CN112816536A - 基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用,制备方法包括:电活性天然大分子的制备、蛋白质/电活性天然大分子胶束的制备、蛋白质/电活性天然大分子胶束修饰电极的制备和超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备。本发明制备的电活性天然大分子胶束具有纳米结构和良好的生物相容性,将其应用于蛋白质分子印迹传感器,可以有效提高蛋白质在印迹聚合物中的传质速率,所构建的蛋白质印迹传感器具有良好的选择性、稳定性、灵敏性和较宽的检测范围;大分子自组装技术与蛋白质分子印迹技术、电化学生物传感技术的结合,可广泛应用于生物医药、食品安全以及环境监测等领域。
Description
技术领域
本发明属于功能高分子材料领域和电化学生物传感器制备技术领域,具体涉及基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白质组学是当今最为重要的研究领域之一,与人类健康和社会发展具有十分密切的关系。对蛋白质的深入研究不仅能为揭示生命活动规律提供物质基础,也能为众多疾病机理的阐明及攻克提供理论依据和解决途径。蛋白质组学研究中,需要发展从复杂基体样品中选择性地分离、识别和检测特定目标蛋白质的方法。因此,开发新的分离识别方法,将在蛋白质组学领域发挥重要作用。
蛋白质印迹技术是集大分子合成、蛋白质分子识别及仿生生物工程等众多学科发展起来的新型技术,是从复杂基体样品中选择性地分离和识别目标蛋白质的有效方法。但是,由于蛋白质分子具有较大的空间尺寸,在印迹聚合物中传质扩散困难。具有纳米结构的大分子自组装胶束有利于提高蛋白质在印迹聚合物胶束中的传质速率,但绝缘性的印迹聚合物胶束限制了蛋白质印迹传感器灵敏度的提高。
噻吩是一种环状不饱和硫醚化合物,具有电化学活性。在电化学作用下,噻吩单体发生氧化反应得到交联网状聚噻吩。聚噻吩及其衍生物由于分子链上具有大的π共轭结构使分子整体具有离域的特征,表现出了良好的转移电荷的能力,广泛应用于生物传感器、神经探针、药物输送、组织工程、有机光伏电池等众多研究领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器及其制备方法,采用生物相容性蛋白质/电活性天然大分子胶束制备的蛋白质分子印迹传感器具有灵敏度高、检测下限低、检测范围宽、选择性好、稳定性好等优点。
本发明还有一个目的在于提供基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的应用,用于检测蛋白质,具有选择性高、灵敏度高、监测范围宽、检测下限低等优点。
本发明具体技术方案如下:
基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
1)电活性天然大分子的制备:将天然大分子溶于溶剂中,依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺或4-二甲氨基吡啶和水溶性噻吩,搅拌进行反应,反应结束后,透析、冷冻干燥,得到电活性天然大分子;
2)蛋白质/电活性天然大分子胶束的制备;
3)蛋白质/电活性天然大分子胶束修饰电极的制备;
4)超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备。
步骤1)中所述天然大分子为海藻酸钠、壳聚糖、聚氨基酸、淀粉或葡聚糖;
所述水溶性噻吩为氨基噻吩或羧基噻吩;氨基噻吩优选为3-氨乙基噻吩或3-氨基噻吩;羧基噻吩优选为3-羧甲基噻吩或3-羧乙基噻吩;
步骤1)中将天然大分子溶于溶剂中,所用的溶剂为蒸馏水、二甲亚砜或二氯甲烷;进一步的,天然大分子溶于溶剂中,溶解温度为10-100℃。
步骤1)中天然大分子溶于溶剂中,天然大分子重复单元浓度为0.01-10mol/L。
步骤1)中天然大分子为海藻酸钠或聚氨基酸时,其羧基与氨基噻吩上的氨基进行酰胺化反应得到电活性天然大分子;天然大分子为壳聚糖时,其氨基与羧基噻吩上的羧基进行酰胺化反应得到电活性天然大分子;天然大分子为淀粉或葡聚糖时,其羟基与羧基噻吩上的羧基进行酯化反应得到电活性天然大分子。
步骤1)中的天然大分子重复单元与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量之比为6:1-1:6;天然大分子重复单元与N-羟基琥珀酰亚胺或4-二甲氨基吡啶的物质的量之比为6:1-1:6;天然大分子重复单元与水溶性噻吩单体的物质的量之比为6:1-1:6。
