CN113252756A - 基于牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子构建的电化学分析方法检测细胞内过氧化氢 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于牛血清白蛋白‑二氧化钌纳米粒子构建的电化学分析方法检测细胞内过氧化氢。利用电子自旋共振图谱证明了BSA‑RuO2NPs催化H2O2产生羟自由基的催化过程，BSA‑RuO2NPs修饰的玻碳电极对H2O2有明显的催化作用，还原峰在大约‑0.5 V，峰电流随着扫描速度在20‑200mV/s范围内存在线性关系（R2=0.9965）。差示脉冲伏安法应用于BSA‑RuO2NPs修饰的旋转圆盘电极对H2O2催化过程中，峰电流与H2O2浓度在0.40‑3850μmol/L呈线性关系（R2=0.9967），最低检测限为0.18μmol/L。本发明成功应用于细胞内H2O2的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子构建的电化学方法，用于检测细胞内的过氧化氢含量，属于分析化学和纳米技术领域。
背景技术
活性氧（ROS）包括一些氧自由基，如超氧阴离子，羟基自由基等，也包括具有较高活性的一些分子如过氧化氢（H2O2）和单线态氧。与其他活性氧相比，过氧化氢性质相对稳定、容易在细胞与细胞周围环境之间扩散。过氧化氢作为一种信使分子，是需氧生物普遍具有的细胞氧代谢中间产物，目前的研究表明，细胞中H2O2含量的升高可直接或间接地诱导细胞恶性转化，它的浓度与细胞的增殖、迁移、分化相关。因此，发展一种新型有效的检测细胞内H2O2含量的方法在阐释细胞内信号转换过程和研制一种新的疾病诊断方法至关重要。
目前多数的H2O2检测方法，如色谱法、紫外分光光度法、荧光法等，通常来说上述方法都比较耗时，易受干扰物影响且难以实时且高灵敏的检测。相较之下，电化学分析方法普遍具有灵敏度高、线性测量范围宽、准确度高及操作简易便捷等优点，特别是基于纳米材料修饰的电流型传感器/电化学分析方法受到了广泛的关注。二氧化钌（RuO2）是一种金属氧化物，由于具有较高的质量比电容，优异的导电性、较宽的电位窗口以及高度的氧化还原可逆性等优点，是迄今为止性能最优异的法拉第赝电容材料，对其大部分研究也都集中在电化学电极材料方面。
本发明利用牛血清白蛋白（BSA）作为模板制备二氧化钌纳米粒子（BSA-RuO2NPs），并基于该材料的催化性能构建电化学方法用于检测细胞内H2O2。本发明利用电子自旋共振图谱证明BSA-RuO2NPs催化H2O2产生羟自由基的催化过程，继而用BSA-RuO2NPs修饰电极构建电流与H2O2的浓度的标准曲线，通过抗坏血酸刺激细胞体系产生H2O2，完成细胞中H2O2浓度的实时检测。
发明内容
本发明的目的是利用BSA作为模板制备二氧化钌纳米粒子（BSA-RuO2NPs），并基于该材料的催化性能构建电化学方法用于检测细胞内H2O2。本发明利用电子自旋共振图谱证明BSA-RuO2NPs催化H2O2产生羟自由基的催化过程，继而用BSA-RuO2NPs修饰电极构建电流与H2O2的浓度的标准曲线，通过抗坏血酸刺激细胞体系产生H2O2，完成细胞中H2O2浓度的实时检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子构建的电化学分析方法检测细胞内过氧化氢，其特征是牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子能够催化H2O2生成羟自由基与5, 5-二甲基-1-吡咯啉 N-氧化物相作用，能够高效催化H2O2；所述的牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子由下述方法制备的：将1.6 mL浓度为18.75 mg/mL的牛血清白蛋白与0.4 mL的浓度为75mmol/L三氯化钌混合，在37℃条件下搅拌90分钟以保证混合均匀， 然后用氢氧化钠调节上述体系的pH=11，在70℃条件下充分搅拌反应2.5小时，反应后溶液为黑色；反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，定容2 mL体积后获得浓度为2mg/mL的牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子，4℃保存。
在未存在H2O2的情况下，玻碳电极和牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子修饰的玻碳电极并未检测到明显的氧化还原峰；在裸电极条件下对H2O2的响应可以忽略不计，表明未修饰牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子的玻碳电极应用于电化学H2O2检测性能较差；而牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子修饰的玻碳电极对H2O2有明显的催化作用，在大约-0.5 V出现明显的还原峰。
