CN109946364B - 检测多奈哌齐血药浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测多奈哌齐血药浓度的方法：取待测血液，离心，获得血浆；向血浆中加入二甲基亚砜、震荡，再加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白、震荡，离心，收集上清液；取上清液，加入三乙胺‑磷酸溶液，震荡，获得待测液；取不含有多奈哌齐的对照血液，离心，获得血浆；向血浆中加入多奈哌齐二甲基亚砜溶液、震荡，再加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白、震荡，离心，收集上清液；取上清液，加入三乙胺‑磷酸溶液，震荡，制备含多奈哌齐浓度梯度的参比液；依次将待测液、含多奈哌齐浓度梯度的参比液加入微流控芯片的样品池中，采用非接触电导法检测。本发明方法，具有较好的电泳分离检测多奈哌齐的重现性及实用性。

Description

检测多奈哌齐血药浓度的方法

技术领域

本发明涉及微流控芯片血药浓度监测应用领域，特别是涉及一种检测多奈哌齐血药浓度的方法。

背景技术

微流控芯片非接触电导法检测是现代分析仪器发展的重要方向之一。微流控芯片具有体积小、样品和试剂消耗少、分析速度快、样品处理简单、分离效能高等特点。非接触电导法为用于微流控芯片的一种检测器，为电导检测的改进型，电导检测器通过测定分析物的电导变化实现检测，主要用于检测可电离物质的阴阳离子，具有线性范围宽、选择性好、易于集成化微型化、检测电路结构简单、成本低、信号噪声小等特点。非接触电导检测器直接将检测电极放置在分离通道的芯片外表面，避免电极与待测溶液的直接接触，可以更加有效的消除高压分离电场对检测干扰及电极污染，不仅拥有电导检测的优点，而且避免了溶液以及电场的干扰。

阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，病变基础为大脑皮质、海马等中枢神经细胞功能退化，临床以高级认知功能下降为主，表现为不同程度记忆力、判断力、定向力等下降，常伴有进行性日常生活能力减退、情感反应障碍。胆碱酯酶抑制剂是目前临床治疗阿尔茨海默病首选的一类药物，其机制为通过抑制胆碱酯酶活性，增加大脑皮质和海马的乙酰胆碱神经递质，改善神经-神经突触功能障碍及细胞死亡或功能退化所致乙酰胆碱递质的减少。盐酸多奈哌齐是中枢神经系统乙酰胆碱酯酶选择性抑制剂，能够提高中枢神经系统，特别是大脑皮质和基底核神经突触中乙酰胆碱浓度，从而改善认知功能，是阿尔茨海默病首选治疗方案的药物。

目前由于多奈哌齐溶解度小，血浆蛋白结合率高，需要极高的检测灵敏度，血浆药物检测难度大，所以目前大部分多奈哌齐血浆药物浓度检测方法为高效液相色谱法联合质谱法，而高效液相色谱法联合质谱法具有仪器昂贵，检测成本高，仪器庞大不易移动等缺点，难以满足市场需求。而微流控芯片非接触电导法是一种高效的、高速，便携且低成本的检测方法。但是，采用微流控芯片非接触电导法检测多奈哌齐的血药浓度时往往伴随检测重现性差以及灵敏度低的问题，该问题不利于多奈哌齐药物相关的科研、医院临床治疗药物浓度监测需要。

因此，亟待研发一种检测重现性好、灵敏度好的而且可以满足实际检测需要的微流控芯片非接触电导法检测多奈哌齐的血药浓度方法。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种重现性好、灵敏度好而且可以满足实际检测需要的检测多奈哌齐的血药浓度方法。

本发明的主要目的是通过以下技术方案实现的：

一种检测多奈哌齐血药浓度的方法，所述的方法包括：

(1)待测液制备：取待测血液，离心，获得血浆；向所述血浆中加入二甲基亚砜溶液、震荡，再加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白、震荡，离心，收集上清液；取所述上清液，加入三乙胺溶液、磷酸溶液，震荡，获得待测液；

(2)参比液制备：取不含有多奈哌齐的对照血液，离心，获得血浆；向所述血浆中加入含多奈哌齐的二甲基亚砜溶液，震荡，再加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白、震荡，离心，收集上清液；取所述上清液，加入三乙胺溶液、磷酸溶液，震荡，制备含多奈哌齐浓度梯度的参比液；所述含多奈哌齐的二甲基亚砜溶液与步骤(1)加入的所述二甲基亚砜溶液体积相等；

(3)检测：将所述待测液或所述含多奈哌齐浓度梯度的参比液加入微流控芯片的样品池中，加入含有二甲基亚砜的缓冲溶液，采用非接触电导法检测。

在其中一个实施例中，步骤(1)和/或步骤(2)中，所述的上清液、三乙胺溶液、磷酸溶液的体积比为8：(0.1～3)：(0.1～3)，所述的三乙胺溶液的浓度范围为50～150mmol/L，所述磷酸溶液的浓度为50～150mmol/L，加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白、震荡后离心所采用的条件为：8000～12000rpm、20～30min；

