CN116399929A - 一种快速检测灵芝三萜中灵芝酸a的便携式分子印迹功能膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速检测灵芝三萜中灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜，所述功能膜包括丝网印刷三电极，在电极表面修饰还原氧化石墨烯壳聚糖敏感膜，在所述敏感膜外侧设有聚邻苯二胺分子印迹膜，所述聚邻苯二胺分子印迹膜提供模板分子灵芝酸A的印迹位点。本发明的分子印迹功能膜对灵芝酸A具有优异的特异性和选择性，对灵芝酸A的电信号响应快速，且电化学响应值对灵芝酸A的浓度具有很好的线性关系。
Description
技术领域
本发明涉及电化学传感领域，特别涉及一种快速检测灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜的制备方法及其应用。
背景技术
灵芝（Ganoderma）是一种隶属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、灵芝科、灵芝属的植物子实体，又被称为“瑞草”、“仙草”，是我国一种名贵的药用真菌，其具有补气安神、益肺活血、固本扶正等多种药理和保健功效。2020年版《中华人民共和国药典》收录了赤芝（G.lucidum）和紫芝（G. sinense）为法定中药材，明朝李时珍著《本草纲目》中对灵芝的记载为：“其性味苦，平，无毒；益心气，入心充血，助心充脉，安神，益肺气，补中，增智慧，好颜色，利关节，坚筋骨，祛痰，健胃，活血。”近年来，国内外大量的研究验证了灵芝具有多种药理作用，如：抗癌、抗氧化、抗炎、保护心脏、抗肝毒性等。同时，相关研究通过多种现代分析手段确定了灵芝的主要药效成分之一是灵芝三萜。因此，对灵芝三萜类化合物的提取分离是一个非常重要的课题，研究其快速、实时、准确的分析方法，对于以灵芝三萜类化合物为评价指标的药材、制剂的质量控制和发挥药效防治相关疾病等方面都具有极为重要的意义。
灵芝三萜类化合物的基本结构由多个异戊二烯首尾相接而成，大多为四环三萜，是高度氧化的羊毛甾烷，分子量一般为400~600。近年来国内外对灵芝三萜类化合物中的灵芝酸进行了大量研究，证实了灵芝酸具有降血糖、抗癌、保肝排毒、抗炎、抗氧化等多方面的药效作用。自1982年Kubota首次从灵芝中分离得到灵芝酸A和灵芝酸B以来，目前已经分离得到的灵芝酸已有400多种，包括灵芝酸A、灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸D等。近些年由于对保健品的市场监管不严，使得保健品市场混乱，侵害消费者利益的情况时有发生，同时也阻碍了这一领域的发展。其主要原因在于对标准物质方面研究不足。因此，本发明首先着力于灵芝中有代表性的标准物质的开发，重点考虑灵芝含量较多且不同产地差异较大的成分。而三萜类中最主要的化合物是灵芝酸A。同时参考国家药典和其他文献的资料，确定灵芝中标志性的有效成分为灵芝酸A。因此，对灵芝酸A进行准确检测和分离具有重要意义。
目前常用的灵芝酸A的分析检测方法包括液相色谱法、光谱法、质谱法和核磁波谱法等，能够提供大分子物质的含量、分子质量、组成和结构等信息，具有分离效率高、选择性好、应用范围广、技术成熟等优点。然而，这些方法仍存在一些短板，例如：反应时间长、仪器设备价格昂贵、对仪器操作技术要求高、检测成本消耗大，导致对分析过程的限制较多等。这也促进了开发创新检测分析手段，对传统检测方法进行补充与优化的相关研究。新型分子印迹生物传感器基于生物传感技术和分子印迹技术的原理，具有生物传感操作方便、灵敏度高、响应速度快和分子印迹高选择性等优点。
因此，目前急需一种快速检测灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜及其制备方法和应用。
发明内容
为了克服现有技术上的问题，本发明提供一种稳定性高、特异性强的便携式分子印迹功能膜。
本发明提供以下技术方案：
一种快速检测灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜，所述功能膜包括丝网印刷三电极，在电极表面修饰还原氧化石墨烯壳聚糖敏感膜，在所述敏感膜外侧设有聚邻苯二胺分子印迹膜，所述聚邻苯二胺分子印迹膜提供模板分子灵芝酸A的印迹位点。
进一步的，所述丝网印刷三电极以纸基为基底，所述敏感膜厚度为0.7-1.3 nm，敏感膜还原氧化石墨烯直径为0.6-4.5 μm，单层率为70-80%，排列疏松；由敏感膜复合的所述功能膜采用差分脉冲伏安法（DPV）在铁氰化钾电解液的峰值增加60-80μA。
