CN104049011B - 一种电化学生物传感器，其制备方法，用途以及检测血小板源生长因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种电化学生物传感器，其制备方法，用途以及检测血小板源生长因子的方法，包括如下步骤：(1)将DNA序列溶解在PBS缓冲溶液中；(2)将含碳纳米管的乙醇溶液滴涂到玻碳电极上，室温自然晾干；(3)将含细胞色素c的缓冲溶液滴涂到有碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干；(4)将含适配体的缓冲溶液滴涂到已修饰细胞色素c和碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干；(5)将修饰的电极放入到缓冲溶液中培养，利用DNA之间的碱基互补配对作用将适配体剥夺下来；(6)得到基于细胞色素c构成的无标记适配体对血小板源生长因子检测的电化学生物传感器。使用碳纳米管，利用细胞色素c的直接电子转移，利用DNA序列之间碱基的互补配对作用，制备出基于适配体，细胞色素c与碳纳米管构成的层状结构电化学生物传感器，此传感器实现了对目标DNA分子灵敏性、特异性、稳定性的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及用DNA适配体细胞色素c和碳纳米管构成的层状结构的电化学生物传感器及其应用于目标DNA分子的检测，具体涉及一种电化学生物传感器，其制备方法，用途以及检测血小板源生长因子的方法。
背景技术
21世纪是生命科学的世纪，对DNA的研究是生命科学研究中的一个极其重要的方面，DNA生物传感器的研究已成热点。有很多与此相关的研究致力于用纳米粒子改变DNA生物传感器的测定信号。其中有趣的是发现碳纳米管，其有良好的化学稳定性,优良的电导率和高电化学表面积。且细胞色素c和纳米粒子的组合有着功能性和操作简单的优势，具有高均匀性和组织的优势,还提供一个令人满意的微环境来促进来自电极和蛋白质的直接电子转移。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电化学生物传感器，其制备方法，用途以及检测血小板源生长因子的方法，提供一种合成简单，耗能低，成本低，生物相容性好的电化学生物传感器的制备方法并实现对目标DNA分子灵敏性、特异性、稳定性的检测。具体技术方案如下：
一种电化学生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)将DNA序列溶解在PBS缓冲溶液中；
(2)将含碳纳米管的乙醇溶液滴涂到玻碳电极上，室温自然晾干；
(3)将含细胞色素c的缓冲溶液滴涂到有碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干；
(4)将含适配体的缓冲溶液滴涂到已修饰细胞色素c和碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干；
(5)将修饰的电极放入到缓冲溶液中培养，利用DNA之间的碱基互补配对作用将适配体剥夺下来；
(6)得到基于细胞色素c构成的无标记适配体对血小板源生长因子检测的电化学生物传感器。
进一步地，步骤(1)中，DNA序列：适配体：aptamer、目标DNA：PDGF-BB，分别溶解在pH7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，并在低温下下保存备用。
进一步地，步骤(1)和(2)之间还包括步骤：对玻碳电极进行抛光和清洗。
进一步地，将玻碳电极先依次用0.3和0.05μm的铝粉进行抛光处理，再依次放入HNO3:H2O(v/v)＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。
进一步地，步骤(5)中所述缓冲溶液含有一定浓度的PDGF-BB，培养时间2h。
进一步地，所述低温为4℃。
一种电化学生物传感器，采用上述的方法制备得到。
上述电化学生物传感器的用途，用于检测血小板源生长因子。
上述电化学生物传感器检测的方法，PDGF-BB的浓度不同，组装适配体被剥夺的量不同因而细胞色素c传递电子的量也不同，随着PDGF-BB浓度的增加，裸露细胞色素c的量随之增加，即可对不同浓度目标DNA PDGF-BB进行定量检测。
进一步地，在检测之前，首先在玻碳电极的表面组装电化学生物传感器。