步骤(3)中，所述的缓冲溶液由三乙胺溶液、磷酸溶液组成，其中三乙胺溶液与磷酸溶液的浓度分别为0.9～150mmol/L、0.3～50mmol/L且浓度比值大于等于3；

步骤(1)和/或步骤(2)和/或步骤(3)中，所述二甲基亚砜的体积浓度为0.5-5％。

在其中一个实施例中，步骤(1)和/或步骤(2)中，所述的上清液、三乙胺溶液、磷酸溶液的体积比为8：(1～2)：(0.3～0.6)，所述的三乙胺溶液的浓度范围为75～125mmol/L，所述磷酸溶液的浓度为75～125mmol/L，加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白、震荡后离心所采用的条件为：9000～11000rpm、23～27min；

步骤(3)中，所述的缓冲溶液由三乙胺溶液、磷酸溶液组成，其中三乙胺溶液与磷酸溶液的浓度分别为3～30mmol/L、1～10mmol/L且浓度比值大于等于3；

步骤(1)和/或步骤(2)和/或步骤(3)中，所述二甲基亚砜的体积浓度为1～3％。

在其中一个实施例中，步骤(1)和/或步骤(2)中，所述的上清液、三乙胺溶液、磷酸溶液的体积比为8：1.5：0.5，所述的三乙胺溶液的浓度范围为100mmol/L，所述磷酸溶液的浓度为100mmol/L，加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白、震荡后离心所采用的条件为：10000rpm、25min；

步骤(3)中，所述的缓冲溶液由三乙胺溶液、磷酸溶液组成，其中三乙胺溶液与磷酸溶液的浓度分别为15mmol/L、5mmol/L；

步骤(1)和/或步骤(2)和/或步骤(3)中，所述二甲基亚砜的体积浓度为2％。

在其中一个实施例中，步骤(3)包括如下步骤：

1)取微流控芯片，加入缓冲液，使所述微流控芯片的样品池、样品废液池、缓冲液储存池、缓冲液废液池、进样通道和分离通道均充满缓冲液；

2)吸去出所述样品池、缓冲液储存池中的所述缓冲液；

3)向缓冲液储存池中加入添加有体积分数不低于10％的乙醇的所述缓冲液，向样品池中加入所述待测液或含多奈哌齐浓度梯度的参比液；

4)插入电极，以样品池为正极、样品废液池为负极进行进样，所述进样结束后，以缓冲液储存池为正极、缓冲液废液池为负极进行分离；所述进样、分离结束后再重复所述进样、分离至少一次，获得检测结果；

所述缓冲液选用前述步骤(3)含有二甲基亚砜的缓冲溶液。

在其中一个实施例中，步骤1)中，所述微流控芯片经过近如下预处理：

所述微流控芯片为首次使用的微流控芯片，则依次采用硝酸溶液、双蒸馏水、氢氧化钠溶液、双蒸馏水冲洗；

所述微流控芯片为重复使用的微流控芯片，则先采用氢氧化钠溶液对进样通道、分离通道进行活化，再用双蒸馏水清洗，最后用所述缓冲液平衡。

在其中一个实施例中，步骤(3)中，所述检测选择的分离电压为1kv～2kv、激发频率为50kHz～70kHz、激发电压为50V～70V。

在其中一个实施例中，所述检测选择的分离电压为2kv、激发频率为60kHz、激发电压为60V。

在其中一个实施例中，所述的三氯乙酸溶液的质量浓度为15％～25％。

在其中一个实施例中，所述的三氯乙酸溶液的质量浓度为20％。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明将微流控芯片非接触电导法成功应用于多奈哌齐血药浓度检测，不仅实现痕量检测、灵敏度高、操作简单、实用性强、成本低；更重要的是，本发明将待测血样和空白血样进行合适处理从而制备得到的待测液和参比液，这样的待测液与参比液，在微流控芯片上进行重复检测使用时，具有较好的电泳分离检测多奈哌齐的重现性、检测灵敏度好，同时可以满足实际血浆样品中药物检测需要。

附图说明

图1为本发明所涉及的微流控芯片结构示意图。

图2为实施例2、实施例4所得检测图谱；图2中，A是实施例4空白对照血浆的谱峰，B是实施例2含有300ng/ml多奈哌齐待测液的谱峰。

图3为实施例3、对比例1、对比例2所得检测图谱；A是实施例3以15-5mmol/L三乙胺-磷酸缓冲体系作为缓冲溶液所得谱峰，B是对比例2以12-8mmol/L三乙胺-磷酸缓冲体系作为缓冲溶液所得谱峰，C是对比例1以10-10mmol/L三乙胺-磷酸缓冲体系作为缓冲溶液所得谱峰。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1、该方法用于多奈哌齐的梯度血浆参比液检测