步骤1)中的天然大分子、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺或4-二甲氨基吡啶、水溶性噻吩单体混合后在冰浴中反应2-6h,再在室温下反应6-48h。
步骤1)中所述透析,将反应物装入透析袋(MW8000-10000)中,使用蒸馏水透析提纯。
步骤1)中所述冷冻干燥是指冷冻温度-70℃,时间24-72h。
步骤2)具体为:将步骤1)制备的电活性天然大分子和蛋白质分别溶解后,搅拌混合,通过弱相互作用力自组装为蛋白质/电活性天然大分子胶束。
优选的,步骤2)中淀粉或葡聚糖制备的电活性天然大分子溶解采用的溶剂为二甲亚砜;海藻钠酸或聚氨基酸制备的电活性天然大分子溶解在水溶液中,加入盐酸调节pH至3-5;壳聚糖制备的电活性天然大分子溶解在1%乙酸溶液中,加入氢氧化钠调节pH至4-6。
步骤2)中所述蛋白质采用磷酸盐缓冲溶液溶解;
步骤2)中所述蛋白质为牛血清白蛋白、肌红蛋白、牛血红蛋白、辣根过氧化物酶、溶菌酶或络蛋白。
步骤2)中的电活性天然大分子溶解后,电活性天然大分子浓度为0.001-100mg/mL;
步骤2)中蛋白质溶解在磷酸盐缓冲溶液中,蛋白质浓度为0.001-100mg/mL。
步骤2)中的电活性天然大分子溶液与蛋白质溶液的体积比为10:1-1:10。
步骤3)具体为:将蛋白质/电活性天然大分子胶束溶液修饰在金电极表面,室温下晾干,得到蛋白质/电活性天然大分子胶束修饰电极。
步骤3)中,所述金电极使用前经过清洗,具体为:将金电极依次用0.3μm和0.05μm的α-Al2O3粉末进行表面抛光,分别使用蒸馏水和乙醇在超声清洗机上清洗,自然晾干;
步骤3)中所用的蛋白质/电活性天然大分子胶束浓度为0.001-100mg/mL,所用体积为1.0-20μL。
步骤4)中具体为:将晾干后的蛋白质/电活性天然大分子胶束修饰电极在高氯酸锂的乙腈溶液中利用循环伏安法进行电聚合,晾干后,洗脱除去模板蛋白质,自然晾干后,即得到超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器。
进一步的,利用循环伏安法进行电聚合,扫描范围从0V到1.5V;扫描速率为100mV/s;扫描圈数5-30圈。
进一步的,步骤4)中的高氯酸锂乙腈溶液浓度为0.01-2.0mol/L。
步骤4)中的洗脱使用的洗脱液为甲醇/冰醋酸混合溶液,其中甲醇与冰醋酸的体积比为10:1-1:10。
步骤4)中洗脱具体工艺参数为室温下洗脱1-24h。
本发明提供的一种基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器,采用上述方法制备得到。
本发明提供的基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的应用,用于检测蛋白质,具体方法为:
S1、将超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器置于蛋白质浓度为0的磷酸盐缓冲溶液(空白溶液)中,静置后置于电解质溶液中,利用差分常规脉冲伏安法测量空白溶液电化学响应值;
S2、将蛋白质分子印迹电化学传感器置于一定浓度蛋白质溶液中,静置吸附后置于电解质溶液中,利用差分常规脉冲伏安法测量电化学响应值,将传感器取出洗脱蛋白质;
S3、将洗脱后的蛋白质分子印迹电化学传感器再置于另一浓度的蛋白质溶液中,重复S2的步骤;
S4、以一定蛋白质浓度下测量所得电化学响应值与空白溶液的电化学响应值的差值的绝对值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,构建线性关系。
进一步的,磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.2,浓度为0.1mol/L;差分常规脉冲伏安法(DNPV)测量时,扫描范围从-0.1V到0.9V;扫描速率为20mV/s;电解质溶液为含5mmol/L铁氰化钾、5mmol/L亚铁氰化钾和0.1mol/L氯化钾的pH值为7.2,浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。
将制备的电化学传感器分别置于空白溶液和待测浓度的蛋白质溶液中吸附后,在电解质溶液中用差分常规脉冲伏安法分别测量两者的电化学响应值并计算电化学响应差值的绝对值,根据得到的电化学响应差值的绝对值和上述线性关系得到待测蛋白质溶液浓度。