在1 mmol/L的H2O2条件下，牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子修饰的玻碳电极在不同的扫描速度20-200 mV/s与pH=7.0、0.05 mol/L的PBS的环境下，峰电流随着扫描速度在20-200 mV/s 范围内存在线性关系，相关系数为R2=0.9965，证明H2O2在牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子修饰的玻碳电极的电化学还原过程是典型的表面控制过程。
利用差示脉冲伏安法，在牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子修饰的旋转圆盘电极对H2O2催化过程中，峰电流随着H2O2的浓度增大而增大，峰电流与H2O2浓度在0.40-3850 μmol/L呈线性关系，线性方程为I (μA) = 16628 [H2O2] (mol/L) + 0.8366，R2 = 0.9967，最低检测限为0.18 μmol/L。
多种浓度为200 μmol/L干扰物质：多巴胺，抗坏血酸，尿酸，硫化氢，半胱氨酸，葡萄糖，还原型谷胱甘肽及尿素对该检测体系检测H2O2并无明显影响。
利用抗坏血酸能够刺激MCF-7细胞快速产生H2O2，向数量为2×106的MCF-7细胞加入抗坏血酸刺激后，在-0.5V工作电位下，牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子修饰的旋转圆盘电极有明显的峰电流信号，计算电流响应为0.116 μA，一共等于1.2 μmol/L的H2O2，计算得一个细胞含有0.6 nmol/L的H2O2。
为了实现上述目的，本发明采用具体技术方案为：
（一）BSA-RuO2NPs的制备：
首先，将1.6 mL浓度为18.75 mg/mL的牛血清白蛋白与0.4 mL的浓度为75 mmol/L 三氯化钌混合，在37℃条件下搅拌90分钟以保证混合均匀， 然后用氢氧化钠调节上述体系的pH=11，在70℃条件下充分搅拌反应2.5小时，反应后溶液为黑色。所得溶液经过超滤管三次水洗，为实验所需BSA-RuO2NPs溶液（2 mg/mL），4℃保存。
（二）BSA-RuO2NPs修饰电极的制备：
玻碳电极（GCE）用0.05 mm 的氧化铝粉末抛光至镜面，然后分别用丙酮和二次去离子水超声清洗5分钟，待电极表面干燥后，用滴涂法将6 μL的BSA-RuO2NPs溶液（2 mg/mL）修饰到GCE得到BSA-RuO2NPs/GCE。
（三）构建电化学方法检测H2O2：
利用循环伏安法考察BSA-RuO2NPs/GCE对H2O2的电化学催化作用，继而利用差示脉冲伏安法考察BSA-RuO2NPs修饰的旋转圆盘电极（RDE）对H2O2催化过程中电流与H2O2浓度的关系，构建H2O2浓度的标准曲线。
（四）细胞内H2O2的检测
利用抗坏血酸能够刺激MCF-7细胞快速产生H2O2。当细胞生长至90 %融合度时，用PBS（pH=7）洗涤3次，计MCF-7细胞数为2×106，用10ml的PBS（pH=7）重新分散细胞加入抗坏血酸（终浓度为5 μmol/L）刺激MCF-7细胞产生H2O2进行电化学分析。
本发明的优点：
本发明证实所述的BSA-RuO2NPs可以高效催化H2O2产生羟自由基，利用BSA-RuO2NPs修饰电极及上述催化作用可以构建基于BSA-RuO2NPs的电化学方法用于检测H2O2含量，H2O2的检测线性范围为0.40-3850 μmol/L，最低检测限为0.18 μmol/L。该方法灵敏度高、重现性好、检测速度快，利用抗坏血酸能够刺激MCF-7细胞快速产生H2O2，上述方法可应用于细胞中H2O2含量的检测。
附图说明
图1为BSA-RuO2NPs的制备流程及电化学方法检测胞内H2O2的示意图。
图2为BSA-RuO2NPs催化H2O2的电子自旋共振图谱，图中：从a到c依次是5, 5-二甲基-1-吡咯啉 N-氧化物，5, 5-二甲基-1-吡咯啉 N-氧化物+H2O2 及5, 5-二甲基-1-吡咯啉N-氧化物+ H2O2+BSA-RuO2NPs。
图3为各环境下的循环伏安曲线图，图中从a到d依次分别为未修饰的GCE、H2O2 +GCE、BSA-RuO2NPs/GCE 和H2O2 + BSA-RuO2NPs/GCE在扫描速度为50 mV/s 与pH=7.0（0.05mol/L的PBS）的环境下的循环伏安曲线。
图4为1 mM的H2O2 + BSA-RuO2NPs/GCE在不同的扫描速度（20-200 mV/s）与pH=7.0（0.05 mol/L的PBS）的环境下的循环伏安曲线。
