CN103308573B - 石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法 - Google Patents

石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法，依次按照以下步骤实施：制备氧化石墨烯；制备石墨烯负载二氧化钛复合材料；制备玻碳电极；制备修饰玻碳电极。本发明石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法，工艺方法简单，原料易得，无污染。本发明所制备的产品实现辣根过氧化酶与电极的直接电子转移，具有检出限低，响应时间短，生物亲和性好，灵敏度高，稳定性好等优点。

Description

石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法
技术领域
本发明属于材料制备及电化学技术领域，涉及一种电化学生物传感器的制备方法，具体涉及一种石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法。
背景技术
辣根过氧化氢酶是一种典型的氧化还原酶，辣根过氧化物酶（HRP）具有活性高，稳定好，分子量小及易制备等特点，所以最常用在传感器电极方面。其生理作用是催化H2O2还原以及以H2O2为中间产物的众多底物的氧化，可以通过吸附、共价键合、溶胶-凝胶法及聚合物包埋等方法固定在电极表面。
TiO2纳米材料具有优异的生物相容性、高的电导率和低成本等特点，而且将TiO2纳米材料作为修饰材料应用，可以促进酶与电极表面间电子的转移。因此，该材料常应用于电化学生物传感器方面，具有其它很多材料无法比拟的优点。自从报道了石墨烯材料，以石墨烯为基体制成的电化学生物传感器在电化学领域得到广泛的关注。石墨烯材料主要具有很高的电子传输性能、低密度、高强度、大的比表面积以及二维的晶体结构，这就促使石墨烯可以作为支撑材料来应用。
近年来，TiO2电化学生物传感器只是单纯的将TiO2作为修饰材料来固定生物酶，利用TiO2的生物亲和性，来保护酶的生物活性。但是由于TiO2导电性差，从而很难实现酶与电极的直接电子转移，也限制了它的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法，解决了现有TiO2电化学生物传感器导电性差导致应用受限制的问题。
本发明所采用的技术方案是，石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1：制备氧化石墨烯；
步骤2：制备石墨烯负载二氧化钛复合材料；
步骤3：制备玻碳电极；
步骤4：制备修饰玻碳电极。
本发明的特点还在于，
其中的步骤1制备氧化石墨烯，具体按照以下步骤实施：按照质量-体积浓度为1：40g/ml，称取氧化石墨分散于去离子水中，超声3h，离心后取上清液得到氧化石墨烯粉体。
其中的步骤2制备石墨烯负载二氧化钛复合材料，具体按照以下步骤实施：取无水乙醇，加入摩尔浓度为0.4-1mmol/L的盐溶液，搅拌10-30min，得到无水乙醇盐溶液，加入步骤1得到的氧化石墨烯粉体，搅拌，得到混合溶液，滴入钛酸丁酯，搅拌10min，陈化3-6h，离心洗涤，干燥，置于氩气气氛炉中煅烧处理，得到石墨烯负载二氧化钛复合材料。
其中的盐溶液采用氯化钾，硝酸钾，氯化钠或硝酸钠中的一种。
其中的无水乙醇与盐溶液的体积比为1：750-250。
其中的氧化石墨烯粉体与无水乙醇盐溶液的质量-体积比为1：15mg/ml-1：10mg/ml。
其中的钛酸丁酯与混合溶液的体积比为1：600-120。
其中的煅烧处理，300℃之前升温速率为2℃/min，在300℃-500℃之间时，升温速率为1℃/min，500℃保温2h。
其中的步骤3制备玻碳电极，具体按照以下步骤实施：将玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝粉进行抛光，再用去离子水对电极表面进行超声清洗20～30min，最后用氮气吹干电极表面，得到干净的玻碳电极。
