CN103267788B - 基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极制备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极的制备方法，该方法将碳糊电极作为基体电极，然后使用滴涂的方法对其进行修饰，利用金属掺杂炭气凝胶的吸附性能将肌红蛋白、离子液体层层固定在碳糊电极的表面，最后使用冷干燥得到稳定的基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极。其制作方法简单，可以直接检测过氧化氢，具有灵敏度高，稳定性强和检测限低的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学生物传感器，具体地说是一种基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极制备方法，该方法制得的基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极可用于过氧化氢的检测。
背景技术
生物传感器是由固定化的生物敏感材料作为识别元件（包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性组织）与适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等）及信号放大装置构成的分析工具或系统，具有接受器与转换器的功能。由于这类传感器响应快、灵敏度高、制作简单而被广泛应用和研究。
金属（metal M）微粒往往比本体金属呈现出更高的活性，特别是催化活性，将金属微粒修饰到电极表面在传感领域引起了极大的关注。炭气凝胶（carbon aerogels，CA）作为具有导电性的气凝胶，具有孔隙率高、孔隙尺寸小、比表面积大、电导率高、孔径大小及分布可控等特点。将金属与炭气凝胶复合，既发挥了金属微粒的催化性能又利用了炭气凝胶的优良性质，是电化学传感器的研究热点。
离子液体（Ionic liquid，IL）作为绿色替代溶剂，在电化学中的应用涉及电催化、电镀、电池、有机电合成和电容技术等。与传统的有机溶剂和电解质相比较，离子液体具有熔点低、液态温度范围宽、可忽略的蒸汽压、较高的热稳定性、较好的化学稳定性和宽的电化学窗口等。
肌红蛋白（myoglobin，Mb）位于肌肉的及细胞中，其功能是可逆地结合氧气，将氧气贮存在肌肉细胞中，从结构上来看，Mb以血红素作为活性中心，与一些以血红素为辅基的酶（如辣根过氧化物酶、细胞色素等）的结构相似，含有一个供底物结合的空缺配位点。因此Mb常作为研究酶结构与功能关系的模型化合物。Mb表现出的生理功能及参与的代谢过程，大多数涉及电子转移过程。因此常用电化学方法研究Mb的氧化还原反应及类酶性质。同时，Mb由于相对易得，是研究血红素蛋白质和酶的电子传递反应的理想模型物；但由于Mb与固体电极之间的直接电子转移速率较缓慢，不得不借助于媒介体或促进剂进行研究。
过氧化氢（H2O2）在食品工业、临床应用、环境分析等领域有着广泛的应用。同时，它也是包括葡萄糖氧化酶、尿酸酶、胆固醇氧化酶、醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、半乳糖氧化酶以及L-氨基酸氧化酶等在内的一系列酶促反应的重要副产物。因此，发展可靠、灵敏、快速、低成本的H2O2检测方法具有重要意义。目前，H2O2检测方法包括滴定法、光谱法、荧光法、化学发光法、色谱法及电化学法。其中电化学法，尤其是基于各种过氧化物酶和血红蛋白的电流型生物传感器研究最为广泛，该方法检测H2O2具有简单、方便、成本低和速度快等优点，受到了广泛关注。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极的制作方法，该方法制作的金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极具有测试稳定性好、灵敏度高等特点，可用于快速的检测过氧化氢。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极制备方法，其特征在于，由下列步骤组成：
