CN102507694B - 一种MWNTs-IL/Cyt c/GCE的H2O2生物传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种MWNTs-IL/Cyt c/GCE的H2O2生物传感器的制备方法。将羧基化的多壁碳纳米管和氨基化的离子液体进行化学反应形成酰胺化的碳纳米管，然后将细胞色素c固定在酰胺化的碳纳米管修饰的玻碳电极上增加了它的吸附和催化活性。本发明从安培响应中可以得到过氧化氢的检测线达1.3×10-8M，MWNTs-IL/Cyt c/GCE对过氧化氢的氧化具有灵敏的响应。
Description
技术领域
本发明涉及一种MWNTs-IL/Cyt c/GCE的H2O2生物传感器的制备方法。
背景技术
近年来，将生物分子(如蛋白质和酶)吸附和固定在无机材料上研究和应用引人注意。特别是与工业无机催化剂相比，酶的专一性和反应的有效性使得酶成为较好的生物催化剂。
自从碳纳米管被发现后，由于其具有较好的生物相容性，使得它和生物体系相结合形成功能化的氢键，在生物纳米电化学中得到很好的应用。另外，功能化的碳纳米管修饰电极对许多重要涉及人类健康的生物分子有稳定的电催化响应。更有趣的是，越来越多的人将注意力集中在聚合物-酶的传感器中，其对酶的固定比较差，生物分子的检测线相对较高。因此，研制具有制备简单、响应快、重现性、稳定性好的检测H2O2传感器的方法非常重要。
发明内容
基于上述，本发明的目的在于提供一种MWNTs-IL/Cyt c/GCE来检测H2O2的氧化。
本发明的目的是这样实现的：
一种MWNTs-IL/Cyt c/GCE的H2O2生物传感器的制备方法，其步骤是：
a.称取5mg羧基化的多壁碳纳米管和10mg氨基化的离子液体，10mg二环己基碳二亚胺，10mL二甲基甲酸胺加入到圆底烧瓶中超声15分钟，然后在50℃下真空干燥24小时。将得到的产物用砂芯漏斗进行抽滤，再分别用二甲基甲酸胺，乙醇和蒸馏水冲洗，洗掉多余的离子液体和溶剂，得到的酰胺化的多壁碳纳米管(MWNT-IL)在80摄氏度下真空干燥12小时，然后把酰胺化的多壁碳纳米管分散在0.05mg/mL二次蒸无水乙醇中备用。
b.将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95％的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极；插入盛有5mL含有5mM铁氰化钾探针分子的摩尔浓度为0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、以铂为对电极、以饱和的甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极(GCE)进行表征。
c.将所述玻碳电极取出用二次蒸馏水冲洗、用洗耳球吹干后滴上5μL的MWNT-IL置于红外灯下烤干，制得MWNT-IL修饰的玻碳电极(MWNT-IL/GCE)。另外，在4℃条件下将此电极侵入到1mg/ml，pH6.98PBS细胞色素C溶液中2小时，这样细胞色素c就会固定到MWNT-IL/GCE表面，得到MWNTs-IL/Cyt c/GCE。
d.采用所述的MWNTs-IL/Cyt c/GCE为工作电极、以铂为对电极、以饱和的甘汞电极为参比电极的三电极共同插入盛有5mL含有不同浓度H2O2的0.1M磷酸盐缓冲溶液中(PBS，pH＝6.98)进行安培i-t扫描，得到不同浓度H2O2的安培i-t图；然后将MWNTs-IL/Cyt c/GCE工作电极分别换做GCE和MWNT-IL/GCE重复上述操作，得到不同的安培i-t图。
e.采用origin软件作图，分别绘制GCE和MWNT-IL/GCE在不同浓度H2O2中电流跟浓度的线性关系，MWNTs-IL/Cyt c/GCE在不同浓度H2O2中的安培i-t曲线和电流跟浓度的线性关系。
本发明优点和产生的有益效果是：
1.与传统的固定在聚合物修饰电极上相比，本发明研制的细胞色素c功能化的多壁碳纳米管修饰玻碳电极检测H2O2的生物传感器。因为细胞色素c固定在酰胺化的碳纳米管修饰电极上，既增加了它的吸附和催化活性，也不会破坏细胞色素c本身的结构与活性，并且对H2O2氧化的检测比较灵敏。