其中的步骤4制备修饰玻碳电极，具体按照以下步骤实施：用NaH2PO3和Na2HPO3配制成浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液；取步骤2得到的石墨烯负载二氧化钛复合材料，在搅拌条件下借助超声波分散于去离子水中，得到石墨烯负载TiO2溶液，TiO2溶液中mTiO2：VH2O为2：1；
取辣根过氧化物酶分散于pH7.0，浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液中，混合均匀，得到HRP溶液，HRP溶液中mHRP：VPBS=10：1；
再吸取所述的石墨烯负载TiO2溶液滴入HRP溶液中，超声波分散20～30min，最后在上述混合溶液中，加入5wt%全氟磺酸溶液；超声波分散5min，得到修饰悬浮液，修饰悬浮液中包含物质浓度分别为：2.5mg/mL HRP、1mg/mL TiO2和1.25wt%全氟磺酸；
取所述的修饰悬浮液涂覆于步骤3得到的玻碳电极表面，在室温下阴干，得到石墨烯负载二氧化钛纳米微球包埋辣根素过氧化氢酶修饰玻碳电极。
本发明的有益效果是：本发明所采用的工艺方法简单，原料易得，无污染。本发明所制备的产品实现辣根过氧化酶与电极的直接电子转移，具有检出限低，响应时间短，生物亲和性好，灵敏度高，稳定性好等优点。
附图说明
图1为本发明实施例1中石墨烯负载二氧化碳纳米微球材料的X射线衍射分析XRD图；
图2为本发明实施例1中石墨烯负载二氧化碳纳米微球材料的放大倍数为20万倍扫描电子显微镜SEM图；
图3为本发明实施例1中石墨烯负载二氧化碳纳米微球材料的放大倍数为35万倍扫描电子显微镜SEM图；
图4本发明实施例3中不同材料修饰玻碳电极的循环伏安曲线；
图5本发明实施例4中修饰电极在pH7.0，0.1mol/L的PBS缓冲液中不同扫速的循环伏安曲线；
图6为本发明实施例5中修饰电极在不同pH值的PBS缓冲溶液中测得的循环伏安曲线；
图7为本发明实施例6中含有不同浓度过氧化氢的PBS缓冲溶液检测的循环伏安曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1：氧化石墨烯的制备。氧化石墨烯采用改进的Hummers法制备，按照质量-体积浓度为1：40g/ml，称取氧化石墨分散于去离子水中，超声3h，离心后取上清液得到氧化石墨烯粉体。
步骤2：石墨烯负载二氧化钛纳米微球复合材料的制备。取无水乙醇，加入摩尔浓度为0.4-1mmol/L的盐溶液，无水乙醇与盐溶液的体积比为1：750-250；盐溶液采用氯化钾，硝酸钾，氯化钠或硝酸钠中的一种。
搅拌10-30min，加入步骤1得到的氧化石墨烯粉体，氧化石墨烯粉体与上述混合溶液的比例为1：15mg/ml-1：10mg/ml。搅拌一定时间，缓慢滴入钛酸丁酯，钛酸丁酯与混合溶液的比例为1：600-120。搅拌10min，陈化3-6h，离心洗涤，干燥，并将其置于氩气气氛炉中煅烧处理，300℃之前升温速率为2℃/min。在300℃-500℃之间时，升温速率为1℃/min。500℃保温2h，得到石墨烯负载二氧化钛复合材料。
步骤3：干净玻碳电极的制备。将玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉进行抛光，再用去离子水对电极表面进行超声清洗20～30min，最后用氮气吹干电极表面，得到干净的裸玻碳电极。
步骤4：修饰玻碳电极的制备。用NaH2PO3和Na2HPO3配制成PBS（0.1mol/L）缓冲液；取步骤2得到的石墨烯负载二氧化钛复合材料，在搅拌条件下借助超声波分散于去离子水中，得到石墨烯负载TiO2溶液，TiO2溶液中mTiO2：VH2O=2：1；
取辣根过氧化物酶（HRP）分散于PBS（pH7.0，0.1mol/L）缓冲液中，使其混合均匀，得到HRP溶液。HRP溶液中mHRP：VPBS=10：1；
再吸取上述配制的石墨烯负载TiO2溶液滴入HRP溶液中，超声波分散20～30min，最后在上述溶液中，加入5wt%Nafion（全氟磺酸）溶液；超声波分散5min，得到修饰悬浮液。修饰悬浮液中包含物质浓度分别为：2.5mg/mL HRP、1mg/mL TiO2和1.25wt%Nafion。
