CN102645473A - 高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰的电极及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及材料和电化学领域，公开了一种修饰电极，包括玻碳电极，以及玻碳电极表面由内向外依次修饰的高岭土纳米管层、血红蛋白层和离子液体层。制备方法为将含有高岭土纳米管的壳聚糖溶液、含有血红蛋白的壳聚糖溶液及离子液体滴加到玻碳电极表面。这种修饰电极可用作电化学生物传感器，尤其是检测过氧化氢。
Description
技术领域
本发明涉及材料和电化学领域，具体为一种修饰电极和电化学生物传感器，尤其是高岭土纳米管、血红蛋白和离子液体复合膜修饰的电极和电化学生物传感器。
背景技术
在生命过程中，人和动物的代谢作用及各种生理现象绝大多数都与电流和电势的变化密切相关。蛋白质和酶等生物大分子是构成生命的主要基元，参与完成生命体中的新陈代谢、神经传导、光合作用、呼吸过程、大脑的思维、基因的传递等许多生理过程，同时在这些生命过程中很多蛋白质和酶都要经历其氧化型-还原型之间的相互转化并发生电子转移过程。电子传递在生命过程中是普遍存在的并且是生命过程的基本运动。从某种意义上讲，研究生命过程实质上就是研究生物体中的电子传递过程。因此，用电化学方法来研究蛋白质的电子传递过程有着特别的优越性。研究氧化还原蛋白质的直接电化学不仅可以提供能量转换和代谢过程的生命信息，而且为第三代生物传感器的制备奠定了理论基础。目前，蛋白质直接电化学主要研究一些简单的，结构和功能比较清楚的氧化还原蛋白质，如细胞色素c、血红蛋白、肌红蛋白、辣根过氧化物酶等。构建基于氧化还原蛋白质和酶的第三代电化学生物传感器可以满足医学、环境监测和工业快速分析的必要，必将成为这个领域的发展趋势。
高岭土纳米管(HNTs)是经天然沉积形成的硅酸铝盐材料，有球形、板状和管状结构，以管状最为常见。高岭土纳米管是经天然卷曲形成的管状结构，表现中空管状结构，典型的纳米级尺寸、大的长径比，与蒙脱土相比具有资源丰富、白度高等特点，且比其他纳米材料价格便宜(如碳纳米管)。自1826年报道以来得 到科学界的广泛关注，其理想化学式为Al2Si2O5(OH)4·nH2O，高岭土管内表面是铝原子占据中心位置、氧原子或羟基占据顶点位置[(OH)6Al4(OH)2]4+(水铝矿)型八面体结构，外表面是(Si4O10)4-四面体型结构，在此结构中硅原子占据四面体的中心位置，氧原子位于四面体的顶点位置，所以称之为l∶l型二八面体层状硅酸铝盐矿物。离子液体作为一种绿色溶剂近年来正日益受到研究关注，主要是因为它具有较高的化学和热力学稳定性、良好的导电能力、极小的蒸汽压以及较宽的电化学窗口等独到的常规溶液所不能比拟的优点。尤其是室温离子液体良好的电化学稳定性以及能够保持并增强酶的活性的能力，使它在生物和生物电化学领域具有良好的应用前景。
发明内容
本发明旨在提供一种高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰电极。
本发明提供上述修饰电极的制备方法。
本发明还提供了上述高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰电极作为电化学生物传感器的应用，用于检测过氧化氢。
这种基于高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜的修饰电极包括玻碳电极，以及玻碳电极表面由内向外依次修饰的高岭土纳米管层、血红蛋白层和离子液体层。
离子液体层优选为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM]BF4)。
制备方法为依次将含有高岭土纳米管的壳聚糖溶液、含有血红蛋白的壳聚糖溶液及离子液体滴加到玻碳电极表面。
具体制备方法包括如下步骤：
(1)将高岭土纳米管超声分散于浓度为1～4mg/mL的壳聚糖溶液中，得到高岭土纳米管壳聚糖溶液；高岭土纳米管与壳聚糖溶液的用量比为3～8mg/mL；高岭土纳米管的长度为1～15μm，外管径50～70nm，内管径10～30nm；
玻碳电极打磨抛光、洗涤干燥后，在表面滴加高岭土纳米管壳聚糖溶液并自然干燥；
(2)步骤(1)处理后的玻碳电极表面滴加含有血红蛋白的壳聚糖溶液，并干燥；溶液中壳聚糖含量1～4mg/mL，血红蛋白含量5～20mg/mL；
(3)继续滴加离子液体形成高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰电极；优选的离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM]BF4)离子液。
本发明利用高岭土纳米管具有生物相容性好、比表面积大等优点，将其与生物相容性和导电性能好的室温离子液体(ILs)1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐进行复合，构建HNTs/ILs纳米复合膜，将其作为生物载体材料来固定血红蛋白，实现血红蛋白的直接电子传递，构筑基于Hb/HNTs/ILs的第三代H2O2传感器(对于细胞色素c、肌红蛋白、辣根过氧化物酶等氧化还原蛋白质和酶同样适用)。该生物传感器对检测过氧化氢具有灵敏度高、检测限低、线性范围宽等优点。
基于以上这些显著特点本发明涉及一种为蛋白质、酶提供了友好的生物微环境的纳米复合膜的制备及其应用。将高岭土纳米管分散在溶液中进而修饰在电极表面，由于纳米管的外表面带负电，内表面带正电，所以可以很好的吸附咪唑阳离子，形成HNTs/ILs的纳米复合膜。
本发明将血红蛋白固载在HNTs/ILs的纳米复合膜中，构建基于高岭土纳米管、血红蛋白和离子液体纳米复合膜(Hb/HNTs/ILs)的H2O2电化学生物传感器，其特点及其应用为：高岭土纳米管和离子液体(HNTs/ILs)纳米复合膜的制备方法简单，便于操作。这种基于Hb/HNTs/ILs的过氧化氢生物传感器对检测H2O2具有灵敏度高、检测限低、线性范围宽等优点。
附图说明
图1为高岭土纳米管的透射电镜图
图2为高岭土纳米管的氮气吸附/脱附曲线