步骤一，将质量比为17:3的石墨粉和液体石蜡混匀成碳糊，将碳糊压入中性笔管中，然后在中性笔管的另一端插入用于导电的铜丝，该铜丝一端露出中性笔管之外，即为碳糊电极；
步骤二，在碳糊电极表面滴涂一层肌红蛋白溶液，该肌红蛋白溶液的浓度为5mg/mL，滴涂量为5μL，在冰箱中进行冷干燥，干燥时间为3h，得到带有肌红蛋白修饰的碳糊电极；
步骤三，在带有肌红蛋白修饰的碳糊电极表面，滴涂一层悬浮液，该悬浮液的滴涂量为10μL，悬浮液滴涂后在冰箱中进行冷干燥，干燥时间为5h；
所述的悬浮液的制备方法是：
将5mg的金属掺杂炭气凝胶粉末和10μL的[BMIM]BF4离子液体混合在1mL的磷酸盐缓冲溶液中，超声30min分散均匀，即形成悬浮液；
步骤四，待滴涂的悬浮液干燥后，用二次蒸馏水将带有肌红蛋白修饰的碳糊电极表面浸洗2-3次，除去未固定的蛋白质，即得到基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极（M-CA/IL/Mb-CPE）。
经申请人的实验表明，采用本发明的方法制备的金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体（M-CA/IL/Mb-CPE）修饰电极，可用于H2O2的检测，其响应时间短、灵敏度高，对H2O2的检测线性范围为10μM～265μM，且可重复使用，即当该修金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体（M-CA/IL/Mb-CPE）修饰电极不使用或测试结束后，均浸没在磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.0浓度为0.10M）中，4℃冰箱中保存。
附图说明
图1是不同金属（M=Ni，Pd）掺杂炭气凝胶（M-CA）的修饰电极在浓度为0.10M、pH7.0的PBS溶液中循环伏安曲线图，其中（a）为Mb-CPE电极曲线，（b）为Ni-CA/IL/Mb-CPE电极曲线，（c）为Pd-CA/IL/Mb-CPE电极曲线；
图2是不同电极在浓度为0.10M、pH7.0的PBS溶液中循环伏安曲线，其中（a）为Mb-CPE电极曲线，（b）为IL/Mb-CPE电极曲线，（c）Cu-CA/IL/Mb-CPE电极曲线；
图3是不同电极在5.0mM K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6+0.1M KCl溶液中的循环伏安曲线，其中（a）为CPE电极曲线，（b）为Cu-CA/IL-CPE电极曲线，（c）为Cu-CA/IL/Mb-CPE电极曲线；
图4是在浓度为0.1M、pH7.0的PBS溶液中Cu掺杂CA/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极（Cu-CA/IL/Mb-CPE）在不同扫描速率下循环伏安曲线；
图5是图4条件下Mb氧化还原峰电流与扫描速率的关系；
图6是修饰电极Cu-CA/IL/Mb-CPE对H2O2的i-t图。
为了更清楚地说明本发明的内容，下面结合附图和具体的实施例对发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
本实施例给出一种基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极制备方法，由下列步骤组成：
将质量比为17:3的石墨粉和液体石蜡混匀成糊状，将碳糊压入中性笔管中，然后在中性笔管的另一端插入用于导电的铜丝，该铜丝一端露出中性笔管之外，即为碳糊电极（以下简称CPE电极）；
本实施例中，中性笔管选用内径为3mm废旧的中性笔管，将其裁成长约4cm左右，并将管口一端在砂纸上打磨平滑。
在CPE电极表面滴涂一层肌红蛋白（Mb）溶液，该肌红蛋白（Mb）溶液的浓度为5mg/mL，滴涂量为5μL，在冰箱中进行冷干燥，干燥时间为3h，得到带有肌红蛋白修饰的碳糊电极（以下简称Mb-CPE电极）；
在Mb-CPE电极表面，滴涂一层悬浮液，该悬浮液的滴涂量为10μL，悬浮液滴涂后在冰箱中进行冷干燥，干燥时间为5h；
悬浮液的制备方法是：