1、参比液制备方法

1)取抗凝采血管，采集未服用多奈哌齐药物的健康志愿者的血液，3000rpm离心后，取2.7ml血浆于新离心管中；

2)向步骤1)所得血浆中加入0.3ml溶解有多奈哌齐对照品的2％体积浓度的二甲基亚砜溶液(溶剂为水)，超声震荡3min，此时的浓度为血浆药物对照品浓度(浓度＝溶解的多奈哌齐对照品质量/3ml)，加入1ml的质量百分比为20％三氯乙酸溶液以沉淀蛋白，超声震荡3min，10000rpm离心25min，之后收集清澈上清液；

3)将0.8ml步骤2)所得上清液，0.15ml的100mmol/L三乙胺溶液，0.05ml的100mmol/L磷酸溶液混合，超声震荡3min后，制得1ml参比液，冻存于-20℃冰箱待用。

按照本步骤的方法，制备含多奈哌齐浓度梯度的参比液，该浓度梯度的参比液包括：0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，15ng/ml，20ng/ml，45.5ng/ml，300ng/ml。

2、微流控芯片(参见图1)非接触电导检测前处理方法

所述微流控芯片首次使用，依次采用1mol/L硝酸溶液、蒸馏水、1mol/L氢氧化钠溶液、蒸馏水分别冲洗10min、5min、10min、5min；

微流控芯片为重复使用的微流控芯片，每次使用前采用0.1mol/L氢氧化钠溶液对进样通道、分离通道进行活化15min，再用蒸馏水清洗5min，最后用缓冲液平衡10min。

选择2.0kv电压为分离电压，激发频率60kHz，激发电压60V。

3、检测方法

步骤一、在十字形PMMA微流控芯片，加入缓冲液，使所述微流控芯片的样品池、样品废液池、缓冲液储存池、缓冲液废液池、进样通道和分离通道均充满缓冲液；

步骤二、吸去出所述样品池、缓冲液储存池中的缓冲液；

步骤三、向样品池中加入第1步制备的参比液，向缓冲液储存池中加入信号放大缓冲液(含20％体积分数的乙醇、2％体积分数的二甲基亚砜)；

步骤四、插入电极，以样品池为正极、样品废液池为负极进行进样，所述进样结束后，以缓冲液储存池为正极、缓冲液废液池为负极进行分离；所述进样、分离结束后再重复所述进样、分离至少一次，获得检测结果，首次进样-分离时间需3min，后续重复进样-分离时间3min，其中每次进样时间均选择为10s。

第2步、第3步中的缓冲液为由三乙胺溶液、磷酸溶液组成，其中三乙胺溶液与磷酸溶液的浓度分别是15mmol/L、5mmol/L，浓度比值为3。根据本实施例浓度梯度的参比液浓度及其多次检测结果，构建标准曲线，相应的回归方程为：y＝2.3688x+101.62(x＝ng/ml y＝uv)。其他方法学数据结果如下：

方法学项目	参考数值
		线性范围	7.76～300ng/ml
回归方程	y＝2.3688x+101.62(x＝ng/ml y＝uv)
		相关系数(R<sup>2</sup>)	0.9971
检测限(s/n＝3计算)	0.48ng/ml
		定量限(s/n＝10计算)	7.76ng/ml

实施例2、该方法用于待测多奈哌齐血浆的检测

1、待测液制备方法

1)取抗凝采血管，采集服用过多奈哌齐药物的志愿者的血液，3000rpm离心后，取2.7ml血浆于新离心管中；

2)向步骤1)所得血浆中加入0.3ml 2％体积浓度的二甲基亚砜溶液(溶剂为蒸馏水)，超声震荡3min，加入1ml的质量百分比为20％三氯乙酸溶液以沉淀蛋白，超声震荡3min，10000rpm离心25min，之后收集清澈上清液；

3)将0.8ml步骤2)所得上清液，0.15ml的100mmol/L三乙胺溶液，0.05ml的100mmol/L磷酸溶液混合，超声震荡3min后，制得1ml待测液，冻存于-20℃冰箱待用。

2、微流控芯片非接触电导检测前处理方法

所述微流控芯片首次使用，依次采用1mol/L硝酸溶液、蒸馏水、1mol/L氢氧化钠溶液、蒸馏水冲洗10min、5min、10min、5min；

微流控芯片为重复使用的微流控芯片，每次使用前采用0.1mol/L氢氧化钠溶液对进样通道、分离通道进行活化15min，再用蒸馏水清洗5min，最后用缓冲液平衡10min。