本发明将具有电活性的天然大分子溶于溶剂、蛋白质溶于磷酸盐缓冲溶液中,电活性天然大分子通过弱相互作用力实现对蛋白质分子的包埋,形成蛋白质/电活性天然大分子胶束,然后将蛋白质/电活性天然大分子胶束修饰到金电极表面,自然晾干后,在高氯酸锂的乙腈溶液中电聚合形成导电聚噻吩网络,增加自组装胶束膜的导电性,提高检测的灵敏性;自然晾干后在甲醇/冰乙酸的混合溶液中洗脱除去模板分子,即制备得到高灵敏性蛋白质分子印迹传感器。制备的蛋白质分子印迹传感器具有选择性高、灵敏度高、检测范围宽、检测下限低等优点,有望广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。
与现有技术相比,本发明的主要优点在于:
1)本发明所提出的一种基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法中所采用的蛋白质/电活性天然大分子胶束具有良好的生物相容性,有利于传感器制备过程中蛋白质活性的保持;
2)本发明所提出的一种基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法中所采用的蛋白质/电活性天然大分子胶束具有纳米结构,有利于提高蛋白质在分子印迹聚合物胶束中的传质速率。
3)本发明所提出的一种基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法中所采用的蛋白质/电活性天然大分子胶束,经电聚合交联形成导电交联网络,同时固定结合位点,有利于提高待测蛋白质与基底电极间的电子传递速率。
4)本发明所制备的一种基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法具有选择性高、灵敏度高、检测范围宽、检测下限低等优点。
5)本发明将大分子自组装技术、电化学生物传感技术与蛋白质印迹技术结合构建高灵敏性蛋白质分子印迹传感器,有望应用于生物医药、食品安全以及环境监测等领域。
附图说明
图1为噻吩改性γ-聚谷氨酸聚合物的合成路线;其中,4600<n<6700,200<m<2000;
图2为γ-聚谷氨酸和噻吩改性γ-聚谷氨酸聚合物的核磁共振谱(a)和红外谱图(b);
图3为噻吩改性γ-聚谷氨酸自组装胶束(a)与噻吩改性γ-聚谷氨酸/牛血清白蛋白复合组装胶束(b)的扫描电镜图;
图4为本发明蛋白质分子印迹传感器制备过程不同修饰阶段的循环伏安谱图;
图5为蛋白质分子印迹传感器在不同浓度蛋白质溶液中的差分常规脉冲伏安曲线(a)和线性曲线(b)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者,均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
1)电活性天然大分子的制备;将2mmol聚谷氨酸(γ-PGA,以重复单元计)溶于40mL蒸馏水中,室温下完全溶解后,置于冰浴中1h,再加入2mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,完全溶解后加入4mmol N-羟基琥珀酰亚胺,待完全溶解后加入2mmol 3-氨基噻吩(At),在冰浴、磁力搅拌条件下反应2h,再室温反应24h,反应后,装入透析袋中(MW8000-10000)蒸馏水透析,冷冻干燥,温度为-70℃,时间为72h,得到噻吩改性γ-聚谷氨酸(At-γ-PGA)聚合物。合成路线如图1。
图2为γ-PGA与At-γ-PGA的氢核磁谱图(1H NMR)(a)和红外谱图(b)。由图2中(a)可以看出At-γ-PGA聚合物核磁谱图上比γ-PGA的核磁谱图上明显多了3个振动峰;由图2中(b)可看出At-γ-PGA聚合物的红外光谱明显比γ-PGA的红外光谱多出一个吸收峰,这是噻吩的吸收峰,说明接枝反应成功。
2)蛋白质/电活性天然大分子胶束的制备:将At-γ-PGA溶于水中形成0.1mg/mL溶液;将牛血清白蛋白溶于pH 5.0的1mol/L的磷酸盐缓冲溶液中形成0.1mg/mL溶液的;将制备的20mL牛血清白蛋白溶液逐滴滴入到100mL At-γ-PGA溶液中,待牛血清白蛋白溶液完全分散后加入再滴入下一滴,混匀,用盐酸调节溶液pH值至4.0,诱导组装为牛血清白蛋白/噻吩改性γ-聚谷氨酸(BSA/At-γ-PGA)胶束。
图3是At-γ-PGA聚合物与BSA/At-γ-PGA胶束在pH 4.0时的扫描电子显微镜图。由图可以看出:At-γ-PGA聚合物在pH 4.0时呈略显不规则的球形形貌,粒径大约在100nm,粒径分布较宽;BSA/At-γ-PGA胶束在pH 4.0时为规则的球形形貌,粒径约为150nm。与At-γ-PGA聚合物胶束相比,粒径有所增加,这是因为负载了牛血清白蛋白的缘故。