一种制备分子印迹功能膜的方法，包括以下步骤：
步骤一 组装三电极体系，以纸基为基底，工作电极为直径3mm，面积为0.071 cm2，材料为碳，对电极面积为0.050 cm2，材料为碳，参比电极面积为0.010 cm2，材料为银，将电极置于5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol·L-1KCl的磷酸盐溶液中采用循环伏安法（CV）扫描检测，直至获得稳定的氧化还原峰，用超纯水冲洗电极并烘干；
步骤二 取浓度为1 mg·mL-1的还原氧化石墨烯纳米分散液，将壳聚糖溶于乙酸溶液形成壳聚糖溶液，与还原氧化石墨烯的分散液超声混合形成还原氧化石墨烯的壳聚糖溶液；将还原氧化石墨烯壳聚糖溶液滴加到电极表面，直至表面干燥；超纯水冲洗并烘干，得到敏感膜修饰电极；
步骤三 将浓度比为3 : 1~6 : 1的邻苯二胺和灵芝酸A加至浓度为10 mmol·L-1，pH为7.0的磷酸盐（PBS）缓冲液中，将修饰电极置于缓冲溶液中进行电聚合，超纯水冲洗电极并烘干，得到分子印迹聚合物膜；
步骤四 在乙醇水洗脱液中洗去模板分子灵芝酸A，用pH值为7.0的PBS缓冲液冲洗，得到印迹位点。
进一步的，在步骤二之前还包括步骤一a：将电极置于5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]和0.1 mol·L-1KCl的磷酸盐探针溶液中，进行CV扫描，直至获得稳定的氧化还原峰。
进一步的，CV扫描速度为50 mV/s，扫描电位为-0.4至+0.6 V。
进一步的，在步骤二中，乙酸溶液的浓度为0.01～0.03 mol/L，壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为0.2～0.3 mg/mL，超声时间为10～20 min；
滴加后对电极进行CV和DPV检测，检测液为5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6] 和0.1mol·L-1KCl，CV检测：电压范围-0.2至+0.5 V，50 mV·s-1，DPV检测：电压范围-0.4至+0.6V，50 mV·s-1，DPV峰值增加为裸电极的1.8-2倍。
进一步的，在步骤三中，电聚合的反应条件为扫描电压范围在（-0.1~0.1 V）~（+0.7~+0.9 V）之间，扫描速率为40～60 mV·s-1，扫描圈数为8-12个循环；
得到分子印迹聚合物膜后，对电极进行CV和DPV检测，检测液为5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol·L-1KCl，CV检测：电压范围-0.2至+0.5 V，50 mV·s-1，DPV检测：电压范围-0.4至+0.6 V，50 mV·s-1，DPV峰值减少为敏感膜修饰电极的0.5-0.75倍。
进一步的，在步骤四中，乙醇水洗脱液乙醇和水的体积比为1.5 : 1~1 : 1.5；聚合物膜修饰电极浸入洗脱液进行洗脱处理4~8分钟，之后使用pH为6~8的PBS缓冲液进行冲洗；
对洗脱后的电极进行CV和DPV检测，检测液为5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6] 和0.1mol·L-1KCl，CV检测：电压范围-0.2-+0.5 V，50 mV·s-1，DPV检测：电压范围-0.4至+0.6V，50 mV·s-1，DPV峰值增加为分子印迹膜修饰电极的1-1.3倍。
一种利用的分子印迹功能膜检测灵芝酸A的方法，包括以下步骤：
步骤一 将所述的分子印迹功能膜置于待测样本中并于室温下孵育10-20分钟，之后以所述的分子印迹功能膜所组成的三电极体系置于铁氰化钾和氯化钾溶液中进行DPV测试，定量检测样本中灵芝酸A含量；
步骤二 选用灵芝酸G、灵芝酸D、灵芝酸F和灵芝酸C2作为灵芝中共存结构类似干扰物测定所述灵芝酸A分子印迹功能膜的选择性，并置于铁氰化钾和氯化钾溶液中进行DPV测试，实现选择性的评估。
分子印迹功能膜对灵芝酸A的检测线性范围为0.1-100 ng·mL-1；线性回归方程为：ΔIp(μA)=21.26 LgC(ng·mL-1)+20.87，相关系数R2为0.992；
和/或，所述待测样品的体积为3~6 μL；
和/或，所述差分脉冲伏安法测试条件包括：扫描电位为-0.4至+0.6 V，扫描速率为50 mV/s；
和/或，所述的分子印迹功能膜对灵芝酸A的检出限为0.03 ng·mL-1，S/N=3。