选择2.0kv电压为分离电压，激发频率60kHz，激发电压60V。

3、检测方法

步骤一、在十字形PMMA微流控芯片，加入缓冲液，使所述微流控芯片的样品池、样品废液池、缓冲液储存池、缓冲液废液池、进样通道和分离通道均充满缓冲液；

步骤二、吸去出所述样品池、缓冲液储存池中的缓冲液；

步骤三、向样品池中加入第1步制备的待测液，向缓冲液储存池中加入信号放大缓冲液(含20％体积分数的乙醇、2％体积分数的二甲基亚砜)；

步骤四、插入电极，以样品池为正极、样品废液池为负极进行进样，所述进样结束后，以缓冲液储存池为正极、缓冲液废液池为负极进行分离；所述进样、分离结束后再重复所述进样、分离至少一次，获得检测结果，进样-分离时间需3min，后续重复进样-分离时间3min，其中每次进样时间均选择为10s。

第2步、第3步中的缓冲液为由三乙胺溶液、磷酸溶液组成，其中三乙胺溶液与磷酸溶液的浓度分别是15mmol/L、5mmol/L，浓度比值为3。

本实施例对待测液进行重复检测，将待测液重复检测的结果的平均值带入实施例1所得回归方程，结果多次检测平均值(n≥6)为305.14ng/ml。这些重复结果不存在显著性差异，误差小于5％，证明重现性好。所得图谱结果见图2B谱峰，其中3为该谱峰浓度下的多奈哌齐峰，1、2、4为血浆内源性物质峰。

实施例3、使用15-5mmol/L三乙胺磷酸缓冲溶液作为缓冲液检测多奈哌齐

1、检测溶液制备方法

将多奈哌齐对照品溶解于2％体积浓度的二甲基亚砜溶液，超声震荡3min，制得0.8ml多奈哌齐二甲基亚砜溶液，与0.15ml的100mmol/L三乙胺溶液、0.05ml的100mmol/L磷酸溶液混合。超声震荡3min后，制得200μg/ml多奈哌齐检测溶液，冻存于-20℃冰箱待用。

2、微流控芯片非接触电导检测前处理方法

所述微流控芯片首次使用，依次采用1mol/L硝酸溶液、蒸馏水、1mol/L氢氧化钠溶液、蒸馏水冲洗10min、5min、10min、5min；

微流控芯片为重复使用的微流控芯片，每次使用前采用0.1mol/L氢氧化钠溶液对进样通道、分离通道进行活化15min，再用蒸馏水清洗5min，最后用缓冲液平衡10min。

选择2.0kv电压为分离电压，激发频率60kHz，激发电压60V。

3、检测方法

步骤一、在十字形PMMA微流控芯片，加入缓冲液，使所述微流控芯片的样品池、样品废液池、缓冲液储存池、缓冲液废液池、进样通道和分离通道均充满缓冲液；

步骤二、吸去出所述样品池中的缓冲液；

步骤三、向样品池中加入第1步制备的检测溶液；，向缓冲液储存池中加入信号放大缓冲液(含20％体积分数的乙醇、2％体积分数的二甲基亚砜)；

步骤四、插入电极，以样品池为正极、样品废液池为负极进行进样，所述进样结束后，以缓冲液储存池为正极、缓冲液废液池为负极进行分离；进样-分离时间3min，其中每次进样时间均选择为10s。

第2步、第3步中的缓冲液为由三乙胺溶液、磷酸溶液组成，其中三乙胺溶液与磷酸溶液的浓度分别为5mmol/L、5mmol/L(记作15-5mmol/L三乙胺磷酸缓冲溶液)。

所得图谱结果见图3，图3A谱峰，1为多奈哌齐峰，多奈哌齐峰信号较强。所以当三乙胺：磷酸的摩尔浓度比值为3，15-5mmol/L三乙胺磷酸缓冲溶液作为缓冲溶液检测多奈哌齐时可以有最大信号。该结果提示在加入信号放大缓冲液后，使用本申请方法运行，以15-5mmol/L三乙胺磷酸缓冲溶液作为缓冲溶液，在三乙胺溶液：磷酸溶液的摩尔浓度比值等于3的缓冲体系中，检测多奈哌齐可以有最大信号。

参照本实施例的方法，采用不同浓度比的乙胺溶液、磷酸溶液组成的缓冲液进行多奈哌齐测试，结果发现，在三乙胺溶液(浓度为0.9～150mmol/L)：磷酸溶液(0.3～50mmol/L)的摩尔比值大于等于3的缓冲体系中，检测多奈哌齐信号较大，特别是摩尔比值＝3时检测多奈哌齐可以有最大信号。

实施例4、该方法用于空白对照血浆待测液的检测

1、待测液制备方法

1)取抗凝采血管，采集未服用多奈哌齐药物的健康志愿者的血液，3000rpm离心后，取2.7ml血浆于新离心管中；

2)向步骤1)所得血浆中加入0.3ml 2％二甲基亚砜(总溶液体积比)溶液，超声震荡3min，加入1ml的质量百分比为20％三氯乙酸溶液以沉淀蛋白，超声震荡3min，10000rpm离心25min，之后收集清澈上清液；

