ES2634002T3 - Construcción covalentemente cerrada de ADN inmunomodulador no codificante - Google Patents

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Abstract

Una construcción de ADN para la inmunomodulación que consiste en una cadena de residuos de ADN, covalentemente cerrada, en forma de doble asa, parcialmente monocatenaria, que comprende dos veces la secuencia de ADN parcialmente hibridada de sec. con núm. de ident.: 1.

Description

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DESCRIPCION
Construccion covalentemente cerrada de ADN inmunomodulador no codificante Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a una construccion de ADN covalentemente cerrada, una composicion farmaceutica y una vacuna y su uso para la modulacion del sistema inmunitario.
Antecedentes de la invencion
El termino "inmunoterapia" define el tratamiento de enfermedades mediante la induccion, potenciacion o supresion de una respuesta inmunitaria. La estrategia de las inmunoterapias es luchar contra las enfermedades, tales como cancer, enfermedades infecciosas, alergia y asma.
Se conocen una diversidad de agentes activos, denominados inmunomoduladores, que pueden usarse en la inmunoterapia. Las secuencias de ADN espedficas pertenecen a esos inmunomoduladores conocidos. La mayona de las secuencias de ADN cortas inmunomodificadoras conocidas contienen un motivo de citosina guanina no metilado (motivo CG), que se ha descrito por Krieg y otros. (Nature 1995 374: 6522 546-549). La ocurrencia de motivos CG no metilados se suprime esencialmente en el genoma de eucariotas en comparacion con procariotas o virus. Por lo tanto, las moleculas de ADN que contienen un motivo de ese tipo han evolucionado como una "senal de peligro" natural y activan el sistema inmunitario en la lucha contra patogenos procariotas o virales. Esto puede explotarse terapeuticamente o profilacticamente usando tales secuencias para tratar o prevenir infecciones con inmunoterapia.
Las construcciones de ADN que comprenden motivos CG no metilados son capaces de provocar un considerable efecto fisiologico estimulando fuertemente las celulas efectoras del sistema inmunitario innato que incluyen las celulas dendnticas, macrofagos, celulas asesinas naturales (NK) y NKT. Los motivos CG no metilados se detectan por el receptor de tipo Toll (TLR) 9 receptor de reconocimiento del patron inmunitario innato. Si bien el mecanismo de reconocimiento exacto aun no se ha comprendido completamente, se ha logrado un progreso significativo en aclarar las vfas subyacentes (A. Krieg, Nat. Rev. Drug Disc., 5:471-484, 2006).
Se supone que tras la union de las construcciones de ADN que contienen los GC no metilados al receptor, se activan multiples cascadas de senales en las celulas respondedoras. Mediante la regulacion positiva de las moleculas superficiales caractensticas y la secrecion de citoquinas, se induce la inmunidad adaptativa con un patron Th1 predominante. Tales construcciones pueden usarse en combinacion con, por ejemplo, anticuerpos, quimioterapia o terapia de radiacion, vacunas o citoquinas. Las enfermedades alergicas y el asma son en su mayona mediadas porTh2. Mediante el aumento de la relacion de Th1/Th2, las respuestas mediadas por Th2 se atenuan y de ese modo estos tipos de enfermedades pueden tratarse o prevenirse.
Las moleculas de superficie, que se regulan positivamente por la via TLR-9, incluyen, por ejemplo, CD40, CD69, CD80, CD86 o CD169, en dependencia del tipo de celula. La secrecion potenciada de citoquinas es ademas caractenstica para diferentes tipos de celulas; las citocinas incluyen, por ejemplo, protemas inflamatorias de macrofagos (MIP)-1alfa, MIP- Ibeta, interleuquina (IL)-6, IL-8, interferon (IFN)-alfa, factor de necrosis tumoral (TNF)-alfa, IFN-gamma, protema quimiotactica de monocitos (MCP)-1 o protema inducida por IFN-gamma de 10 kDa (IP-10).
Para prevenir o tratar enfermedades, la vacunacion se ha demostrado como un enfoque muy efectivo. Para asegurar una respuesta inmunitaria fuerte y duradera, los adyuvantes capaces de estimular las celulas presentadoras de antfgeno, tales como celulas dendnticas, se administran usualmente junto con el antfgeno, y para ese proposito se ha demostrado que los agonistas de TLR9 son potentes inmunoestimulantes.
Los estudios preclmicos y clmicos en curso apoyan el uso de agonistas de TLR-9 como inmunomoduladores y/o adyuvantes, y demuestran su efecto antitumoral mejorando tanto las respuestas humorales como celulares.