图5为阴极电流响应和扫描速率的线性。
图6为BSA-RuO2NPs修饰的旋转圆盘电极（BSA-RuO2NPs/RDE）的电流值曲线，该电极将不同浓度的H2O2加入到持续搅拌的pH=7.0（0.05 mol/L的PBS）中，电位为-0.5 V。
图7为不同浓度H2O2与响应电流的线性。
图8为分别连续加入浓度为200µM的干扰物质，图中：（a）多巴胺，（b）抗坏血酸，（c）尿酸，（d）硫化氢，（e）半胱氨酸，（f）葡萄糖，（g）还原型谷胱甘肽及尿素，对BSA-RuO2NPs/RDE +100 µM H2O2的电流响应值。
图9为先后向MCF-7细胞（数量为2×106）加入抗坏血酸或过氧化氢酶，在-0.5V工作电位下测试上述溶液与BSA-RuO2NPs/RDE的电流-时间信号。图中：（a）PBS+MCF-7细胞，（b）PBS+抗坏血酸/过氧化氢酶+MCF-7细胞。
具体实施方式
实例1：
BSA-RuO2NPs的制备方法如下：将1.6 mL浓度为18.75 mg/mL的牛血清白蛋白与0.4 mL的浓度为75 mmol/L三氯化钌混合，在37℃条件下搅拌90分钟以保证混合均匀， 然后用氢氧化钠调节上述体系的pH=11，在70℃条件下充分搅拌反应2.5小时，反应后溶液为黑色。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次。定容2 mL体积后为实验所需牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子（2 mg/mL），4℃保存。图1为BSA-RuO2NPs的制备流程及电化学方法检测胞内H2O2的示意图。
实例2：
自由基捕获剂能够成功的检测体内或体外生成的超氧自由基和羟基自由基等。5, 5-二甲基-1-吡咯啉 N-氧化物为常用的羟自由基捕获剂，如图2的电子自旋共振图谱所示，实例1制得的BSA-RuO2NPs能够催化H2O2生成羟自由基与5, 5-二甲基-1-吡咯啉 N-氧化物相作用，因此证明BSA-RuO2NPs能够高效催化H2O2。
实例3：
利用循环伏安法考察实例1制得的BSA-RuO2NPs/GCE对H2O2的电化学催化作用，如图3所示，从a到d依次分别为未修饰的GCE、H2O2 + GCE、BSA-RuO2NPs/GCE 和H2O2 + BSA-RuO2NPs/GCE在扫描速度为50 mV/s 与pH=7.0（0.05 mol/L的PBS）的环境下的循环伏安曲线。在未存在H2O2的情况下，GCE（a）和BSA-RuO2NPs/GCE（c）并未检测到明显的氧化还原峰。在裸GCE（b）条件下对H2O2的响应可以忽略不计，表明未修饰BSA-RuO2NPs的GCE应用于电化学H2O2检测性能较差。如（d）所示，BSA-RuO2NPs/GCE对H2O2有明显的催化作用，在大约-0.5 V出现明显的还原峰，峰电流为50.54 µA。
实例4：
考察了1 mmol/L的H2O2下，实例1制得的BSA-RuO2NPs/GCE在不同的扫描速度（20-200mV/s）与pH=7.0（0.05 mol/L的PBS）的环境下，峰电流随着扫描速度的变化关系。如图4与图5所示，峰电流随着扫描速度在20-200 mV/s 范围内存在线性关系，相关系数为R2=0.9965，证明H2O2在BSA-RuO2NPs/GCE的电化学还原过程是典型的表面控制过程。
实例5：
利用差示脉冲伏安法考察实例1制得的BSA-RuO2NPs/RDE对H2O2催化过程中峰电流与H2O2浓度的关系。如图6所示为BSA-RuO2NPs/RDE，峰电流随着H2O2的浓度增大而增大，如图7所示，峰电流与H2O2浓度在0.40 μmol/L至3850 μmol/L呈线性关系，线性方程为I (μA) =16628 [H2O2] (mol/L) + 0.8366 (R2 = 0.9967)，最低检测限为0.18 μmol/L。
实例6：
考察了多种干扰物质对上述检测H2O2的方法的影响。如图8所示，分别连续加入浓度为200 μmol/L的干扰物质，（a）多巴胺，（b）抗坏血酸，（c）尿酸，（d）硫化氢，（e）半胱氨酸，（f）葡萄糖，（g）还原型谷胱甘肽及尿素，如图8所示，上述干扰物质对实例1制得的BSA-RuO2NPs/RDE+100 μmol/L H2O2的峰电流无明显影响，说明该体系对H2O2具有较好的专一性，由此可见本发明的方法可靠适用。
实例7：
为考察上述检测方法应用于细胞内的H2O2检测。利用抗坏血酸能够刺激MCF-7细胞快速产生H2O2，再结合上述检测方法进行检测。如图9所示，向MCF-7细胞（数量为2×106）加入抗坏血酸刺激后，在-0.5V工作电位下，实例1制得的BSA-RuO2NPs/RDE有明显的峰电流信号，计算电流响应为0.116 μA（等于1.2 μmol/L的H2O2），计算得一个细胞含有0.6 nmol/L的H2O2，继而加入过氧化氢酶清除H2O2后，峰电流信号降低。由此可见本发明的方法可靠适用。