3)将0.8ml步骤2)所得上清液，0.15ml的100mmol/L三乙胺溶液，0.05ml的100mmol/L磷酸溶液混合，超声震荡3min后，制得1ml待测液，冻存于-20℃冰箱待用。

2、微流控芯片非接触电导检测前处理方法

所述微流控芯片首次使用，依次采用1mol/L硝酸溶液、蒸馏水、1mol/L氢氧化钠溶液、蒸馏水冲洗10min、5min、10min、5min；

微流控芯片为重复使用的微流控芯片，每次使用前采用0.1mol/L氢氧化钠溶液对进样通道、分离通道进行活化15min，再用蒸馏水清洗5min，最后用缓冲液平衡10min。

选择2.0kv电压为分离电压，激发频率60kHz，激发电压60V。

3、检测方法

步骤一、在十字形PMMA微流控芯片，加入缓冲液，使所述微流控芯片的样品池、样品废液池、缓冲液储存池、缓冲液废液池、进样通道和分离通道均充满缓冲液；

步骤二、吸去出所述样品池、缓冲液储存池中的缓冲液；

步骤三、向样品池中加入第1步制备的待测液，向缓冲液储存池中加入信号放大缓冲液(含20％体积分数的乙醇，2％体积分数的二甲基亚砜)。

步骤四、插入电极，以样品池为正极、样品废液池为负极进行进样，所述进样结束后，以缓冲液储存池为正极、缓冲液废液池为负极进行分离；所述进样、分离结束后再重复所述进样、分离至少一次，获得检测结果，首次进样-分离时间需3min，后续重复进样-分离时间3min，其中每次进样时间均选择为10s。

第2步、第3步中的缓冲液为由三乙胺溶液、磷酸溶液组成，其中三乙胺溶液与磷酸溶液的浓度分别为15mmol/L：5mmol/L，浓度比值为3。

所得图谱结果见图2，图2A谱峰，其中1、2、4为血浆内源性物质峰，没有检测到多奈哌齐的峰。

实施例5、其他增加溶解度方法用于提升多奈哌齐血浆的溶解度

参照实施例3的方法，分别用体积分数为1～5％的吐温20溶液、1～5％的β-环糊精溶液溶、1～20％的乙醇溶解多奈哌齐，检测多奈哌齐的溶解情况，结果如下：

选用1～5％的吐温20溶液溶解多奈哌齐，肉眼可见，多奈哌齐沉淀物未溶解，溶解度提升不大。

选用1～5％的β-环糊精溶液溶解多奈哌齐，肉眼可见，多奈哌齐沉淀物未溶解，溶解度提升不大。

选用1～20％的乙醇溶解多奈哌齐，多奈哌齐检测灵敏度不能达到实用要求。

选用1～20％的甲醇溶解多奈哌齐，多奈哌齐检测灵敏度不能达到实用要求。

选用2％的二甲基亚砜溶解多奈哌齐，肉眼可见，多奈哌齐沉淀物溶解，溶解度提升。多奈哌齐检测灵敏度可以达到实用要求。

综上所述，选择2％二甲基亚砜作为助溶剂是较优的选择。

对比例1、使用10-10mmol/L三乙胺磷酸缓冲溶液作为缓冲液检测多奈哌齐

本对比例是实施例3的对比例，相对于实施例3的主要差别包括第2步、第3步中的缓冲液所含三乙胺溶液与磷酸溶液的浓度分别为10mmol/L、10mmol/L，摩尔浓度比值为1。多奈哌齐二甲基亚砜溶液与0.10ml的100mmol/L三乙胺溶液、0.10ml的100mmol/L磷酸溶液混合。本对比例的步骤包括：

1、检测溶液制备方法

将多奈哌齐对照品溶解于2％体积浓度的二甲基亚砜溶液，超声震荡3min，制得0.8ml多奈哌齐二甲基亚砜溶液，与0.10ml的100mmol/L三乙胺溶液、0.10ml的100mmol/L磷酸溶液混合。超声震荡3min后，制得200μg/ml多奈哌齐检测溶液，冻存于-20℃冰箱待用。

2、微流控芯片非接触电导检测前处理方法

所述微流控芯片首次使用，依次采用1mol/L硝酸溶液、蒸馏水、1mol/L氢氧化钠溶液、蒸馏水冲洗10min、5min、10min、5min；

微流控芯片为重复使用的微流控芯片，每次使用前采用0.1mol/L氢氧化钠溶液对进样通道、分离通道进行活化15min，再用蒸馏水清洗5min，最后用缓冲液平衡10min。

选择2.0kv电压为分离电压，激发频率60kHz，激发电压60V。

3、检测方法

步骤一、在十字形PMMA微流控芯片，加入缓冲液，使所述微流控芯片的样品池、样品废液池、缓冲液储存池、缓冲液废液池、进样通道和分离通道均充满缓冲液；

步骤二、吸去出所述样品池中的缓冲液；

步骤三、向样品池中加入第1步制备的检测溶液，向缓冲液储存池中加入信号放大缓冲液(含20％体积分数的乙醇、2％体积分数的二甲基亚砜)；

步骤四、插入电极，以样品池为正极、样品废液池为负极进行进样，所述进样结束后，以缓冲液储存池为正极、缓冲液废液池为负极进行分离；进样-分离时间3min，其中每次进样时间均选择为10s。