采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
1.本发明电极表面修饰还原氧化石墨烯壳聚糖敏感膜可以致密的包覆电极表面，电化学性能好，且具有良好的稳定性，使得制备的分子印迹功能膜对灵芝酸A具有优异的特异性和选择性，对灵芝酸A的电信号响应快速，且电化学响应值对灵芝酸A的浓度具有很好的线性关系。
2.本发明采用三电极丝网印刷电极，丝网印刷电极具有结构简单、成本低廉、易于规模化生产、设计灵活，可定量检测多种物质等优势。
3.本发明中，采用滴涂法将还原氧化石墨烯壳聚糖敏感膜修饰在丝网印刷电极片上，为灵敏的电化学传感提供有效平台。
4.本发明中，分子印迹聚合物膜合成采用邻苯二胺电聚合的方法，与传统的分子印迹聚合物合成相比，具有操作简单，节省时间，印迹膜可调控等优势。该分子印迹功能膜灵敏度高、选择性好，已成功应用于实际样品中灵芝酸A的检测。
附图说明
图1是本发明快速检测灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜（MIP/RGO-CS/SPCE）高分辨SEM图；
图2是还原氧化石墨烯壳聚糖敏感膜高分辨SEM图；
图3不同修饰电极在铁氰化钾和氯化钾溶液中的循环伏安（CV）图；
图4是分子印迹功能膜（MIP/RGO-CS/SPCE）差分脉冲伏安法响应值与灵芝酸A浓度的线性关系图；
图5不同修饰电极在铁氰化钾和氯化钾溶液中的差分脉冲伏安法差值结果图；
图6修饰电极应用不同功能单体在铁氰化钾和氯化钾溶液中的差分脉冲伏安法差值结果图；
图7分子印迹功能膜（MIP/RGO-CS/SPCE）选择性实验图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
如图1所示，本发明提供了一种快速检测灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜，功能膜包括以纸基为基底的丝网印刷三电极，在电极表面修饰还原氧化石墨烯壳聚糖敏感膜，在敏感膜外侧设有聚邻苯二胺分子印迹膜聚邻苯二胺分子印迹膜提供模板分子灵芝酸A的印迹位点。
其中，如图2所示，敏感膜厚度是0.7-1.3 nm，敏感膜还原氧化石墨烯直径为0.6-4.5 μm，单层率为70-80%，排列疏松，本发明的敏感膜横向尺寸较大，其表面相对光滑，略有皱纹，片层边缘发生折叠和卷曲，层数较少，由敏感膜复合的功能膜采用DPV在铁氰化钾电解液的峰值增加60-80μA。这样的敏感膜分散性好、结构稳定，具有优异的电化学性能。
图3是不同修饰电极在铁氰化钾和氯化钾溶液中的CV检测结果，如图3所示，曲线a表示未修饰敏感膜的功能膜，其在铁氰化钾电解液的峰值为40 μA ；曲线b表示修饰敏感膜后的功能膜，其峰值为54 μA，可见敏感膜具有良好的电催化性能，采用DPV在铁氰化钾电解液中峰值可增加70μA。
实施例2
本发明提供了一种制备快速检测灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜的方法，包括以下步骤：
步骤一 组装三电极体系（SPCE），以纸基为基底，三电极工作电极:碳3 mm/0.071cm2，对电极:碳(0.050 cm2)，参比电极:银(0.010 cm2)；将电极置于5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol·L-1KCl的磷酸盐溶液中采用CV扫描检测，直至获得稳定的氧化还原峰，用超纯水冲洗电极并烘干。
步骤二 取浓度为1 mg·mL-1的还原氧化石墨烯纳米分散液，将壳聚糖溶于乙酸溶液形成壳聚糖溶液，与还原氧化石墨烯的分散液超声混合形成还原氧化石墨烯的壳聚糖溶液；将还原氧化石墨烯壳聚糖溶液滴加到电极表面，直至表面干燥；超纯水冲洗并烘干，得到敏感膜修饰电极。
步骤三 配制含有浓度比为3 : 1~6 : 1（优选5:1）的邻苯二胺和灵芝酸A的PBS缓冲液（10 mmol·L-1，pH = 7.0）将修饰电极置于缓冲溶液中进行电聚合，电聚合的反应条件为扫描电压范围在（-0.1~0.1 V）~（+0.7~+0.9 V）之间，扫描速率为40～60 mV·s-1，扫描圈数为8～12个循环；优选的，电压范围为0-0.8 V，扫描速率为50 mV·s-1，扫描圈数为5圈。超纯水冲洗电极并烘干，得到分子印迹聚合物膜。
电聚合成膜过程中，由于MIP前驱液中的灵芝酸A与邻苯二胺通过氢键作用掺入聚合膜中，降低了邻苯二胺聚合膜的致密度，从而有利于后续邻苯二胺在电极表面的扩散和氧化。