取上述悬浮液涂覆于干净的玻碳电极表面，在室温下阴干，得到石墨烯负载二氧化钛纳米微球包埋辣根素过氧化氢酶修饰玻碳电极，将其保存在4℃的冰箱中使用。
实施例1
氧化石墨烯采用改进的Hummers法制备，取1g预先制备的氧化石墨，分散于40mL去离子水中，超声3h。离心后取上清液得到氧化石墨烯。取200-400mL无水乙醇，加入0.5-2.0mL浓度为0.4mmol/L的氯化钾溶液，搅拌10-30min，加入定量的氧化石墨烯粉体，搅拌一定时间，缓慢滴入3-6mL的钛酸丁酯，搅拌10min，陈化3-6h，离心洗涤，干燥，并将其置于氩气气氛炉中。300℃之前升温速率为2℃/min。在300℃-500℃之间时，升温速率为1℃/min。500℃保温2h。得到石墨烯负载二氧化钛复合材料。
将玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉进行抛光，再用去离子水对电极表面进行超声清洗20～30min，最后用氮气吹干电极表面，得到干净的裸玻碳电极。
取4mg石墨烯负载的TiO2粉体，在搅拌条件下分散于2mL去离子水中，借助超声波使其分散，得到石墨烯负载TiO2溶液；取5mgHRP分散于0.5mLPBS（pH7.0，0.1mol/L）缓冲液中，使其混合均匀，得到HRP溶液。再从上述配制的石墨烯负载TiO2溶液中吸取1.0mL滴入0.5mLHRP溶液中，超声波分散20～30min，最后在上述溶液中，加入0.5mL的5wt%Nafion溶液，超声波分散5min，得到修饰悬浮液。取上述悬浮液4μL（用微量计量器）涂覆于干净的玻碳电极表面，在室温下阴干，即得到石墨烯负载二氧化钛纳米微球包埋辣根素过氧化氢酶修饰玻碳电极，将其保存在4℃的冰箱中使用。
制备得到的石墨烯负载TiO2纳米微球复合材料见图1、图2和图3。图1的XRD图给出了衍射峰是对应锐钛矿型TiO2结构的衍射峰，但是由于石墨烯衍射峰较小，因此在石墨烯负载二氧化碳复合材料XRD图谱中不明显。图2和图3的SEM图给出了石墨烯负载二氧化碳复合材料的微观形貌，从图中可以看出，制备的TiO2纳米微球尺寸为20-30nm左右，并且分布在石墨烯的骨架结构上，说明已经成功制备了石墨烯负载二氧化钛复合材料。
实施例2
氧化石墨烯采用改进的Hummers法制备，取1g预先制备的氧化石墨，分散于40mL去离子水中，超声3h。离心后取上清液得到氧化石墨烯。取200-400mL无水乙醇，加入0.5-2.0mL浓度为1mmol/L的氯化钠溶液，搅拌10-30min，加入定量的氧化石墨烯粉体，搅拌一定时间，缓慢滴入3-6mL的钛酸丁酯，搅拌10min。陈化3-6h。离心洗涤，干燥，并将其置于氩气气氛炉中。300℃之前升温速率为2℃/min。在300℃-500℃之间时，升温速率为1℃/min。500℃保温2h。得到石墨烯负载二氧化钛复合材料。
将玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉进行抛光，再用去离子水对电极表面进行超声清洗20～30min，最后用氮气吹干电极表面，得到干净的裸玻碳电极。
取4mg石墨烯负载的TiO2粉体，在搅拌条件下分散于2mL去离子水中，借助超声波使其分散，得到石墨烯负载TiO2溶液；取5mgHRP分散于0.5mLPBS（pH7.0，0.1mol/L）缓冲液中，使其混合均匀，得到HRP溶液。再从上述配制的石墨烯负载TiO2溶液中吸取1.0mL滴入0.5mLHRP溶液中，超声波分散20～30min，最后在上述溶液中，加入0.5mL的5wt%Nafion溶液，超声波分散5min，得到修饰悬浮液。取上述悬浮液4μL（用微量计量器）涂覆于干净的玻碳电极表面，在室温下阴干，即得到石墨烯负载二氧化钛纳米微球包埋辣根素过氧化氢酶修饰玻碳电极，将其保存在4℃的冰箱中使用。
实施例3