所得图谱结果见图3，图3中C谱峰，未见多奈哌齐峰。证明三乙胺：磷酸的摩尔比值＝1，多奈哌齐不能出峰，提示在加入信号放大缓冲液后，使用本申请方法运行，以10-10mmol/L三乙胺磷酸缓冲溶液作为缓冲溶液，在三乙胺：磷酸的摩尔比值＝1的缓冲体系中，多奈哌齐不能检测出峰。

参照本对比例的方法，采用不同浓度比的乙胺溶液、磷酸溶液组成的缓冲液进行多奈哌齐测试，结果发现，在三乙胺溶液(浓度为0.9～150mmol/L)：磷酸溶液(0.3～50mmol/L)的摩尔比值小于等于1的缓冲体系中，多奈哌齐不能检测出峰。

对比例2、使用12-8mmol/L三乙胺磷酸缓冲溶液作为缓冲液检测多奈哌齐

本对比例是实施例3的对比例，相对于实施例3的主要差别包括第2步、第3步中的缓冲液所含三乙胺溶液与磷酸溶液的浓度分别为12mmol/L、8mmol/L，摩尔浓度比值为1.5。多奈哌齐二甲基亚砜溶液与0.12ml的100mmol/L三乙胺溶液、0.08ml的100mmol/L磷酸溶液混合。本对比例的步骤包括：

1、检测溶液制备方法

将多奈哌齐对照品溶解于2％体积浓度的二甲基亚砜溶液，超声震荡3min，制得0.8ml多奈哌齐二甲基亚砜溶液，与0.12ml的100mmol/L三乙胺溶液、0.08ml的100mmol/L磷酸溶液混合。超声震荡3min后，制得200μg/ml多奈哌齐检测溶液，冻存于-20℃冰箱待用。

2、微流控芯片非接触电导检测前处理方法

所述微流控芯片首次使用，依次采用1mol/L硝酸溶液、蒸馏水、1mol/L氢氧化钠溶液、蒸馏水冲洗10min、5min、10min、5min；

微流控芯片为重复使用的微流控芯片，每次使用前采用0.1mol/L氢氧化钠溶液对进样通道、分离通道进行活化15min，再用蒸馏水清洗5min，最后用缓冲液平衡10min。

选择2.0kv电压为分离电压，激发频率60kHz，激发电压60V。

3、检测方法

步骤一、在十字形PMMA微流控芯片，加入缓冲液，使所述微流控芯片的样品池、样品废液池、缓冲液储存池、缓冲液废液池、进样通道和分离通道均充满缓冲液；

步骤二、吸去出所述样品池中的缓冲液；

步骤三、向样品池中加入第1步制备的检测溶液，向缓冲液储存池中加入信号放大缓冲液(含20％体积分数的乙醇、2％体积分数的二甲基亚砜)；

步骤四、插入电极，以样品池为正极、样品废液池为负极进行进样，所述进样结束后，以缓冲液储存池为正极、缓冲液废液池为负极进行分离；进样-分离时间3min，其中每次进样时间均选择为10s。

所得图谱结果见图3，图3B谱峰，1为多奈哌齐峰，多奈哌齐峰信号较弱。三乙胺：磷酸的摩尔比值＝1.5，多奈哌齐峰较弱，信号不明显，提示在加入信号放大缓冲液后，使用本申请方法运行，以12-8mmol/L三乙胺磷酸作为缓冲溶液，在三乙胺：磷酸的摩尔比值＝1.5的缓冲体系中，多奈哌齐峰较弱，出峰信号不明显。

参照本对比例的方法，采用不同浓度比的乙胺溶液、磷酸溶液组成的缓冲液进行多奈哌齐测试，结果发现，在三乙胺溶液(浓度为0.9～150mmol/L)：磷酸溶液(0.3～50mmol/L)的摩尔比值小于3的缓冲体系中，多奈哌齐不能检测出峰。

对比例3

本对比例是实施例2的对比例，相对于实施例2的主要差别包括待测液制备方法不同。本对比例的第1步的步骤2)选自如下处理中的任一种：

处理1：向步骤1)所得血浆中加入0.3ml 2％二甲基亚砜(总溶液体积比)溶液，超声震荡3min，加入1ml的质量百分比为20％三氯乙酸溶液以沉淀蛋白，超声震荡3min，10000rpm离心10min，之后收集清澈上清液；参比液相应的步骤离心也采用10000rpm离心10min。检测出峰紊乱，检测图谱没有重复性。