2.此生物传感器应用于对过氧化氢的氧化。用安培响应得到H2O2的检测线，其检测线比较低，检测过程简单，灵敏度高、快速简便。
附图说明
图1为本发明酰胺化的碳纳米管a，氨基化的离子液体b，多壁碳纳米管的紫外。
图2为本发明酰胺化的碳纳米管的红外吸收光谱。
图3为本发明GCE、MWNT-IL/GCE检测不同浓度的过氧化氢的浓度和电流的线性关系，其中电位为0.8V。
图4为MWNTs-IL/Cyt c/GCE检测不同浓度的过氧化氢的电流时间曲线图，及过氧化氢浓度和电流的线性关系图，其中电位为0.8V。
具体实施方式
实验过程中使用的水均为二次蒸馏水，实验所用的试剂均为分析纯，多壁碳纳米管的羧基化使用体积比为3∶1的浓盐酸和双氧水超声8个小时，然后洗至中性，70℃下烘干再使用。
本实施例所使用的仪器与试剂
CHI 660c电化学工作站(上海辰华仪器公司)用于交循环伏安的实验，石英管加热式自动双重纯水蒸馏器(1810B，上海亚太技术玻璃公司)用于蒸二次蒸馏水。电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)，用于称量药品。超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。三氧化二铝打磨粉(0.30μm，0.05μm，上海辰华仪器试剂公司)用于处理玻碳电极。饱和甘汞参比电极，铂对电极，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾(西安化学试剂厂)；多壁碳纳米管(深圳纳米港有限公司)，细胞色素C(上海源叶生物科技有限公司)；高纯氮气(纯度为99.999％(O2≤0.001％))。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
一种MWNTs-IL/Cyt c/GCE的H2O2的H2O2生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a.称取5mg羧基化的多壁碳纳米管和10mg氨基化的离子液体，10mg二环己基碳二亚胺，10mL二甲基甲酸胺加入到圆底烧瓶中超声15分钟，然后在50℃下真空干燥24小时。将得到的产物用砂芯漏斗进行抽滤，再分别用二甲基甲酸胺，乙醇和蒸馏水冲洗，洗掉多余的离子液体和溶剂，得到的酰胺化的多壁碳纳米管(MWNT-IL)在80摄氏度下真空干燥12小时。将酰胺化的碳纳米管、氨基化的离子液体、多壁碳纳米管进行紫外表征，从图1中可以看出，在浓度为0.01M、pH为6.98缓冲溶液(PBS)中，氨基化的离子液体(IL)在230nm(曲线b)有一个最大吸收峰，而酰胺化的碳纳米管(MWNTs-IL)在206nm(曲线a)有明显的蓝移，MWNTs(曲线c)在201处出现最大吸收峰，就表明形成了酰胺化的碳纳米管。再将酰胺化的碳纳米管进一步用红外吸收光谱进行测定，一般而言羰基在1709和1561cm-1处有吸收峰。如图2，羰基在1709cm-1处的吸收峰移到1646cm-1，表明有氨基的形成，另外，在1456cm-1处有较强的吸收峰，进一步说明羧基化的碳纳米管与氨基化的离子液体之间形成了酰胺键。最后把酰胺化的多壁碳纳米管分散在二次蒸无水乙醇中备用(0.05mg/mL)。
b.将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95％的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极；插入盛有5mL含有5mM铁氰化钾探针分子的摩尔浓度为0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、以铂为对电极、以饱和的甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极(GCE)进行表征。