氧化石墨烯采用改进的Hummers法制备，取1g预先制备的氧化石墨，分散于40mL去离子水中，超声3h。离心后取上清液即得氧化石墨烯（GO）。取200-400mL无水乙醇，加入0.5-2.0mL浓度为0.8mmol/L的硝酸钾溶液，搅拌10-30min，加入定量的氧化石墨烯粉体，搅拌一定时间，缓慢滴入3-6mL的钛酸丁酯，搅拌10min。陈化3-6h。离心洗涤，干燥，并将其置于氩气气氛炉中。300℃之前升温速率为2℃/min。在300℃-500℃之间时，升温速率为1℃/min。500℃保温2h。得到石墨烯负载二氧化钛复合材料（GO-TiO2）。
将玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉进行抛光，再用去离子水对电极表面进行超声清洗20～30min，最后用氮气吹干电极表面，得到干净的裸玻碳电极。
分别取上述制备的4mg石墨烯和石墨烯负载的TiO2粉体，在搅拌条件下分别分散于2mL去离子水中，借助超声波使其分散，得到石墨烯溶液和石墨烯负载TiO2溶液；取5mgHRP分散于0.5mLPBS（pH7.0，0.1mol/L）缓冲液中，使其混合均匀，得到HRP溶液。再从上述配制的石墨烯溶液和石墨烯负载TiO2溶液中分别吸取1.0mL滴入0.5mLHRP溶液中，超声波分散20～30min，最后在上述溶液中，在上述两种混合液中加入0.5mL的5wt%Nafion溶液，超声波分散5min，得到修饰悬浮液。分别取上述两种修饰悬浮液4μL（用微量计量器）涂覆于干净的玻碳电极表面，在室温下阴干，即得到石墨烯包埋辣根过氧化氢酶和石墨烯负载二氧化钛纳米微球包埋辣根过氧化氢酶修饰玻碳电极，将其保存在4℃的冰箱中使用。
分别以干净的裸玻碳电极（GCE）、石墨烯包埋辣根过氧化氢酶修饰的玻碳电极（GO/HRP/Nafion/GCE）、石墨烯负载二氧化钛包埋辣根素过氧化氢酶修饰的玻碳电极（GO-TiO2/HRP/GCE）作为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，构成三电极体系，通过电化学分析仪（CHI660D）在PBS（pH7.0，0.1mol/L）缓冲溶液分别进行循环伏安测试见图4，图4中曲线a、b、c分别表示GCE、GO/HRP/Nafion/GCE和GO-TiO2/HRP/Nafion/GCE为工作电极测得的CV图。测试过程中扫描速率定为100mV·s-1，扫描范围为-0.8～0.4V（vs.Ag/AgCl）。
实施例4
氧化石墨烯采用改进的Hummers法制备，取1g预先制备的氧化石墨，分散于40mL去离子水中，超声3h。离心后取上清液得到氧化石墨烯。取200-400mL无水乙醇，加入0.5-2.0mL的浓度为1mmol/L的硝酸钠溶液，搅拌10-30min，加入定量的氧化石墨烯粉体，搅拌一定时间，缓慢滴入3-6mL的钛酸丁酯，搅拌10min.陈化3-6h。离心洗涤，干燥，并将其置于氩气气氛炉中。300℃之前升温速率为2℃/min。在300℃-500℃之间时，升温速率为1℃/min。500℃保温2h。得到石墨烯负载二氧化钛复合材料。
将玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉进行抛光，再用去离子水对电极表面进行超声清洗20～30min，最后用氮气吹干电极表面，得到干净的裸玻碳电极。
取4mg石墨烯负载的TiO2粉体，在搅拌条件下分散于2mL去离子水中，借助超声波使其分散，得到石墨烯负载TiO2溶液；取5mgHRP分散于0.5mLPBS（pH7.0，0.1mol/L）缓冲液中，使其混合均匀，得到HRP溶液。再从上述配制的石墨烯负载TiO2溶液中吸取1.0mL滴入0.5mLHRP溶液中，超声波分散20～30min，最后在上述溶液中，加入0.5mL的5wt%Nafion溶液，超声波分散5min，得到修饰悬浮液。取上述悬浮液4μL（用微量计量器）涂覆于干净的玻碳电极表面，在室温下阴干，即得到石墨烯负载二氧化钛纳米微球包埋辣根素过氧化氢酶修饰玻碳电极，将其保存在4℃的冰箱中使用。
将上述的石墨烯负载TiO2纳米微球包覆辣根过氧化氢酶修饰电极（GO-TiO2/HRP/Nafion/GCE）作为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，构成三电极体系，通过电化学分析仪（CHI660D）在PBS（pH7.0，0.1mol/L）缓冲溶液分别进行循环伏安测试见图5，测试过程中扫描速率依次分别为50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750和800mV·s-1，扫描范围为-0.8～0.4V（vs.Ag/AgCl）。