图3为Hb/HNTs/ILs纳米复合膜紫外可见光谱图(a)HNTs；(b)Hb；(c)Hb/ILs；d)Hb/HNTs/ILs
图4为Hb/HNTs/ILs纳米复合膜修饰电极在氮气保护的环境下在0.1M PBS溶液(pH 7.0)中连续加入H2O2的循环伏安曲线，扫速100mV·s-1，插图为还原 峰电流与加入的过氧化氢浓度的线性关系
具体实施方式
实验试剂
高岭土纳米管(HNTs，Natural Nano.Inc.长度为1～15μm，外管径50～70nm，内管径10～30nm)，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM]BF4)(杭州科默化学有限公司)，牛血红蛋白(上海生物化学试剂公司，未经进一步纯化)，30％过氧化氢(H2O2)溶液(上海化学试剂公司)，不同pH值的磷酸缓冲溶液(PBS，0.1mol/L)由Na2HPO4和NaH2PO4按不同比例配置而成，壳聚糖(Chi，90％脱乙酰化，国药集团)。所用试剂均为分析纯试剂，所有溶液均用二次蒸馏水配制。
壳聚糖溶液制备方法为，将壳聚糖溶解在稀释的醋酸溶液中(醋酸与去离子水的体积比为0.5～1.5∶100，优选为1∶100)，通过加入1.0mol/L的氢氧钠溶液而调节壳聚糖溶液的pH至5.0，然后用0.45μm的纤维滤膜过滤。
实施例1Hb/HNTs/ILs修饰电极的制备
实验开始前首先用2#、5#金相砂纸抛光打磨玻碳电极，再用0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉抛光，冲洗去表面污物，然后依次在1∶1的HNO3、无水乙醇、二次蒸馏水中分别超声2分钟，最后将处理好的电极用氮气吹干。
高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰电极(Hb/HNTs/ILs)的制备过程如下：首先5mg高岭土纳米管溶解到1ml浓度为3mg/mL的壳聚糖溶液中超声分散得到5mg/mL高岭土壳聚糖溶液(HNTs/Chi)溶液；血红蛋白溶解到浓度为3mg/mL的壳聚糖溶液中振荡溶解制备10mg/mL(Hb/Chi)溶液。
(1)将4μLHNTs/Chi溶液滴到处理好的玻碳电极上，室温下自然干燥。
(2)然后再滴4μL Hb/Chi溶液制备Hb/HNTs修饰电极。
(3)最后，取4μL[BMIM]BF4离子液体(ILs)滴到上述修饰电极上，形成Hb/HNTs/ILs纳米复合膜电极，将该修饰电极置于4℃冰箱中晾干。
高岭土纳米管的投射电镜图如图1所示，长度在1～5μm，直径50～150nm，内径10～30nm。高岭土纳米管的氮气吸附/脱附曲线如图2所示。
高岭土纳米管(HNTs)、血红蛋白(Hb)、血红蛋白/离子液体复合物(Hb/ILs) 及修饰电极表层的高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜(Hb/HNTs/ILs)紫外可见光谱图如图3中的曲线a～d所示。
实施例2Hb/HNTs/ILs修饰电极对H2O2的电化学检测
将实施例1得到的修饰电极置于pH＝7.0的PBS缓冲溶液中，随着H2O2的不断加入还原峰电流不断增加，显示了一个典型的电催化还原H2O2的过程。
实施例3 Hb/HNTs/ILs修饰电极对H2O2的电化学定量检测
将实施例1得到的修饰电极置于PBS缓冲溶液中，随着H2O2的不断加入还原峰电流不断增加，以还原峰电流对加入的H2O2的浓度作图得到该传感器检测H2O2的线性范围为7.5×10-6～9.75×10-5M，检测限为2.4μM(S/N＝3)，灵敏度为10.51μAmM-1(由图4计算可得)。这些实验结果表明所制备的H2O2传感器检测限低，灵敏度高，线性范围宽等优点。
Claims (7)
1.一种高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰电极，其特征在于，包括玻碳电极，以及玻碳电极表面由内向外依次修饰的高岭土纳米管层、血红蛋白层和离子液体层。
2.权利要求1所述高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰电极，其特征在于，所述的离子液体层为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。
3.权利要求1或2所述高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰电极的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将高岭土纳米管超声分散于1～4mg/mL壳聚糖溶液中；高岭土纳米管与壳聚糖溶液的用量比为3～8mg/mL；
玻碳电极打磨抛光、洗涤干燥后，在表面滴加高岭土纳米管壳聚糖溶液并自然干燥；
（2）步骤（1）处理后的玻碳电极表面滴加含有血红蛋白的壳聚糖溶液，并干燥；溶液中壳聚糖含量1～4mg/mL，血红蛋白含量5～20mg/mL；
（3）在步骤（2）处理过的玻碳电极表面继续滴加离子液体，形成高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰电极。
4.权利要求3所述高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰电极的制备方法，其特征在于，所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。
5.权利要求3所述高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰电极的制备方法，其特征在于，所述高岭土纳米管的长度为1～15μm，外管径50～70nm，内管径10～30nm。
6.权利要求1或2所述高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰电极在制备电化学传感器方面的应用。
7.权利要求1或2所述高岭土纳米管/血红蛋白/离子液体纳米复合膜修饰电极在检测过氧化氢方面的应用。
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