处理2：向步骤1)所得血浆中加入0.3ml 2％二甲基亚砜(总溶液体积比)溶液，超声震荡3min，加入1ml的质量百分比为20％三氯乙酸溶液以沉淀蛋白，超声震荡3min，4000rpm离心10min，之后收集清澈上清液；参比液相应的步骤离心也采用4000rpm离心10min。检测出峰紊乱，检测图谱没有重复性。所以应当选择长时间高转速离心保证蛋白以及其他不溶物的充分沉淀，防止干扰检测。

对比例4

本对比例是实施例2的对比例，相对于实施例2的主要差别包括待测液制备方法不同。本对比例第1步的步骤3)包括：

将0.8ml步骤2)所得上清液，0.4ml的100mmol/L三乙胺溶液，0.4ml的100mmol/L磷酸溶液混合，超声震荡3min后，最终取1ml做待测液，冻存于-20℃冰箱待用。

结果：由于上清液占总混合液体积偏低，无法达到实际多奈哌齐血药浓度范围，而三乙胺溶液、磷酸溶液无法维持在合适比例浓度，所得图谱中无法出现多奈哌齐峰。

本发明将微流控芯片非接触电导法成功应用于多奈哌齐血药浓度检测，不仅实现痕量检测、灵敏度高、操作简单、实用性强、成本低；更重要的是，本发明将待测血样和空白血样进行合适处理从而制备得到的待测液和参比液，这样的待测液与参比液，在微流控芯片上进行重复检测使用时，具有较好的电泳分离检测多奈哌齐的重现性、检测灵敏度好，同时可以满足实际血浆样品中药物检测需要。

本方法具有较好的电泳分离检测多奈哌齐的重现性、实用性、灵敏度的原因：

在实际实验中，当二甲基亚砜为量为2％(总溶液体积比)时可以较好的溶解多奈哌齐对照品。

此外，在实际实验中，当三乙胺：磷酸的摩尔比值≤3，随二者摩尔比降低，多奈哌齐峰逐渐减弱，信号变得不明显，当三乙胺：磷酸的摩尔比值≤1，多奈哌齐峰重复性差，基本观察不到多奈哌齐峰。

当三乙胺：磷酸的摩尔比保持不变，同时提高三乙胺与磷酸的浓度时，背景离子浓度增加，背景噪声增加，灵敏度下降，难以满足实际检测需要。当三乙胺：磷酸的摩尔比保持不变，同时降低三乙胺与磷酸的浓度时，难以达到有效检测的目的。

综合考虑重现性与实际检测需要与效果，故选择15mmol/L：5mmol/L的三乙胺-磷酸作为检测的缓冲对浓度，选择二甲基亚砜为量为2％(总溶液体积比)加入15mmol/L：5mmol/L的三乙胺-磷酸作为缓冲溶液。

为了具有更好的重现性，待测液与参比液中除药物及血浆内源性物质外，应当与缓冲液的成分、浓度及pH值相一致。

当上清液在待测液及参比液中所占比例越高，检测灵敏度越好，所以选择上清液与100mmol/L-100mmol/L三乙胺-磷酸溶液的体积比为8：1.5：0.5，此时三乙胺-磷酸在待测液及参比液浓度均为15mmol/L：5mmol/L，与缓冲液浓度相同。

当加入2％二甲基亚砜(总溶液体积比)溶液作为待测液的一部分，2％二甲基亚砜(总溶液体积比)溶液溶解多奈哌齐对照品作为参比液的一部分，二者保持成分体积比的一致，也同样保证了更好的重现性。

为了具有更好的重现性，待测液及参比液一、二次离心转速、时间均应当相同。第一次离心均为3500rpm，15min，以保证全血分离得到血浆。第二次离心均为10000rpm，25min。在第二次离心前同样的浓度的20％三氯乙酸溶液沉淀蛋白，可以保证蛋白的充分沉淀，而在第二次离心时，防止不溶物干扰检测，应当选择长时间高转速离心，根据实验，第二次离心选择转速为10000rpm，时间为25min。

为了具有更好的重现性，由于多奈哌齐溶解度小，为难溶药物，经多次实验，多奈哌齐对照品溶解于2％二甲基亚砜溶液制得的多奈哌齐溶液母液溶解度不得大于300ug/ml；同样由于溶解度要求，母液加入2％二甲基亚砜(总溶液体积比)溶液稀释后向所述血浆中加入的稀释液浓度不得大于800ng/ml，即本方法所测的最大血药浓度不得大于800ng/ml。

多奈哌齐实际血药范围在1～15ng/ml波动，为了具有更好的实用性，多奈哌齐检测方法的应当至少应当可以检测1～40ng/ml的范围，而随着本方法各种保证检测灵敏度的检测限为0.48ng/ml，定量限为7.76ng/ml，可以满足0.48～50ng/ml的检测范围，可以满足多奈哌齐检测需要。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (13)