实施例5
氧化石墨烯采用改进的Hummers法制备，取1g预先制备的氧化石墨，分散于40mL去离子水中，超声3h。离心后取上清液得到氧化石墨烯。取200-400mL无水乙醇，加入0.5-2.0mL的浓度为0.5mmol/L的氯化钠溶液，搅拌10-30min，加入定量的氧化石墨烯粉体，搅拌一定时间，缓慢滴入3-6mL的钛酸丁酯，搅拌10min，陈化3-6h。离心洗涤，干燥，并将其置于氩气气氛炉中。300℃之前升温速率为2℃/min.在300℃-500℃之间时，升温速率为1℃/min，500℃保温2h，得到石墨烯负载二氧化钛复合材料。
将玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉进行抛光，再用去离子水对电极表面进行超声清洗20～30min，最后用氮气吹干电极表面，得到干净的裸玻碳电极。
取4mg石墨烯负载的TiO2粉体，在搅拌条件下分散于2mL去离子水中，借助超声波使其分散，得到石墨烯负载TiO2溶液；取5mgHRP分散于0.5mLPBS（pH7.0，0.1mol/L）缓冲液中，使其混合均匀，得到HRP溶液。再从上述配制的石墨烯负载TiO2溶液中吸取1.0mL滴入0.5mLHRP溶液中，超声波分散20～30min，最后在上述溶液中，加入0.5mL的5wt%Nafion溶液，超声波分散5min，得到修饰悬浮液。取上述悬浮液4μL（用微量计量器）涂覆于干净的玻碳电极表面，在室温下阴干，即得到石墨烯负载二氧化钛纳米微球包埋辣根素过氧化氢酶修饰玻碳电极，将其保存在4℃的冰箱中使用。
将上述的石墨烯负载TiO2纳米微球包覆辣根过氧化氢酶修饰电极（GO-TiO2/HRP/Nafion/GCE）作为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，构成三电极体系，通过电化学分析仪（CHI660D）对pH值为6.0、6.5、7.0和7.5的PBS缓冲溶液分别进行循环伏安测试，图6中曲线a、b、c、d分别表示pH值为6.0、6.5、7.0和7.5的CV曲线。测试过程中扫描速率定为100mV·s-1，扫描范围为-0.8～0.4V（vs.Ag/AgCl）。从测试结果可以看出，随着PH值的增大，氧化峰的峰值电流在pH值为6.5时，达到最大值。
实施例6
氧化石墨烯采用改进的Hummers法制备，取1g预先制备的氧化石墨，分散于40mL去离子水中，超声3h。离心后取上清液得到氧化石墨烯。取200-400mL无水乙醇，加入0.5-2.0mL的浓度为1mmol/L的氯化钠溶液，搅拌10-30min，加入定量的氧化石墨烯粉体，搅拌一定时间，缓慢滴入3-6mL的钛酸丁酯，搅拌10min。陈化3-6h。离心洗涤，干燥，并将其置于氩气气氛炉中。300℃之前升温速率为2℃/min。在300℃-500℃之间时，升温速率为1℃/min。500℃保温2h。得到石墨烯负载二氧化钛复合材料。
将玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉进行抛光，再用去离子水对电极表面进行超声清洗20～30min，最后用氮气吹干电极表面，得到干净的裸玻碳电极。
取4mg石墨烯负载的TiO2粉体，在搅拌条件下分散于2mL去离子水中，借助超声波使其分散，得到石墨烯负载TiO2溶液；取5mgHRP分散于0.5mLPBS（pH7.0，0.1mol/L）缓冲液中，使其混合均匀，得到HRP溶液。再从上述配制的石墨烯负载TiO2溶液中吸取1.0mL滴入0.5mLHRP溶液中，超声波分散20～30min，最后在上述溶液中，加入0.5mL的5wt%Nafion溶液，超声波分散5min，得到修饰悬浮液。取上述悬浮液4μL（用微量计量器）涂覆于干净的玻碳电极表面，在室温下阴干，即得到石墨烯负载二氧化钛纳米微球包埋辣根素过氧化氢酶修饰玻碳电极，将其保存在4℃的冰箱中使用。