将5mg的金属掺杂炭气凝胶（M-CA）粉末和10μL的[BMIM]BF4离子液体（IL）混合在1mL浓度为0.10M、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，超声30min分散均匀，形成悬浮液；
待待滴涂的悬浮液干燥后，用二次蒸馏水将带有肌红蛋白修饰的碳糊电极表面浸洗2-3次，除去未固定的蛋白质，即得到基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极（以下简称M-CA/IL/Mb-CPE电极）。
使用时，M-CA/IL/Mb-CPE电极需要在称量纸上打磨光滑。当（M-CA/IL/Mb-CPE电极不使用或测试结束后，均浸没在磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.0浓度为0.10M）中，4℃冰箱中保存。
本实施例中所使用的仪器和原料：
CHI832电化学工作站（上海辰华仪器公司）、电子分析天平（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）、pH计（北京大学化学系）、超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、石墨粉（国药集团化学试剂有限公司，光谱纯）、液体石蜡（天津化学试剂有限公司，化学纯）、30%过氧化氢（郑州派尼化学试剂厂，分析纯）、肌红蛋白（Myoglobin Mb上海酶联生物科技有限公司）、磷酸二氢钾（郑州派尼化学试剂厂）、磷酸氢二钾（西安化学试剂厂）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体（[BMIM]BF4，IL，中科院兰州化学物理研究所）。测定时所用底液浓度为0.10M的PBS缓冲溶液，由0.10M的K2HPO4和KH2PO4储备液配制而成，其pH通过0.10M的H3PO4和NaOH溶液调节。所用水为二次蒸馏水。
实施例1：
图1为不同金属（M=Ni，Pd）掺杂炭气凝胶（M-CA）的修饰电极在浓度为0.1M、pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中的循环伏安曲线。从图中可以看出，Mb-CPE电极在扫描范围内无氧化还原峰出现，说明在Mb-CPE电极表面未发生氧化还原反应，也说明Mb在CPE电极表面氧化还原反应很难进行（曲线a）。但是，随着金属掺杂炭气凝胶（M-CA）和离子液体（IL）材料的修饰，Ni-CA/IL/Mb-CPE及Pd-CA/IL/Mb-CPE电极分别出现了一对明显的氧化还原峰，说明IL和M-CA的材料的修饰加速了Mb的氧化还原（曲线b，c），△Ep分别为0.138V、0.145V，表明反应是一个准可逆过程。
实施例2：
图2是不同电极在浓度为0.10M、pH7.0的PBS溶液中的循环伏安曲线，其中（a）Mb-CPE电极，（b）IL/Mb-CPE电极，（c）Cu-CA/IL/Mb-CPE电极；同样如图1所述，曲线（a）表明Mb-CPE电极表面没有发生氧化还原反应，说明Mb在CPE电极表面很难发生氧化还原反应。在曲线（b）有一对小的不可逆的氧化还原峰，这说明Mb在IL-CPE电极表面电子转移速率略有升高，这是因为水溶性的离子液体[BMIm]BF4的在电极表面形成了一层具有电化学活性的分子膜，一定程度上促进了电极表面电子的传递。曲线（c）的电化学响应明显加强，出现了一对峰形良好的氧化还原峰。这可能因为水溶性[BMIm]BF4与Cu-CA在电极表面形成了一层均匀的膜，[BMIm]BF4提高了膜的稳定性和导电性，Cu-CA不仅导电性能优越，而且优化了Mb在电极表面的空间构象，促进了电子传递。曲线（c）的△Ep=0.110V表明Cu-CA/IL/Mb-CPE修饰电极也是一个准可逆过程。
实施例3：
图3是K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6在碳糊电极（CPE）及修饰电极的循环伏安图。曲线a表明CPE的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6氧化还原峰峰电位差△Ep较大，峰电流较小，电极过程不可逆；在Cu-CA/IL-CPE上（曲线b），氧化还原峰电流明显增大，△Ep减小为0.186V，电极过程为准可逆，表明Cu-CA/IL可以加速铁氰化钾的电子转移。而在其上继续修饰Mb后（曲线c），氧化峰及还原峰电流均明显降低，表明Mb膜阻碍了铁氰化钾的电子转移，也表明Mb成功修饰到基体电极表面。