Claims (6)
1.一种基于牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子构建的电化学分析方法检测细胞内过氧化氢，其特征是牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子能够催化H2O2生成羟自由基与5, 5-二甲基-1-吡咯啉 N-氧化物相作用，能够高效催化H2O2；所述的牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子由下述方法制备的：将1.6 mL浓度为18.75 mg/mL的牛血清白蛋白与0.4 mL的浓度为75mmol/L三氯化钌混合，在37℃条件下搅拌90分钟以保证混合均匀， 然后用氢氧化钠调节上述体系的pH=11，在70℃条件下充分搅拌反应2.5小时，反应后溶液为黑色；反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，定容2 mL体积后获得浓度为2mg/mL的牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子，4℃保存。
2.根据权利要求1所述的基于牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子构建的电化学分析方法检测细胞内过氧化氢，其特征是在未存在H2O2的情况下，玻碳电极和牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子修饰的玻碳电极并未检测到明显的氧化还原峰；在裸电极条件下对H2O2的响应可以忽略不计，表明未修饰牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子的玻碳电极应用于电化学H2O2检测性能较差；而牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子修饰的玻碳电极对H2O2有明显的催化作用，在大约-0.5 V出现明显的还原峰。
3.根据权利要求1所述的基于牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子构建的电化学分析方法检测细胞内过氧化氢，其特征是在1 mmol/L的H2O2条件下，牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子修饰的玻碳电极在不同的扫描速度20-200 mV/s与pH=7.0、0.05 mol/L的PBS的环境下，峰电流随着扫描速度在20-200 mV/s 范围内存在线性关系，相关系数为R2=0.9965，证明H2O2在牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子修饰的玻碳电极的电化学还原过程是典型的表面控制过程。
4.根据权利要求1所述的基于牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子构建的电化学分析方法检测细胞内过氧化氢，其特征是利用差示脉冲伏安法，在牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子修饰的旋转圆盘电极对H2O2催化过程中，峰电流随着H2O2的浓度增大而增大，峰电流与H2O2浓度在0.40-3850 μmol/L呈线性关系，线性方程为I (μA) = 16628 [H2O2] (mol/L) +0.8366，R2 = 0.9967，最低检测限为0.18 μmol/L。
5.根据权利要求1所述的基于牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子构建的电化学分析方法检测细胞内过氧化氢，其特征是多种浓度为200 μmol/L干扰物质：多巴胺，抗坏血酸，尿酸，硫化氢，半胱氨酸，葡萄糖，还原型谷胱甘肽及尿素对该检测体系检测H2O2并无明显影响。
6.根据权利要求1所述的基于牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子构建的电化学分析方法检测细胞内过氧化氢，其特征是利用抗坏血酸能够刺激MCF-7细胞快速产生H2O2，向数量为2×106的MCF-7细胞加入抗坏血酸刺激后，在-0.5V工作电位下，牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子修饰的旋转圆盘电极有明显的峰电流信号，计算电流响应为0.116 μA，一共等于1.2 μmol/L的H2O2，计算得一个细胞含有0.6 nmol/L的H2O2。
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