将上述的石墨烯负载TiO2纳米微球包覆辣根过氧化氢酶修饰电极（GO-TiO2/HRP/Nafion/GCE）作为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，构成三电极体系，在PBS（pH7.0，0.1mol/L）缓冲溶液中过氧化氢，分别配制成H2O2浓度为0、25、50、100、200μmol/L。采用电化学分析仪（CHI660D）分别对上述的含有不同浓度H2O2的PBS缓冲溶液进行循环伏安测试见图7，图7中曲线a、b、c、d、e分别对应CH2O2为0、25、50、100、200μmol/L的CV曲线。测试过程中扫描速率定为100mV·s-1，扫描范围为-0.8～0.4V（vs.Ag/AgCl）。

Claims (5)

1.石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1：制备氧化石墨烯；
步骤2：制备石墨烯负载二氧化钛复合材料，具体按照以下步骤实施：取无水乙醇，加入摩尔浓度为0.4-1mmol/L的盐溶液，搅拌10-30min，得到无水乙醇盐溶液，加入步骤1得到的氧化石墨烯粉体，搅拌，得到混合溶液，滴入钛酸丁酯，搅拌10min，陈化3-6h，离心洗涤，干燥，置于氩气气氛炉中煅烧处理，得到石墨烯负载二氧化钛复合材料；所述的盐溶液采用硝酸钾，氯化钠或硝酸钠中的一种；所述的氧化石墨烯粉体与无水乙醇盐溶液的质量-体积比为1：15mg/ml-1：10mg/ml；
步骤3：制备玻碳电极；
步骤4：制备修饰玻碳电极，具体按照以下步骤实施：用NaH2PO3和Na2HPO3配制成浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液；取步骤2得到的石墨烯负载二氧化钛复合材料，在搅拌条件下借助超声波分散于去离子水中，得到石墨烯负载TiO2溶液，TiO2溶液中mTiO2：VH2O为2：1；
取辣根过氧化物酶分散于pH7.0，浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液中，混合均匀，得到HRP溶液，HRP溶液中mHRP：VPBS＝10：1；
再吸取所述的石墨烯负载TiO2溶液滴入HRP溶液中，超声波分散20～30min，最后在上述混合溶液中，加入5wt％全氟磺酸溶液；超声波分散5min，得到修饰悬浮液，修饰悬浮液中包含物质浓度分别为：2.5mg/mL HRP、1mg/mL TiO2和1.25wt％全氟磺酸；
取所述的修饰悬浮液涂覆于步骤3得到的玻碳电极表面，在室温下阴干，得到石墨烯负载二氧化钛纳米微球包埋辣根素过氧化氢酶修饰玻碳电极。
2.根据权利要求1所述的石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的步骤1制备氧化石墨烯，具体按照以下步骤实施：按照质量-体积浓度为1：40g/ml，称取氧化石墨分散于去离子水中，超声3h，离心后取上清液得到氧化石墨烯粉体。
3.根据权利要求1所述的石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的钛酸丁酯与混合溶液的体积比为1：600-120。
4.根据权利要求1所述的石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的煅烧处理，300℃之前升温速率为2℃/min，在300℃-500℃之间时，升温速率为1℃/min，500℃保温2h。
5.根据权利要求1所述的石墨烯—二氧化钛复合电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的步骤3制备玻碳电极，具体按照以下步骤实施：将玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝粉进行抛光，再用去离子水对电极表面进行超声清洗20～30min，最后用氮气吹干电极表面，得到干净的玻碳电极。
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