c.将所述玻碳电极取出用二次蒸馏水冲洗、用洗耳球吹干后滴上5μL的MWNT-IL置于红外灯下烤干，制得MWNT-IL修饰的玻碳电极(MWNT-IL/GCE)。另外，在4℃条件下将此电极侵入到1mg/ml，pH6.98PBS细胞色素C溶液中2小时，这样细胞色素c就会固定到MWNT-IL/GCE表面，得到MWNTs-IL/Cyt c/GCE。
d.采用所述的MWNTs-IL/Cyt c/GCE为工作电极、以铂为对电极、以饱和的甘汞电极为参比电极的三电极共同插入盛有5mL含有不同浓度H2O2的0.1M磷酸盐缓冲溶液中(PBS，pH＝6.98)进行安培i-t扫描，得到不同浓度H2O2的安培i-t图；然后将MWNTs-IL/Cyt c/GCE工作电极分别换做GCE和MWNT-IL/GCE重复以上操作，得到不同的安培i-t。
e.采用origin软件作图，分别绘制GCE和MWNT-IL/GCE在不同浓度H2O2中电流跟浓度的线性关系，MWNTs-IL/Cyt c/GCE在不同浓度H2O2中的安培i-t曲线和电流跟浓度的线性关系。图3A为GCE在不同浓度H2O2中，H2O2浓度与电流的线性关系，其检测线范围为4-100μM；图3B为MWNT-IL/GCE在不同浓度H2O2中，H2O2浓度与电流的线性关系，其检测线范围为4-700μM。MWNTs-IL/Cyt c/GCE在不同浓度H2O2中的安培i-t曲线在图4中表示，其中插图为H2O2浓度与电流的线性关系，H2O2的检测线范围为0.04-100μM。MWNTs-IL/Cyt c/GCE与GCE和MWNT-IL/GCE相比，检测范围扩大，检测线低，检测过程简单，灵敏度高、快速简便。
(3)、修饰电极的处理
检测完毕后，将碳纳米管修饰电极、酰胺化碳纳米管修饰电极电化学检测池中取出，在二次蒸馏水中超声1分钟，电极表面碳纳米管和酰胺化的碳纳米管可以完全脱落。
Claims (1)
1.一种MWNTs-IL/Cyt c/GCE的H2O2生物传感器的制备方法，其步骤是：
a.称取5mg羧基化的多壁碳纳米管和10mg氨基化的离子液体、10mg二环己基碳二亚胺和10mL二甲基甲酸胺加入到圆底烧瓶中超声15分钟，然后在50℃下真空干燥24小时；将得到的产物用砂芯漏斗进行抽滤，再分别用二甲基甲酸胺，乙醇和蒸馏水冲洗，洗掉多余的离子液体和溶剂，得到的酰胺化的多壁碳纳米管，在80摄氏度下真空干燥12小时，然后把酰胺化的多壁碳纳米管分散在0.05mg/mL的二次蒸无水乙醇中备用；
b.将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95％的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极；插入盛有5mL含有5mM铁氰化钾探针分子的摩尔浓度为0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、以铂为对电极、以饱和甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极进行表征；
c.将所述玻碳电极取出用二次蒸馏水冲洗、用洗耳球吹干后滴上5μL的MWNTs-IL置于红外灯下烤干，制得MWNTs-IL修饰的玻碳电极；另外，在4℃条件下将MWNTs-IL修饰的玻碳电极浸入到1mg/ml，pH6.98磷酸盐缓冲溶液的细胞色素c溶液中2小时，这样细胞色素c就会固定到MWNTs-IL/GCE表面，得到MWNTs-IL/Cyt c/GCE；
d.采用所述的MWNTs-IL/Cyt c/GCE为工作电极、以铂为对电极、以饱和甘汞电极为参比电极的三电极共同插入盛有5mL含有不同浓度H2O2的pH＝6.98、0.1M磷酸盐缓冲溶液中进行安培i-t扫描，得到不同浓度H2O2的安培i-t图；然后将MWNTs-IL/Cyt c/GCE工作电极分别换做GCE和MWNTs-IL/GCE重复上述操作，得到不同的安培i-t图；
e.采用origin软件作图，分别绘制GCE和MWNTs-IL/GCE在不同浓度H2O2中电流跟浓度的线性关系，MWNTs-IL/Cyt c/GCE在不同浓度H2O2中的安培i-t曲线和电流跟浓度的线性关系。
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