步骤四 在乙醇水洗脱液中洗去模板分子灵芝酸A，用pH值为7.0的PBS缓冲液冲洗，得到印迹位点。
其中，在步骤二之前还包括电极预处理的步骤一a：将电极置于5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol·L-1KCl的磷酸盐探针溶液中，进行CV扫描，直至获得稳定的氧化还原峰。CV扫描速度为50 mV/s，扫描电位为-0.4至+0.6 V。结果如图3中的曲线a所示，可以看出裸SPCE具有良好的可逆氧化还原反应。
在步骤二中，乙酸溶液的浓度为0.01～0.03 mol/L，壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为0.2～0.3 mg/mL，超声时间为10～20 min；优选的，乙酸溶液的浓度为0.02 mol·L-1，壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为0.25 mg·mL-1，超声时间为15 min。
滴加后对电极进行CV和DPV检测，检测液为5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6] 和0.1mol·L-1KCl，CV检测：电压范围-0.2至+0.5 V，50 mV·s-1，DPV检测：电压范围-0.4至+0.6V，50 mV·s-1，DPV峰值增加为裸电极的1.8-2倍。结果图3中的曲线b所示，可以看出在裸露的SPCE上修饰还原氧化石墨烯壳聚糖敏感膜后，峰值电流明显增加（约14 μA），峰值增加倍数为1.8倍。
在步骤三中，得到分子印迹聚合物膜后，对电极进行CV和DPV检测，检测液为5.0mmol·L-1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol·L-1KCl，CV检测：电压范围-0.2至+0.5 V，50 mV·s-1，DPV检测：电压范围-0.4至+0.6 V，50 mV·s-1，DPV峰值减少为敏感膜修饰电极的0.5-0.75倍。结果如图3中的曲线c所示，可以看出在修饰敏感膜的SPCE电极上电聚合邻苯二胺形成分子印迹膜后，峰值电流明显下降（约10 μA），峰值下降0.75倍。
在步骤四中，乙醇水洗脱液乙醇和水的体积比为1.5 : 1~1 : 1.5（优选1:1）；聚合物膜修饰电极浸入洗脱液进行洗脱处理4~8分钟（优选6分钟），之后使用pH为6~8（优选为7）的PBS缓冲液进行冲洗。
对洗脱后的电极进行CV和DPV检测，检测液为5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6] 和0.1mol·L-1KCl，CV检测：电压范围-0.2至+0.5 V，50 mV·s-1，DPV检测：电压范围-0.4至+0.6V，50 mV·s-1，DPV峰值增加为分子印迹膜修饰电极的1-1.3倍。
如图3中曲线c和b所示，MIP/RGO-SPCE洗脱前的峰值电流明显低于未修饰分子印迹聚合物（MIP）的电极（RGO-CS/SPCE），而RGO-CS/SPCE上覆盖的非导电分子印迹膜无疑阻碍了电子转移。如图3中曲线d所示，用乙醇水洗脱分子印迹功能膜去除模板后，在分子印迹膜上形成许多印迹腔用于电子转移，导致峰值电流进一步上升，峰值增加了1.3倍。如图3中曲线e所示，在50 nmol·L−1灵芝酸A中重结合后，MIP/RGO-CS/SPCE的峰值电流再次下降，因为灵芝酸A通过阻断印迹腔来阻止电子转移。
作为对照组，按照相同的程序制备非印迹聚合物（NIP），只是在聚合过程中不加入模板分子灵芝酸A，记为NIP/RGO-SPCE。如图3中曲线f和d所示，洗脱后的NIP/RGO-CS/SPCE峰值电流明显低于洗脱后的MIP/RGO-CS/SPCE，这是由于NIP/RGO-CS/SPCE中没有模板分子，洗脱前后无变化。
实施例3
本发明特异性地选择在电极表面修饰还原氧化石墨烯壳聚糖敏感膜，是因为该敏感膜作为固定分子印迹功能膜的载体，稳定地提高了电极的电导率，对提高传感器的检测灵敏度起着至关重要的作用。
图5是不同修饰电极在铁氰化钾和氯化钾溶液中的差分脉冲伏安法差值结果，该实验采用还原氧化石墨烯、壳聚糖、多壁碳纳米管壳聚糖溶液和还原氧化石墨烯壳聚糖溶液分别修饰SPCE，从图中可以看出修饰RGO-CS的电极具有最高的电化学响应，说明RGO-CS导电性最好，可以提升电极的电导率。
本发明在制备分子印迹聚合物层时特异性地选择邻苯二胺作为功能单体，是因为电聚合邻苯二胺作为分子印迹膜稳定性好，识别能力强，电化学响应高。