3)蛋白质/电活性天然大分子胶束修饰电极的制备:将金电极依次用0.3μm和0.05μm的α-Al2O3粉末进行表面抛光,分别使用蒸馏水和乙醇在超声清洗机上清洗,自然晾干,在电化学工作站上以循环伏安法进行检测,使两者的氧化还原峰之差小于0.1V,即裸电极清洗完成。将5μL 0.1mg/mL BSA/At-γ-PGA胶束分散液修饰到金电极的表面,室温下晾干,得到BSA/At-γ-PGA胶束修饰电极。
4)超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备:将晾干后的BSA/At-γ-PGA胶束修饰电极在0.1mol/L高氯酸锂的乙腈溶液中利用循环伏安法进行电聚合,扫描范围从0V到1.5V;扫描速率为100mV/s;扫描圈数20圈,然后取出电极,晾干后在甲醇/冰醋酸(V:V=9:1)混合溶液中洗脱10h除去模板牛血清白蛋白质,自然晾干后,即得到超灵敏性牛血清分子印迹传感器。
图4为实施例1牛血清白蛋白分子印迹传感器制备过程不同修饰阶段的循环伏安谱图,实施例1步骤3)裸金电极循环伏安曲线对应图4中裸金电极曲线,实施例1步骤3)制备的BSA/At-γ-PGA胶束修饰电极循环伏安曲线对应图4中胶束改性电极曲线,实施例1步骤4)中电聚合后电极循环伏安曲线对应图4中电聚合后曲线;实施例1步骤4)中洗脱后电极循环伏安曲线对应图1中洗脱后曲线;图4中吸附后曲线为传感器的应用中静置吸附牛血清白蛋白后曲线。裸金电极在电解质溶液中的CV谱图上有一对相对对称的氧化还原峰;在滴加绝缘性BSA/At-γ-PGA胶束后,相比于裸电极电阻值增大,氧化还原峰电流值下降,即导电性降低;电聚合后CV谱图中的氧化还原峰电流值有所增加,这是因为噻吩基团形成共轭结构,胶束膜导电性增加;洗脱除去模板牛血清白蛋白之后,CV谱图中的氧化还原峰电流值进一步增加,这是因为牛血清白蛋白被洗脱后留下空穴位点,使电解质中的小分子易于进出;吸附模板牛血清白蛋白之后,CV谱图中的氧化还原峰电流值下降,这是因为空穴又重新被牛血清白蛋白占据,阻碍了电解质中小分子的进出。
上述制备的传感器的应用,用于检测待测溶液中牛血清白蛋白的浓度,具体为:
将上述制备的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器分别置于0、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L的不同浓度牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液中,其中磷酸盐缓冲溶液pH为7.2,浓度为0.1mol/L,静置吸附5min,置于电解质溶液中利用差分常规脉冲伏安法测量电化学响应值。扫描范围从-0.1V到0.9V,扫描速率为20mV/s,电解质为含5mmol/L铁氰化钾、5mmol/L亚铁氰化钾和0.1mol/L氯化钾的pH为7.2,浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。每次测完后将其取出洗脱3min,再进行下一个浓度的检测,以一定浓度下测量所得电化学响应值与空白溶液(牛血清白蛋白浓度为0mol/L)所测电化学响应值的差值的绝对值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,构建线性关系。
以一定浓度下测量所得电化学响应值与空白溶液所测电化学响应值的差值的绝对值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,构建线性关系。获得的线性方程为ΔI=11.459+0.8387×(log CBSA),ΔI为电流差值,单位为μA,CBSA是指牛血清白蛋白的浓度,单位是mol/L;相关系数平方为0.997。线性关系图如图5所示。
将制备的电化学传感器分别置于空白溶液和待测浓度的蛋白质溶液中吸附后,在电解质溶液中用差分常规脉冲伏安法分别测量两者的电化学响应值并计算电化学响应差值的绝对值,根据得到的电化学响应差值的绝对值和上述线性关系得到待测蛋白质溶液浓度。
实施例2
基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
1)电活性天然大分子的制备