与目前现有技术相比，本发明提供了适配体，细胞色素c与碳纳米管构成的层状结构组装的电化学生物传感器及其应用于目标DNA分子的检测，本发明使用碳纳米管，利用细胞色素c的直接电子转移，利用DNA序列之间碱基的互补配对作用，制备出基于适配体，细胞色素c与碳纳米管构成的层状结构电化学生物传感器，此传感器实现了对目标DNA分子灵敏性、特异性、稳定性的检测。
具体来说，本生物传感器的制备方法，使用的纳米材料合成简单，耗能低，成本低，生物相容性好，且制备的生物传感器检测以细胞色素c的直接电子转移得到电化学检测的信号的改变，通过目标DNA分子与DNA-细胞色素c碳纳米管生物复合物中的DNA之间的碱基互补作用，能够制备出简单层状结构的传感器，能够将具有直接电子转移能力的细胞色素c复合组装到传感器上，因此可实现对目标DNA分子的检测，结果显示此生物传感器对目标DNA分子的检测结果令人满意，检测的线性范围较宽，约从10-13M到10-10M范围内有较灵敏的检测，且具有灵敏度高、检测限低、选择性好、稳定性好的特点。另外，本电化学生物传感器是利用DNA之间的碱基互补配对作用检测目标分子，将DNA适配体细胞色素c与碳纳米管连接构成层状结构，并将此层状结构组装在电极上而形成的。电化学生物传感器制备成功。鉴于此，我们可以利用其他的适配体，将适配体细胞色素c碳纳米管生物复合物形成层状结构而组装成电化学生物传感器，实现对特定DNA的检测。
附图说明
图1为每一步电极修饰过程的扫描电镜图。
图中：
A为修饰碳纳米管后电极表面扫描电镜图。
B为修饰细胞色素c在碳纳米管表面后的扫描电镜图。
C为修饰适配体在细胞色素c表面后的扫描电镜图。
D为电极放入一定浓度PDGF-BB溶液2h后扫描电镜图。
C、D图右上角为其高分辨率扫描电镜图。
图2为每一步电极修饰过程电极的阻抗图。
图中：
a为裸的玻碳电极的阻抗图。
b为碳纳米管修饰的玻碳电极的阻抗图。
c为细胞色素c修饰的碳纳米管玻碳电极的阻抗图。
d为适配体修饰的细胞色素c碳纳米管玻碳电极的阻抗图。
e为修饰电极放入一定浓度的PDGF-BB溶液后阻抗图。
图3为基于适配体，细胞色素c与碳纳米管构成的层状结构组装的电化学生物传感器制备过程及对不同浓度PDGF-BB检测的循环伏安图。
图中：
a为细胞色素c修饰的碳纳米管玻碳电极的循环伏安图。
b为修饰电极放入100pM的PDGF-BB溶液后的循环伏安图。
c为修饰电极放入20pM的PDGF-BB溶液后的循环伏安图。
d为修饰电极放入2pM的PDGF-BB溶液后的循环伏安图。
e为适配体修饰的细胞色素c碳纳米管玻碳电极的循环伏安图。
f为碳纳米管修饰的玻碳电极的循环伏安图。
g为裸的玻碳电极的循环伏安图。
图4(A)为为基于适配体，细胞色素c与碳纳米管构成的层状结构组装的电化学生物传感器对不同浓度目标DNA分子PDGF-BB的微分脉冲伏安法谱图。
图4(B)为为基于适配体，细胞色素c与碳纳米管构成的层状结构组装的电化学生物传感器不同浓度目标DNA分子PDGF-BB检测的标准曲线。
图4(C)为为基于适配体，细胞色素c与碳纳米管构成的层状结构组装的电化学生物传感对目标DNA分子PDGF-BB的选择性。
图5为基于细胞色素c构成的无标记适配体对血小板源生长因子检测的电化学生物传感器的制备方法步骤示意图。
具体实施方式
下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。
实施例一：
基于适配体，细胞色素c与碳纳米管构成的层状结构组装的电化学生物传感器制备及应用的步骤如下：
a、将购买的DNA序列(适配体：aptamer、目标DNA：PDGF-BB)分别溶解在0.1M PBS(pH7.4)缓冲溶液中，并在低温下下保存备用。
b、将玻碳电极先依次用0.3和0.05μm的铝粉进行抛光处理，再依次放入HNO3:H2O(v/v)＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。
c、将含碳纳米管的乙醇溶液滴涂到表面处理干净的玻碳电极上，室温自然晾干。再将含细胞色素c的缓冲溶液滴涂到有碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干。此后，将含适配体的缓冲溶液滴涂到已修饰细胞色素c和碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干。
