CN109771645A

CN109771645A - 一种二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料的制备及其应用

Info

Publication number: CN109771645A
Application number: CN201910172121.7A
Authority: CN
Inventors: 蒋邦平; 黄荣涛; 沈星灿; 罗紫兰
Original assignee: Guangxi Normal University
Current assignee: Guangxi Normal University
Priority date: 2019-03-07
Filing date: 2019-03-07
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2039-03-07
Also published as: CN109771645B

Abstract

本发明公开了一种二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料的制备及其应用，该纳米材料是以水合三氯化钌、氨水为原料，先合成纳米级别的二氧化钌，再复合到卵清蛋白上制备得到。本发明的制备方法操作简单、方便，原料便宜易得，且制备的纳米材料具有细胞毒性小、生物相容性好等特点。而且，二氧化钌纳米材料在近红外区域有吸收，复合到卵清蛋白上后的纳米材料水溶性好，具有良好的诱导抗肿瘤免疫能力；且具有光敏作用，在红外或近红外光的照射下，产生活性氧；且能催化肿瘤中的过氧化氢产生氧气，可解决肿瘤乏氧，有利于进一步光动力治疗。本发明制备的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料可以用于光热光动力免疫联合治疗癌症，在癌症治疗领域具有广阔的应用前景。

Description

一种二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料的制备及其应用

技术领域

本发明涉及复合纳米材料，具体是一种二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料的制备及其应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗(Immunotherapy)就是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。肿瘤光热疗法（Photothermal therapy,PTT）是一种通过光热转换剂将光能转化为热能使肿瘤组织达到一定温度进而杀死癌细胞的疗法。光动力疗法（Photodynamic therapy,PDT）,则是光动力试剂在激光的照射下产生活性氧进而使肿瘤组织活性氧水平提高，继而杀死癌细胞的新型癌症治疗方法，但容易出现肿瘤乏氧微环境，肿瘤中存在过氧化氢，若能催化过氧化氢产生氧气，则可以解决肿瘤乏氧，有利于进一步光动力治疗。

相对于传统的手术治疗、化疗和放疗来说，PTT和PDT具有创伤小、毒性低微、可重复治疗等优点，免疫治疗具有抑制远程肿瘤、防止肿瘤复发的优点。因此，光热光动力免疫治疗是很有发展前景的癌症治疗方式。然而，仅依靠癌症免疫治疗可能无法使原发性肿瘤消融。PTT和PDT是一种很有前途的使原发性肿瘤消融治疗方式，它可以通过简单的光照射来根治肿瘤，同时通过免疫原性细胞死亡来触发免疫反应，增强抗肿瘤免疫。传统的光热治疗转换剂主要是金纳米材料和碳纳米材料，这些纳米材料虽然也可以消融肿瘤，但不能解决肿瘤乏氧微环境，而免疫治疗需要免疫佐剂，大大限制了上述纳米材料在光热光动力免疫治疗领域的实际应用。因此，开发新型的低毒性、热稳定性好、缓解肿瘤乏氧且能较好诱导免疫细胞成熟的纳米材料成为现在光热光动力免疫治疗研究的热点问题。

在癌症疫苗中，免疫佐剂是导致免疫应答增加的主要成分，能较好诱导免疫细胞成熟。卵清蛋白(OVA)作为一种天然载体，也是一种免疫佐剂，但其没有光热性能。随着二氧化钌应用的多元化，越来越多的人将它应用于癌症治疗的研究。同时，研究还发现二氧化钌纳米材料在近红外区域具有吸收，良好光热转换效率和光热稳定性等优点，在光热治疗，药物载体等方面拥有极大的应用前景。

近年来，癌症的免疫治疗取得了很大的发展，而有关二氧化钌复合纳米材料的癌症免疫治疗未见报道。CN104124071A“一种二氧化钌基复合纳米材料及其制备方法” 涉及一种超级电容器用二氧化钌/金属纳米颗粒/碳复合电极材料，主要用于超级电容器电极。二氧化钌基复合纳米材料的制备也没有涉及卵清蛋白。

因此，制备出一种具有光热光动力免疫应用的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料，并研究其光热光动力免疫效果很有必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料的制备及其应用，研究发现，二氧化钌能催化双氧水产生氧气，这有助于缓解肿瘤乏氧微环境，本发明将二氧化钌纳米材料复合到卵清蛋白上，使其具有良好的生物相容性,既具有了光热光动力以及缓解肿瘤乏氧微环境的性能，又具有了诱导抗肿瘤免疫的能力。

本发明一种二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

1）称取一定量的水合三氯化钌溶于蒸馏水，搅拌均匀，备用；

2）在步骤1）溶液中加入氨水调节溶液pH=9，得到有黑色沉淀的溶液；

3）将步骤2）溶液用离心机离心，离心所得沉淀经水洗后再离心，得到黑色沉淀；

4）将步骤3）得到的黑色沉淀在氮气中加热，得到纳米级别的二氧化钌；

5）取一定量步骤4）所得的二氧化钌,购买的卵清蛋白加入到水中超声，得最终产物二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料。