将2mmol海藻酸钠(以重复单元计)溶于40mL蒸馏水中,完全溶解后,置于冰浴中2h,再加入2mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,完全溶解后加入4mmol N-羟基琥珀酰亚胺,待完全溶解后加入2mmol 3-氨基噻吩,在冰浴、磁力搅拌条件下反应2h,再在室温反应24h,装入透析袋中蒸馏水透析提纯,冷冻干燥后得到噻吩改性海藻酸钠聚合物。
2)蛋白质/电活性天然大分子胶束的制备
将噻吩改性海藻酸溶于pH 5.0磷酸盐缓冲溶液中形成0.1mg/mL溶液;将牛血红蛋白溶于pH 5.0磷酸盐缓冲溶液中形成0.1mg/mL溶液的;将20mL牛血红蛋白溶液逐滴滴加到100mL噻吩改性海藻酸钠溶液混合,用盐酸调节溶液pH值至4.0,通过弱相互作用力自组装为牛血红蛋白/噻吩改性海藻酸胶束。
3)蛋白质/电活性天然大分子胶束修饰电极的制备
将金电极依次用0.3μm和0.05μm的α-Al2O3粉末进行表面抛光,分别使用蒸馏水和乙醇在超声清洗机上清洗,自然晾干,将5μL 0.1mg/mL牛血红蛋白/噻吩改性海藻酸胶束溶液修饰到金电极的表面,室温下晾干,得到牛血红蛋白/噻吩改性海藻酸胶束修饰电极。
4)超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备
将晾干后的牛血红蛋白/噻吩改性海藻酸胶束修饰电极在0.1mol/L高氯酸锂的乙腈溶液中利用循环伏安法进行电聚合,扫描范围从0V到1.5V;扫描速率为100mV/s;扫描圈数20圈,聚合后电极晾干后,在甲醇/冰醋酸(V:V=9:1)混合溶液中洗脱24h除去模板牛血红蛋白质,自然晾干后即得到超灵敏性牛血红蛋白分子印迹传感器。
实施例3
基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
1)电活性天然大分子的制备
将2mmol淀粉(以重复单元计)溶于40mL二甲亚砜中,90℃完全溶解后降至室温,再加入2mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,完全溶解后加入4mmol 4-二甲氨基吡啶,待完全溶解后加入2mmol 3-羧甲基噻吩,在冰浴、磁力搅拌条件下反应2h,并室温反应24h,装入透析袋中蒸馏水透析提纯,冷冻干燥后得到噻吩改性淀粉聚合物。
2)蛋白质/电活性天然大分子胶束的制备
将噻吩改性淀粉溶于二甲亚砜中形成0.1mg/mL溶液;将溶菌酶溶于pH 5.0磷酸盐缓冲溶液中形成0.1mg/mL溶液;将与1mL溶菌酶溶液逐滴加入到1mL噻吩改性淀粉溶液混合,通过弱相互作用力组装为溶菌酶/噻吩改性淀粉胶束。
3)蛋白质/电活性天然大分子胶束修饰电极的制备
将金电极依次用0.3μm和0.05μm的α-Al2O3粉末进行表面抛光,分别使用蒸馏水和乙醇在超声清洗机上清洗,自然晾干,将5μL 0.1mg/mL溶菌酶/噻吩改性淀粉胶束溶液修饰到金电极的表面,室温下晾干,得到溶菌酶/噻吩改性淀粉胶束修饰电极。
4)超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备
将晾干后的溶菌酶/噻吩改性淀粉胶束修饰电极在0.1mol/L高氯酸锂的乙腈溶液中利用循环伏安法进行电聚合,扫描范围从0V到1.5V;扫描速率为100mV/s;扫描圈数20圈,晾干后在甲醇/冰醋酸(V:V=9:1)混合溶液中洗脱除去模板溶菌酶,自然晾干后即得到超灵敏性溶菌酶分子印迹传感器。
实施例4
基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
1)电活性天然大分子的制备
将2mmol葡聚糖(以重复单元计)溶于40mL二甲亚砜中,完全溶解后再加入2mmol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,完全溶解后加入4mmol 4-二甲氨基吡啶,待完全溶解后加入2mmol 3-羧乙基噻吩,在冰浴、磁力搅拌条件下反应2h,并室温反应24h,装入透析袋中蒸馏水透析提纯,冷冻干燥后得到噻吩改性葡聚糖聚合物。
2)蛋白质/电活性天然大分子胶束的制备
将噻吩改性葡聚糖溶于二甲亚砜中形成0.1mg/mL溶液;将肌红蛋白溶于pH 5.0磷酸盐缓冲溶液中形成0.1mg/mL溶液的;将与20mL肌红蛋白溶液逐滴加入到100mL噻吩改性葡聚糖溶液混合,通过弱相互作用力组装为肌红蛋白/噻吩改性葡聚糖胶束。
3)蛋白质/电活性天然大分子胶束修饰电极的制备
将金电极依次用0.3μm和0.05μm的α-Al2O3粉末进行表面抛光,分别使用蒸馏水和乙醇在超声清洗机上清洗,自然晾干,将10μL 0.2mg/mL肌红蛋白/噻吩改性葡聚糖胶束溶液修饰到金电极的表面,室温下晾干,得到肌红蛋白/噻吩改性葡聚糖胶束修饰电极。