d、将修饰的电极放入到含有一定浓度的PDGF-BB缓冲溶液中培养2h，利用DNA之间的碱基互补配对作用将适配体剥夺下来，基于细胞色素c构成的无标记适配体对血小板源生长因子检测的电化学生物传感器制备成功。
e、由于PDGF-BB的浓度不同，组装适配体被剥夺的量不同因而细胞色素c传递电子的量也会不同，随着PDGF-BB浓度的增加，裸露细胞色素c的量也会随之增加，因此此传感器可对不同浓度目标DNA PDGF-BB进行定量检测。
实施例二：
基于适配体，细胞色素c与碳纳米管构成的层状结构组装的电化学生物传感器制备及应用的步骤如下：
a、将购买的DNA序列(适配体：aptamer、目标DNA：PDGF-BB)分别溶解在0.1M PBS(pH7.4)缓冲溶液中，并在低温下下保存备用。
b、将玻碳电极先依次用0.3和0.05μm的铝粉进行抛光处理，再依次放入HNO3:H2O(v/v)＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。
c、将含碳纳米管的乙醇溶液滴涂到表面处理干净的玻碳电极上，室温自然晾干。再将含细胞色素c的缓冲溶液滴涂到有碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干。此后，将含适配体的缓冲溶液滴涂到已修饰细胞色素c和碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干。
d、将修饰的电极放入到含有一定浓度的PDGF-BB缓冲溶液中培养2h，利用DNA之间的碱基互补配对作用将适配体剥夺下来，基于细胞色素c构成的无标记适配体对血小板源生长因子检测的电化学生物传感器制备成功。
e、由于PDGF-BB的浓度不同，组装适配体被剥夺的量不同因而细胞色素c传递电子的量也会不同，随着PDGF-BB浓度的增加，裸露细胞色素c的量也会随之增加，因此此传感器可对不同浓度目标DNA PDGF-BB进行定量检测。
实施例三：
基于适配体，细胞色素c与碳纳米管构成的层状结构组装的电化学生物传感器制备及应用的步骤如下：
a、将购买的DNA序列(适配体：aptamer、目标DNA：PDGF-BB)分别溶解在0.1M PBS(pH7.4)缓冲溶液中，并在低温下下保存备用。
b、将玻碳电极先依次用0.3和0.05μm的铝粉进行抛光处理，再依次放入HNO3:H2O(v/v)＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。
c、将含碳纳米管的乙醇溶液滴涂到表面处理干净的玻碳电极上，室温自然晾干。再将含细胞色素c的缓冲溶液滴涂到有碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干。此后，将含适配体的缓冲溶液滴涂到已修饰细胞色素c和碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干。
d、将修饰的电极放入到含有一定浓度的PDGF-BB缓冲溶液中培养2h，利用DNA之间的碱基互补配对作用将适配体剥夺下来，基于细胞色素c构成的无标记适配体对血小板源生长因子检测的电化学生物传感器制备成功。
e、由于PDGF-BB的浓度不同，组装适配体被剥夺的量不同因而细胞色素c传递电子的量也会不同，随着PDGF-BB浓度的增加，裸露细胞色素c的量也会随之增加，因此此传感器可对不同浓度目标DNA PDGF-BB进行定量检测。
实施例四：
适配体，细胞色素c和碳纳米管构成的层状结构的制备方法，在玻碳电极的表面组装电化学生物传感器，利用目标DNA分子与层状结构中DNA适配体的碱基互补作用，应用于目标DNA分子的检测。步骤如下：
a、将购买的DNA序列(适配体：aptamer、目标DNA：PDGF-BB)分别溶解在0.1M PBS(pH7.4)缓冲溶液中，并在低温下下保存备用。
b、将玻碳电极先依次用0.3和0.05μm的铝粉进行抛光处理，再依次放入HNO3:H2O(v/v)＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。
c、将含碳纳米管的乙醇溶液滴涂到表面处理干净的玻碳电极上，室温自然晾干。再将含细胞色素c的缓冲溶液滴涂到有碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干。此后，将含适配体的缓冲溶液滴涂到已修饰细胞色素c和碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干。
