孵育后的实施例1制备的电化学生物传感器,对电极为铂丝电极,参比电极为Ag/AgCl(饱和KCl)。
实施例3
为了证明构建的电化学生物传感器是评估细胞GLUT1表达量的有效传感策略,使用实施例1所构建的电化学生物传感器检测了不同细胞数量的MCF-7细胞。当细胞在电极上逐步累加,从没有细胞的空电极到细胞浓度为106cells/mL,电流峰值逐渐降低(图6中的A)。记录细胞累加浓度与电流降低变化值,依照实验结果分析细胞浓度的lg值与电流降低值的关系(图6中的B),得到的线性回归方程计算为Y=4.923X-1.728,Pearson's r为0.99。实验结果表明,所制备的电化学生物传感器可用于细胞GLUT1的检测,其检测范围浓度是10cells/mL-106cells/mL,而它的检测极限浓度是10cells/mL。
为了验证TBO-GO-Au-Ab探针的通用性能,将实施例1中的TBO-GO-Au-Ab探针与细胞进行孵育,通过免疫荧光染色对细胞进行了验证。结果如图7中的A所示,TBO-GO-Au-Ab探针可以与特异性的结合细胞上的GLUT1,并且与正常的抗体比较,使用TBO-GO-Au-Ab探针作为一抗的实验组表现出了更多的荧光,这表明TBO-GO-Au-Ab探针作为一种较为大型的探针复合物,结合了更多的荧光二抗,这符合预期,且再次验证了TBO-GO-Au-Ab探针的制备成功。此外,通过免疫印迹分析对MDA-MB-231、Hep G2、GBC-SD、MCF-7和PANC-1等细胞的GLUT1表达量进行了研究(图7中的B),并对得到的结果进行了灰度值的比较(图8中的A)。结果显示,在这五种细胞中,MDA-MB-231细胞的表达量最高,PANC-1的GLUT1表达量最低。
为了验证构建的电化学生物传感器的泛用性,使用实施例1构建的电化学生物传感器对MDA-MB-231、PANC-1、GBC-SD和Hep G2等细胞的GLUT1表达进行了分析。如图8中的B所示在细胞浓度为104cells/mL时的电化学检测结果,与MCF7细胞相比,MDA-MB-231细胞的GLUT1表达量显著上调,Hep G2细胞的表达量与MCF7相当,而GBC-SD与PANC-1的表达量较MCF7更低。这与蛋白质免疫印迹分析的结果一致,证明了所构建的电化学生物传感器的可靠性。
实施例4
为了进一步研究制备的电化学生物传感器出色的电化学性能,选择GLUT1表达最为显著的MDA-MB-231细胞进行接下来的实验。通过siRNA干扰技术构建了低表达GLUT1的MDA-MB-231细胞模型,使用GLUT1的siRNA构建的细胞模型为siRNA干扰实验组(siRNA),使用阴性对照siRNA构建的细胞模型为阴性对照组(Negative)。为了验证细胞模型的成功构建,对构建的细胞模型对葡萄糖的摄取能力进行了实验。如图9中的A所示,siRNA干扰实验组所摄取的2-NBDG很少,对葡萄糖的摄取能力较正常组显著降低,阴性对照组摄取能力相比正常组也有下降,这与实验获得的免疫印迹结果(图9中的B)和流式细胞术结果(图9中的D)相同,证明了低表达Glut1的细胞模型的成功构建。同时,对各组104cells/mL浓度下的细胞进行电化学检测,如图9中的C所示,siRNA干扰实验组的GLUT1的检测结果明显低于正常组和阴性对照组。与流式细胞术的结果(图9中的E)和免疫印迹结果(图9中的B)进行对比,发现流式细胞分析结果和免疫印迹结果与电化学检测结果保持基本一致。
为了进一步验证构建电化学生物传感器的灵敏性与实用性,利用传感器对上述构建的MDA-MB-231细胞模型与对照组细胞进行了检测,结果如图10所示,对结果进行分析拟合,计算得到的线性回归方程分别为:正常MDA-MB-231细胞组(图10中的A和D):Y=7.222X-1.372,Pearson's r=0.998;MDA-MB-231siRNA干扰实验组(图10中的B和E):Y=4.114X-0.668,Pearson's r=0.999;阴性对照组(C):Y=8.115X-3.096,Pearson's r=0.999。通过方程可以看出,siRNA干扰实验组随着细胞浓度上升,电流变化最小;同一浓度细胞,siRNA干扰实验组具有最低的电流变化。这表明构建的电化学生物传感器可有效评估细胞GLUT1蛋白表达的程度。
实施例5
利用GLUT1的抑制剂BAY-876对MDA-MB-231细胞进行处理,并通过免疫荧光与流式细胞术分析对细胞的葡萄糖摄取进行了检测。结果如图11中的A、图11中的C所示,药物处理实验组的荧光强度较对照组更低,流式细胞术结果与其一致。这表明BAY-876处理后的MDA-MB-231摄取葡萄糖的能力明显下降,GLUT1抑制剂对于MDA-MB-231肿瘤细胞有明显的抑制作用。对药物处理组进行了电化学实验(图11中的B),其电化学检测结果与正常细胞相比并无显著性差异,这可能是因为BAY-B76对GLUT1的抑制机制是破坏GLUT1的功能而不是下调GLUT1的表达,流式细胞分析的结果也验证了这一点(图11中的D),三组细胞GLUT1的表达量并无明显差距。这些实验结果再次证明了构建的传感器是评估肿瘤细胞GLUT1表达的有效手段,对于判断该肿瘤细胞是否通过GLUT1摄取葡萄糖,从而确认GLUT抑制剂类型治疗药物是否适合患者具有重要的参考价值。
实施例6