图6显示修饰电极应用不同功能单体在铁氰化钾和氯化钾溶液中的差分脉冲伏安法差值结果。该实验采用吡咯、3-氨基苯硼酸、多巴胺和邻苯二胺分别作为功能单体，通过电聚合的方法在修饰电极表面形成分子印迹膜，从图中可以看出以邻苯二胺作为功能单体的分子印迹膜具有最高的电化学响应，强于其他几种功能单体。与其他现有技术已知的功能单体相比，本功能单体具有制备简单，可控性好，重复性优良，印迹空穴不易变形等优点。
实施例4
对本发明制备的快速检测灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜进行检测实验。
将制备的分子印迹功能膜分别滴入已知浓度梯度的灵芝酸A溶液中50 μL孵育20分钟。随后将电极置于5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol·L-1KCl的PBS溶液中以CV扫描，考查洗脱后和重吸附后的峰电流差ΔIp和灵芝酸A浓度的线性关系以及传感器的检测限。
结果如图4所示，线性回归方程为：ΔIp(μA)=21.26 LgC(ng·mL-1)+20.87。相关系数R2为0.992；检出限为0.03 ng·mL-1，S/N=3。可见，本发明制备的检测灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜，结合分子印迹技术与电化学传感技术，构建了高灵敏、高选择性的灵芝酸A传感器，具有相当甚至更好的检出限和线性浓度范围，可作为测定实际样品中的灵芝酸A含量的快速检测装置，表现出优异的分析性能和较好的稳定性，具有较好的应用前景。
选用灵芝酸G、灵芝酸D、灵芝酸F和灵芝酸C2作为灵芝中共存结构类似干扰物，测定本发明灵芝酸A分子印迹功能膜的选择性。
置于铁氰化钾和氯化钾溶液中进行DPV测试，实现选择性的评估。结果如图7所示，本发明的MIP/RGO-CS/SPCE在灵芝酸A的信号响应远远大于其它干扰物产生的信号响应，说明该分子印迹功能膜对目标物灵芝酸A具有较好的选择性，灵敏度高。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种快速检测灵芝三萜中灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜，其特征在于，所述功能膜包括丝网印刷三电极，在电极表面修饰还原氧化石墨烯壳聚糖敏感膜，在所述敏感膜外侧设有聚邻苯二胺分子印迹膜，所述聚邻苯二胺分子印迹膜提供模板分子灵芝酸A的印迹位点。
2.根据权利要求1所述的分子印迹功能膜，其特征在于，所述丝网印刷三电极以纸基为基底，所述敏感膜厚度为0.7-1.3 nm，敏感膜还原氧化石墨烯直径为0.6-4.5 μm，单层率为70-80%，排列疏松；由敏感膜复合的所述丝网印刷三电极采用差分脉冲伏安法在铁氰化钾电解液的峰值增加60-80 μA。
3.制备权利要求1或2所述的分子印迹功能膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一 组装三电极体系，以纸基为基底，工作电极为直径3 mm，面积为0.071 cm2，材料为碳；对电极面积为0.050 cm2，材料为碳；参比电极面积为0.010 cm2，材料为银；将电极置于5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol·L-1 KCl的磷酸盐溶液中采用循环伏安法扫描检测，直至获得稳定的氧化还原峰，用超纯水冲洗电极并烘干；
步骤二 取浓度为1 mg·mL-1的还原氧化石墨烯纳米分散液，将壳聚糖溶于乙酸溶液形成壳聚糖溶液，与还原氧化石墨烯的分散液超声混合形成还原氧化石墨烯的壳聚糖溶液；将还原氧化石墨烯壳聚糖溶液滴加到电极表面，直至表面干燥；超纯水冲洗并烘干，得到敏感膜修饰电极；
步骤三 将浓度比为3 : 1~6 : 1的邻苯二胺和灵芝酸A加至浓度为10 mmol·L-1，pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，将修饰电极置于缓冲溶液中进行电聚合，超纯水冲洗电极并烘干，得到分子印迹聚合物膜；
步骤四 在乙醇水洗脱液中洗去模板分子灵芝酸A，用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，得到印迹位点。
4.根据权利要求3所述的分子印迹功能膜的制备方法，其特征在于，在步骤二之前还包括步骤一a：将电极置于5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol·L-1 KCl的磷酸盐探针溶液中，进行循环伏安法扫描，直至获得稳定的氧化还原峰。