上述方法中，步骤1）所述水合三氯化钌与蒸馏水的质量比为4:100。

上述方法中，步骤4）所述在氮气中加热，加热温度为200℃，加热时间为2h。

上述方法中，步骤5）所述二氧化钌，卵清蛋白，水的质量比为1:1:1000，超声时间为30min。

二氧化钌市场上有现有产品，但现有产品不是纳米级别的，不能直接复合到卵清蛋白上，因此本发明方法，先制备得到纳米级别的二氧化钌，再将其复合到卵清蛋白上，得到最终产物。

本发明二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料其制备方法的优点是：原料便宜、易得；操作简单，方便，制备条件简易，产率高。

本发明制备的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料，经实验分析，可以缓解肿瘤乏氧微环境，具有良好的光敏作用，具有良好的光动力效果。制备的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料，能诱导免疫细胞成熟，导致抗肿瘤免疫的产生，可以将这种二氧化钌复合卵清蛋白纳米粒应用于光热光动力免疫治疗中，对肿瘤的治疗有非常好的前景，利用肿瘤微环境中存在过氧化氢，且二氧化钌复合卵清蛋白纳米粒催化过氧化氢产生氧气可以缓解肿瘤乏氧微环境，利用其光热转换功能在红外光照射下，随着光照时间的增加，温度提高，达到一定温度杀死癌细胞，造成免疫原性细胞死亡，诱导免疫应答；利用其光敏热性在激光照射下，产生活性氧，继而杀死癌细胞；利用免疫原性细胞死亡诱导免疫应答作用，可以抑制远程细胞，防止肿瘤复发。

附图说明

图1为实施例1二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料和水的光热升温图；

图2 为实施例1二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料催化过氧化氢产生氧气；

图3 为实施例1二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料孵育BMDC细胞后的成熟情况；

图4 为实施例1二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料在加入DPBF后不同光照时间的吸光度。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。

二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料的制备实施例1：

1）称取0.4g水合三氯化钌，加入10mL蒸馏水，搅拌使其溶解完全，得水合三氯化钌溶液；

2）在水合三氯化钌溶液中加入氨水调节溶液pH=9,反应30min，得到有黑色沉淀的溶液；

3）将步骤2）溶液用离心机离心，离心机转速为10000r/min,离心10min；离心所得沉淀经过两次水洗后，再离心，得到黑色沉淀；

4）将步骤3）所得沉淀在氮气中加热，加热温度为200℃，加热2h，得到纳米级别的二氧化钌；

5）取0.1g步骤4）所得的二氧化钌，0.1g卵清蛋白加入到100mL水中超声30min，即得到二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料。

实施例2

二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料的制备：

3）将步骤2）溶液用离心机离心，离心转速为10000r/min,离心10min；离心所得沉淀经过两次水洗后，再离心，得到黑色沉淀；

5）取0.01g步骤4）所得的二氧化钌，0.01g卵清蛋白加入到10mL水中超声30min，即得到二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料。

实施例3

二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料的制备：

5）取0.05g步骤4）所得的二氧化钌，0.05g卵清蛋白加入到50mL水中超声30min，即得到二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料。

实施例1、2、3制备的产物都能良好分散于水溶液中，且能稳定存在，都能光热升温至肿瘤消融温度，都能催化过氧化氢产生氧气，都能诱导抗肿瘤免疫，都具有光动力效果。

将实施例1制备所得的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料配置成浓度400µg/mL水溶液，用808nm激光(1W/cm²)照射，用红外热成像仪记录溶液的温度随光照时间的变化，如图1所示。由图可知，随着光照时间的增加，二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料的温度显著升高，并在10分钟内温度从27℃升高到60℃，而纯水在相同光照条件下仅升高不到1℃。由此可以说明制备的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料可以光热升温至肿瘤消融的温度。

将实施例1制备的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料配置成浓度400µg/mL水溶液，往其中加入1mM/L的过氧化氢溶液，用溶氧测定仪测定其氧气产生与时间的关系曲线，并与不加过氧化氢的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料对比，如图2所示。由图可知，二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料可以催化过氧化氢产生氧气，可缓解肿瘤乏氧。

将实施例1制备的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料用生理盐水配置成浓度400µg/mL的溶液，加入到骨髓来源的树突状细胞中孵育12h，然后收集细胞，双染CD80和CD86，上流式细胞术，如图3所示。由图可知，孵育后，高表达CD80和CD86，证实制备的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料具有诱导抗肿瘤免疫的能力。

将实施例1制备所得的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料配置成浓度400µg/mL的水溶液，加入活性氧检测试剂DPBF，在808nm激光的照射下用紫外测试DPBF在不同光照时间后的吸光度，如图4所示。由图可知，随着光照时间的增加，DPBF在418nm处的特征吸收峰逐渐下降，这是由于DPBF在活性氧存在的条件下被活性氧氧化造成的。实验结果表明，合成的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料具有光敏作用，在光的照射下具有光动力效果，可应用于光热光动力免疫联合治疗中。

Claims

1.一种二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

5）取一定量步骤4）所得的二氧化钌，购买的卵清蛋白加入到水中超声，得最终产物二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）所述水合三氯化钌与蒸馏水的质量比为4:100。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）所述在氮气中加热，加热温度为200℃，加热时间为2h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）所述二氧化钌，卵清蛋白，水的质量比为1:1:1000，超声时间为30min。

5.用权利要求1～4之一所述的方法制备得二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料。

6.权利要求5制备的二氧化钌复合卵清蛋白纳米材料能够缓解肿瘤乏氧微环境，应用于光热光动力免疫联合治疗中。