实施例4：
图4是考察了Cu掺杂CA/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极（Cu-CA/IL/Mb-CPE）扫描速度与峰电流之间的关系，从图中可知随着扫描速度的增加，氧化还原峰电流也在不断地增加，在40-1000mV·s-1范围内，随着扫描速度的增加，还原峰电位负移，氧化峰电位正移。随着扫速的增加，氧化还原峰电流均与扫描速度呈线性关系，如图5所示，还原峰Epc和氧化峰Epa与扫描速度v之间呈良好的线性关系，表明在40-1000mV·s-1的扫速范围内电极反应为吸附控制过程，说明电极反应主要受表面控制，即为薄层电化学行为。其线性回归方程分别为：还原峰：ipc(μA)=13.31+94.09v（R=0.9947）；氧化峰：ipa(μA)=-3.94-116.42v（R=0.9978）。
实施例5：
图6是修饰电极Cu-CA/IL/Mb-CPE对H2O2的i-t图。使用电化学工作站对H2O2在修饰电极Cu-CA/IL/Mb-CPE上的催化性能进行了研究。实验采用三电极体系，饱和甘汞电极做参比，Pt电极为对电极，Cu-CA/IL/Mb-CPE修饰电极作为工作电极。采用计时电流法考察了Cu-CA/IL/Mb-CPE修饰电极对底物H2O2的电化学催化行为，选择工作电压为-0.35V，待背景电流稳定后，连续向浓度为0.10M、pH7.0的PBS底液中添加H2O2溶液，测试结果表明，电流随着过氧化氢（H2O2）浓度的增大而增大，并且响应时间短，均在5s内达到稳定，同时也说明修饰电极Cu-CA/IL/Mb-CPE对H2O2的还原有良好的电催化作用。实验结果表明，固定在Cu-CA/[BMIM]BF4复合材料中的Mb不仅可以进行有效的电子转移，而且还保持其对H2O2还原的生物电催化活性。
实验中响应电流（Iss）与H2O2浓度（c）在10μM～265μM范围内呈良好的线性关系，满足线性回归方程Iss(μA)=0.0089c(μM)+0.963，相关系数R为0.9987。以3倍信噪比计算，可得该修饰电极Cu-CA/IL/Mb-CPE对H2O2的检出限为3.5μM。
Claims (3)
1.一种基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极制备方法，其特征在于，由下列步骤组成：
步骤一，将质量比为17:3的石墨粉和液体石蜡混匀成碳糊，将碳糊压入中性笔管中，然后在中性笔管的另一端插入用于导电的铜丝，该铜丝一端露出中性笔管之外，即为碳糊电极；
步骤二，在碳糊电极表面滴涂一层肌红蛋白溶液，该肌红蛋白溶液的浓度为5mg/mL，滴涂量为5μL，在冰箱中进行冷干燥，干燥时间为3h，得到带有肌红蛋白修饰的碳糊电极；
步骤三，在带有肌红蛋白修饰的碳糊电极表面，滴涂一层悬浮液，该悬浮液的滴涂量为10μL，悬浮液滴涂后在冰箱中进行冷干燥，干燥时间为5h；
所述的悬浮液的制备方法是：
将5mg的金属掺杂炭气凝胶粉末和10μL的[BMIM]BF4离子液体混合在1mL的磷酸盐缓冲溶液中，超声30min分散均匀，即形成悬浮液；
步骤四，待滴涂的悬浮液干燥后，用二次蒸馏水将步骤三获得的电极表面浸洗2-3次，除去未固定的蛋白质，即得到基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极；
所述的金属掺杂炭气凝胶中的掺杂金属为Ni、Pd或Cu。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的中性笔管选用内径为3mm废旧的中性笔管，长4cm，并将管口一端在砂纸上打磨平滑。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的pH＝7.0，浓度为0.10M。
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