4)超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备
将晾干后的肌红蛋白/噻吩改性葡聚糖胶束修饰电极在0.1mol/L高氯酸锂的乙腈溶液中利用循环伏安法进行电聚合,扫描范围从0V到1.5V;扫描速率为100mV/s;扫描圈数20圈,晾干后在甲醇/冰醋酸(V:V=9:1)混合溶液中洗脱除去模板肌红蛋白,自然晾干后即得到超灵敏性肌红蛋白分子印迹传感器。
Claims (10)
1.基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
1)电活性天然大分子的制备:将天然大分子溶于溶剂中,依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺或4-二甲氨基吡啶和水溶性噻吩,搅拌进行反应,反应结束后,透析、冷冻干燥,得到电活性天然大分子;
2)蛋白质/电活性天然大分子胶束的制备;
3)蛋白质/电活性天然大分子胶束修饰电极的制备;
4)超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的制备。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤1)中所述天然大分子为海藻酸钠、壳聚糖、聚氨基酸、淀粉或葡聚糖。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,步骤1)中所述水溶性噻吩为氨基噻吩或羧基噻吩。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,步骤1)中的天然大分子重复单元与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量之比为6:1-1:6;天然大分子重复单元与N-羟基琥珀酰亚胺或4-二甲氨基吡啶的物质的量之比为6:1-1:6;天然大分子重复单元与水溶性噻吩单体的物质的量之比为6:1-1:6。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,步骤1)中的天然大分子、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺或4-二甲氨基吡啶、水溶性噻吩单体混合后在冰浴中反应2-6h,再在室温下反应6-48h。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤2)具体为:将步骤1)制备的电活性天然大分子和蛋白质分别溶解后,将蛋白质溶液逐滴加入到电活性天然大分子溶液中,通过弱相互作用力组装为蛋白质/电活性天然大分子胶束。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤3)具体为:将蛋白质/电活性天然大分子胶束溶液修饰在金电极表面,室温下晾干,得到蛋白质/电活性天然大分子胶束修饰电极。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤4)中具体为:将晾干后的蛋白质/电活性天然大分子胶束修饰电极在高氯酸锂的乙腈溶液中利用循环伏安法进行电聚合,晾干后在甲醇/冰醋酸混合溶液中洗脱除去模板蛋白质,自然晾干后即得到超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器。
9.一种权利要求1-8任一项所述制备方法制备的基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器。
10.一种权利要求1-8任一项所述制备方法制备的基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器的应用,其特征在于,用于检测蛋白质。
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---|---|---|---|
CN202110017942.0A CN112816536A (zh) | 2021-01-07 | 2021-01-07 | 基于电活性天然大分子胶束的超灵敏蛋白质分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用 |
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