d、将修饰的电极放入到含有一定浓度的PDGF-BB缓冲溶液中培养2h，利用DNA之间的碱基互补配对作用将适配体剥夺下来，基于细胞色素c构成的无标记适配体对血小板源生长因子检测的电化学生物传感器制备成功。
e、由于PDGF-BB的浓度不同，组装适配体被剥夺的量不同因而细胞色素c传递电子的量也会不同，随着PDGF-BB浓度的增加，裸露细胞色素c的量也会随之增加，因此此传感器可对不同浓度目标DNA PDGF-BB进行定量检测。
实施例五：
提供一种基于适配体，细胞色素c与碳纳米管构成的层状结构电化学生物传感器，其制备方法以及用途，利用目标DNA分子与适配体的碱基互补作用，在玻碳电极的表面组装电化学生物传感器，应用于目标DNA分子的检测。一种基于细胞色素c构成的无标记适配体对血小板源生长因子检测的电化学生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)DNA序列：适配体：aptamer、目标DNA：PDGF-BB,分别溶解在缓冲溶液中，并保存备用；
(2)将含碳纳米管的乙醇溶液滴涂到玻碳电极上，室温自然晾干；
(3)将含细胞色素c的缓冲溶液滴涂到有碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干；
(4)将含适配体的缓冲溶液滴涂到已修饰细胞色素c和碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干；
(5)将修饰的电极放入到含有一定浓度的PDGF-BB缓冲溶液中培养，利用DNA之间的碱基互补配对作用将适配体剥夺下来，基于细胞色素c构成的无标记适配体对血小板源生长因子检测的电化学生物传感器制备成功。
步骤(1)中，将DNA序列分别溶解在0.1M PBS(pH7.4)缓冲溶液中，并在4℃下保存备用。步骤(2)中所述玻碳电极在步骤(2)之前进行抛光和清洗。所述抛光和清洗包括如下步骤：将玻碳电极先依次用0.3和0.05μm的铝粉进行抛光处理；依次放入HNO3:H2O(v/v)＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。步骤(5)中培养2h,利用DNA之间的碱基互补配对作用，PDGF-BB将其适配体从细胞色素c上剥夺下来。
上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述电化学生物传感器为基于细胞色素c构成的无标记适配体对血小板源生长因子检测的电化学生物传感器，包括如下步骤：
(1)将适配体：aptamer、目标DNA：PDGF-BB溶解在pH7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，并在低温下保存备用；
(2)将含碳纳米管的乙醇溶液滴涂到玻碳电极上，室温自然晾干；
(3)将含细胞色素c的缓冲溶液滴涂到有碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干；
(4)将步骤(1)所得溶液滴涂到已修饰细胞色素c和碳纳米管的玻碳电极上，室温自然晾干；
(5)将修饰的电极放入到含有一定浓度的PDGF-BB缓冲溶液中培养2h，利用DNA之间的碱基互补配对作用将适配体剥夺下来，得到基于细胞色素c构成的无标记适配体对目标物为血小板源生长因子检测的电化学生物传感器。
2.如权利要求1所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)之间还包括步骤：对玻碳电极进行抛光和清洗。
3.如权利要求2所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，将玻碳电极先依次用0.3和0.05μm的铝粉进行抛光处理，再依次放入HNO3:H2O(v/v)＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。
4.如权利要求1所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述低温为4℃。
5.一种电化学生物传感器，其特征在于，采用如权利要求1-4中任一项所述的方法制备得到。
6.一种如权利要求5所述电化学生物传感器的用途，其特征在于，用于检测血小板源生长因子。
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