5.根据权利要求4所述的分子印迹功能膜的制备方法，其特征在于，循环伏安法扫描速度为50 mV/s，扫描电位为-0.4至+0.6 V。
6.根据权利要求3所述的分子印迹功能膜的制备方法，其特征在于，在步骤二中，乙酸溶液的浓度为0.01～0.03 mol/L，壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为0.2～0.3 mg/mL，超声时间为10～20 min；
滴加后对电极进行CV和DPV检测，检测液为5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol·L-1KCl，CV检测：电压范围-0.2至+0.5 V，50 mV·s-1，DPV检测：电压范围-0.4至+0.6 V，50mV·s-1，DPV峰值增加为裸电极的1.8-2倍。
7.根据权利要求3所述的分子印迹功能膜的制备方法，其特征在于，在步骤三中，电聚合的反应条件为扫描电压范围在（-0.1~0.1 V）~（+0.7~+0.9 V）之间，扫描速率为40～60mV·s-1，扫描圈数为8～12个循环；
得到分子印迹聚合物膜后，对电极进行CV和DPV检测，检测液为5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol·L-1 KCl，CV检测：电压范围-0.2至+0.5 V，50 mV·s-1，DPV检测：电压范围-0.4至+0.6 V，50 mV·s-1，DPV峰值减少为敏感膜修饰电极的0.5-0.75倍。
8.根据权利要求3所述的分子印迹功能膜的制备方法，其特征在于，在步骤四中，乙醇水洗脱液乙醇和水的体积比为1.5 : 1~1 : 1.5；聚合物膜修饰电极浸入洗脱液进行洗脱处理4~8分钟，之后使用pH为6~8的磷酸盐缓冲液进行冲洗；
对洗脱后的电极进行CV和DPV检测，检测液为5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol·L-1 KCl，CV检测：电压范围-0.2至+0.5 V，50 mV·s-1，DPV检测：电压范围-0.4至+0.6 V，50mV·s-1，DPV峰值增加为分子印迹膜修饰电极的1-1.3倍。
9.一种利用权利要求1所述的分子印迹功能膜检测灵芝酸A的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一 将所述的分子印迹功能膜置于待测样本中并于室温下孵育10-20分钟，之后以所述的分子印迹功能膜所组成的三电极体系置于铁氰化钾和氯化钾溶液中进行差分脉冲伏安法测试，定量检测样本中灵芝酸A含量；
步骤二 选用灵芝酸G、灵芝酸D、灵芝酸F和灵芝酸C2作为灵芝中共存结构类似干扰物测定所述灵芝酸A分子印迹功能膜的选择性，并置于铁氰化钾和氯化钾溶液中进行差分脉冲伏安法测试，实现选择性的评估。
10.根据权利要求9所述检测灵芝酸A的方法，其特征在于：所述的分子印迹功能膜对灵芝酸A的检测线性范围为0.1-100 ng·mL-1；线性回归方程为：ΔIp(μA)=21.26 LgC(ng·mL-1)+20.87，相关系数R2为0.992；
和/或，所述待测样本的体积为3~6 μL；
和/或，所述差分脉冲伏安法测试条件包括：扫描电位为-0.4至+0.6 V，扫描速率为50mV/s；
和/或，所述的分子印迹功能膜对灵芝酸A的检出限为0.03 ng·mL-1，S/N=3。
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| CN202310648364.XA Pending CN116399929A (zh) | 2023-06-02 | 2023-06-02 | 一种快速检测灵芝三萜中灵芝酸a的便携式分子印迹功能膜及其制备方法和应用 |
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| CN (1) | CN116399929A (zh) |
Citations (10)
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-
2023
- 2023-06-02 CN CN202310648364.XA patent/CN116399929A/zh active Pending
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