对实施例1所构建传感器的稳定性、选择性与重复性进行了实验。在PBS(pH 7.4)中,利用BSA、多巴胺、甘氨酸和葡萄糖等物质测试传感器的选择性,结果如图12中的A所示,实施例1所制备的传感器对于表达GLUT1的细胞具有很高的灵敏性,对多巴胺、甘氨酸等其他物质的灵敏度不高。在由PBS(pH 7.4)与葡萄糖、BSA等形成混合溶液中进行电化学检测来测试传感器的抗干扰性,实验结果如图12中的B所示,在各种混合溶液中对于MDA-MB-231细胞的检测结果与在纯PBS中的检测结果影响差异不大,这说明所研发的电化学生物传感器具有良好的选择性与抗干扰性。
将保存了一段时间的电化学生物传感器用于检测细胞以证明所构建的电化学生物传感器的稳定性。将制备的传感器保存在4℃,每天进行电化学信号的检测,连续测定一周的稳定性,结果显示如图13中的A所示,一周后传感器的信号为原来的84%左右,这可能是用作电极基底材料的rGO-MWCNT中的rGO逐渐被氧化,但仍然保持较好的稳定性。此外,为了测试传感器的重复性,制备了不同批次的传感器,进行电化学检测。结果如图13中的B所示,5个批次的传感器的电化学性能相差较小,这说明制备的传感器具有良好的重现性。因此,可以初步认为制作的电化学生物传感器具有较好的稳定性、出色的选择性与重复性。
实施例7
为了评估提出的电化学生物传感器检测GLUT1表达策略的实用性,对人肿瘤组织消化后获得的肿瘤细胞中GLUT1表达进行了应用。利用实施例1的电化学生物传感器对三种肿瘤组织(包括肝癌组织、胰腺癌组织与胆囊癌组织)及其所对应正常癌旁组织,共6组样本在细胞计数后(每组5000个细胞)进行了电化学检测,并进行统计分析,通过免疫组化分析和蛋白质免疫印迹分析对结果进行了验证。免疫组化的结果如图14中的A所示,三种肿瘤组织与正常组织相比GLUT1的表达量均明显上升,此外,进行分子印迹实验(图14中的B),三种肿瘤组织GLUT1的表达量高于正常组织,其结果与免疫组化实验结果一致。三组电化学检测显示肝癌组织与正常肝组织(图14总的C-D)、胰腺癌组织与正常胰腺组织(图14中的E-F)、胆囊癌组织与正常胆囊组织(图14中的G-H)的结果,三种癌组织的电化学检测结果明显高于正常组织,对电化学结果进行统计分析(图14中的D、F、H),展现的结果与预期一致,证明了制备的电化学生物传感器具有良好的实用性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用于GLUT1检测的电化学生物传感器,其特征在于,包括电极,所述电极的表面依次修饰还原氧化石墨烯-多壁碳纳米管复合材料和TBO-GO-Au-Ab探针,所述TBO-GO-Au-Ab探针由氧化石墨烯、金纳米颗粒、甲苯胺蓝O和GLUT1抗体复合组成;
所述的用于GLUT1检测的电化学生物传感器的制备方法,具体为将电极打磨、洗涤、干燥,在电极表面滴加还原氧化石墨烯-多壁碳纳米管复合材料悬浮液后干燥,再在电极表面滴加TBO-GO-Au-Ab探针悬浮液,并用BSA进行封闭;
所述还原氧化石墨烯-多壁碳纳米管复合材料悬浮液的制备方法:
将氧化石墨烯溶解于水中,与水合肼进行加热反应,产物离心洗涤后超声分散于水中获得还原氧化石墨烯溶液;
将多壁碳纳米管与聚乙烯吡咯烷酮置于水中,经搅拌、超声后获得多壁碳纳米管溶液;
将还原氧化石墨烯溶液与多壁碳纳米管溶液混合在醋酸溶液中,超声后离心,再重复进行重悬超声,最后加入超纯水获得还原氧化石墨烯-多壁碳纳米管复合材料悬浮液。
2.如权利要求1所述的电化学生物传感器,其特征在于,所述TBO-GO-Au-Ab探针中氧化石墨烯作为支架,金纳米颗粒原位生长于氧化石墨烯上,甲苯胺蓝O和GLUT1抗体吸附于金纳米颗粒上。
3.如权利要求1所述的电化学生物传感器,其特征在于,所述电极为玻碳电极。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的用于GLUT1检测的电化学生物传感器的制备方法,其特征在于,还包括TBO-GO-Au-Ab探针悬浮液的制备方法,包括以下步骤:
在单层氧化石墨烯分散液中加入氯金酸溶液,加热搅拌至沸腾后滴加柠檬酸钠溶液,持续加热且搅拌19-21 min后停止加热,搅拌至溶液冷却到室温,溶液离心后重复超纯水重悬、离心获得GO-Au,GO-Au于超纯水中重悬获得GO-Au溶液;
将甲苯胺蓝O溶液在搅拌下滴加到GO-Au溶液中,溶液离心后重复超纯水重悬、离心获得TVO-GO-Au,TBO-GO-Au于超纯水中重悬获得TBO-GO-Au溶液;
在TBO-GO-Au溶液中加入GLUT1抗体,室温下旋转摇床孵育后离心去除溶液上清,加入PBS重悬后再次离心,加入BSA封闭后离心,获得TBO-GO-Au-Ab探针,TBO-GO-Au-Ab探针重悬于PBS缓冲液中获得TBO-GO-Au-Ab探针悬浮液。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,在TBO-GO-Au溶液中加入GLUT1抗体后溶液中GLUT1抗体的浓度为5-20 μg/mL。
6.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,BSA的浓度为1%-5%。
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