1.一种检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)待测液制备：取待测血液，离心，获得血浆；向所述血浆中加入二甲基亚砜溶液、震荡，再加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白、震荡，离心，收集上清液；取所述上清液，加入三乙胺溶液、磷酸溶液，震荡，获得待测液；

(2)参比液制备：取不含有多奈哌齐的对照血液，离心，获得血浆；向所述血浆中加入含多奈哌齐的二甲基亚砜溶液，震荡，再加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白、震荡，离心，收集上清液；取所述上清液，加入三乙胺溶液、磷酸溶液，震荡，制备含多奈哌齐浓度梯度的参比液；所述含多奈哌齐的二甲基亚砜溶液与步骤(1)加入的所述二甲基亚砜溶液体积相等；

(3)检测：将所述待测液或所述含多奈哌齐浓度梯度的参比液加入微流控芯片的样品池中，加入含有二甲基亚砜的缓冲溶液，采用非接触电导法检测；

步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中，所述二甲基亚砜溶液的体积浓度为0.5-5％；

步骤(3)中，所述的缓冲溶液由三乙胺溶液、磷酸溶液组成，其中三乙胺溶液与磷酸溶液的浓度分别为0.9～150mmol/L、0.3～50mmol/L且浓度比值大于等于3；

步骤(1)和步骤(2)中，所述的上清液、三乙胺溶液、磷酸溶液的体积比为8：(1～2)：(0.3～0.6)，所述的三乙胺溶液的浓度范围为50～150mmol/L，所述磷酸溶液的浓度为50～150mmol/L，加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白、震荡后离心所采用的条件为：8000～12000rpm、20～30min。

2.根据权利要求1所述的检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，步骤(1)和/或步骤(2)中，所述的三乙胺溶液的浓度范围为75～125mmol/L，所述磷酸溶液的浓度为75～125mmol/L，加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白、震荡后离心所采用的条件为：9000～11000rpm、23～27min。

3.根据权利要求1所述的检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的缓冲溶液由三乙胺溶液、磷酸溶液组成，其中三乙胺溶液与磷酸溶液的浓度分别为3～30mmol/L、1～10mmol/L且浓度比值大于等于3。

4.根据权利要求1所述的检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，步骤(1)和/或步骤(2)和/或步骤(3)中，所述二甲基亚砜的体积浓度为1～3％。

5.根据权利要求2所述的检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，步骤(1)和/或步骤(2)中，所述的上清液、三乙胺溶液、磷酸溶液的体积比为8：1.5：0.5，所述的三乙胺溶液的浓度为100mmol/L，所述磷酸溶液的浓度为100mmol/L，加入三氯乙酸溶液沉淀蛋白、震荡后离心所采用的条件为：10000rpm、25min。

6.根据权利要求3所述的检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的缓冲溶液由三乙胺溶液、磷酸溶液组成，其中三乙胺溶液与磷酸溶液的浓度分别为15mmol/L、5mmol/L。

7.根据权利要求4所述的检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，步骤(1)和/或步骤(2)和/或步骤(3)中，所述二甲基亚砜的体积浓度为2％。

8.根据权利要求1至7任一项所述的检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，步骤(3)包括如下步骤：

1)取微流控芯片，加入缓冲液，使所述微流控芯片的样品池、样品废液池、缓冲液储存池、缓冲液废液池、进样通道和分离通道均充满缓冲液；

2)吸去所述样品池、缓冲液储存池中的所述缓冲液；

3)向缓冲液储存池中加入添加有体积分数不低于10％的乙醇的所述缓冲液，向样品池中加入所述待测液或含多奈哌齐浓度梯度的参比液；

4)插入电极，以样品池为正极、样品废液池为负极进行进样，所述进样结束后，以缓冲液储存池为正极、缓冲液废液池为负极进行分离；所述进样、分离结束后再重复所述进样、分离至少一次，获得检测结果；

所述缓冲液选用前述步骤(3)含有二甲基亚砜的缓冲溶液。

9.根据权利要求8所述的检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，步骤1)中，所述微流控芯片经过如下预处理：

所述微流控芯片为首次使用的微流控芯片，则依次采用硝酸溶液、双蒸馏水、氢氧化钠溶液、双蒸馏水冲洗；

所述微流控芯片为重复使用的微流控芯片，则先采用氢氧化钠溶液对进样通道、分离通道进行活化，再用双蒸馏水清洗，最后用所述缓冲液平衡。

10.根据权利要求1至9任一项所述的检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述检测选择的分离电压为1kv～2kv、激发频率为50kHz～70kHz、激发电压为50V～70V。

11.根据权利要求10所述的检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，所述检测选择的分离电压为2kv、激发频率为60kHz、激发电压为60V。

12.根据权利要求1至7任一项所述的检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，所述的三氯乙酸溶液的质量浓度为15％～25％。

13.根据权利要求12所述的检测多奈哌齐血药浓度的方法，其特征在于，所述的三氯乙酸溶液的质量浓度为20％。

Images