Independientemente de cualquier explicacion de los mecanismos subyacentes por los cuales los motivos CG no metilados influyen o modulan una respuesta inmunitaria, se desarrollaron muchos enfoques para la modulacion del sistema inmunitario mediante el uso de tales motivos. El documento de patente WO 1998/018810 describe que las secuencias inmunoestimuladoras que contienen motivos CG no metilados son aun mas eficaces cuando forman parte de una unica cadena. Sin embargo, administrar una molecula de ADN monocatenario de cadena abierta no es practicable debido a la rapida degradacion de los acidos nucleicos monocatenarios. Consecuentemente, se desarrollaron diferentes metodos para la proteccion de las construcciones de ADN monocatenarias o bicatenarias que comprenden un motivo CG no metilado.
Para lograr resistencia contra la degradacion por nucleasas de ADN, los enlaces fosfodiester en el esqueleto de un polfmero de acido nucleico se modifican frecuentemente a fosforotioatos. Ademas de una actividad algo menos estimuladora de tales acidos nucleicos protegidos con fosforotioato, los ensayos clmicos en los ultimos anos mostraron
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que la toxicidad de una proteccion con fosforotioato excluye o limita severamente tales acidos nucleicos de cualquier uso en las composiciones farmaceuticas o medicamentos.
A partir de las 4 clases de activadores conocidos con perfiles de inmunomodulacion distintos, todos los miembros excepto uno comprenden moleculas lineales de ADN. La excepcion se describe en el documento de patente EP 1 196 178. Este documento describe moleculas de acido desoxirribonucleico cortas, que comprenden una secuencia de residuos de nucleotidos covalentemente cerrada, en forma de doble asa, parcialmente monocatenaria, que comprende motivos CG ("dSLIM") que consiste totalmente en ADN natural. De conformidad con la descripcion del documento de patente EP 1 196 178 los motivos CG se situan dentro de los bucles monocatenarios en ambos extremos del tallo bicatenario de la molecula descrita o dentro del tallo bicatenario. Los bucles de la horquilla monocatenaria protegen un tallo bicatenario de la degradacion por las nucleasas de ADN dentro o fuera de la celula. El documento de patente US 2009/0053250 A1describe tales moleculas covalentemente cerradas, en forma de doble asa, que comprenden motivos CG en combinacion con farmacos quimioterapeuticos. El documento de patente US 2007/0049546 A1describe las moleculas covalentemente cerradas, en forma de doble asa, que comprenden motivos CG con uno o mas sustituyentes covalentemente unidos. La publicacion "Schmidt M. y otros, 2006, "Cytokine and Ig-production by CG-containing sequences with phosphorodiester backbone and dumbbell shape", Allergy, vol. 61, pags. 56-63" sugiere que tales moleculas covalentemente cerradas, en forma de doble asa, que comprenden ciertos motivos CG, podnan ser utiles en el tratamiento de enfermedades alergicas.
El documento WO 2010/039137 describe oligonucleotidos reguladores inmunitarios como antagonistas de enfermedades mediadas por TLR que tienen una o mas modificaciones qmmicas en la secuencia que flanquea un motivo estimulador inmunitario y/o un motivo oligonucleotfdico que sena estimulador inmunitario pero para la modificacion. Asf, la intencion de los oligonucleotidos descritos del documento de patente WO 2010/039137 es suprimir una respuesta inmunitaria causada por los TLR.
El documento WO 2005/042018 describe nuevos oligonucleotidos denominados CpG de clase C, en donde un oligonucleotido de clase c se caracteriza por secuencias CpG, generalmente situadas en o cerca del extremo 5' o extremo 3' de la molecula, y un motivo palmdromo rico en gC, situado generalmente en o cerca del otro extremo de la molecula. El documento describe las variaciones de la secuencia palindromica de un ADN de clase c.
La publicacion citada anteriormente "A. Krieg, Nat. Rev. Drug Disc., 5:471-484, 2006" describe clases distintas de oligodesoxinucleotidos de CpG y sus efectos pero no describe moleculas covalentemente cerradas, en forma de doble asa, que comprenden motivos CG que evitan la modificacion de fosforotioato.
El documento WO 2004/000873 A2 describe ademas ADN monocatenario que contiene CG modificado con fosforotioato, que puede anadirse a peptidos de fusion como adyuvante. Este documento no describe moleculas covalentemente cerradas, en forma de doble asa, que comprenden motivos CG.
Similarmente, el documento US 2003/0050263 se refiere a oligonucleotidos que contienen CG en el contexto del tratamiento de infecciones por VIH pero no trata con moleculas covalentemente cerradas, en forma de doble asa que comprenden motivos CG en cualquier contexto de secuencia.
El documento WO 2007/131495 A2 se refiere a una molecula de acido nucleico no codificante multimerica para modular la actividad del sistema inmunitario humano o animal y a un proceso de preparacion de esta y una vacuna que comprende la molecula de acido nucleico no codificante multimerica. El documento no describe una construccion de ADN que comprende la sec. con num. de ident.: 1.
Breve resumen de la invencion
Con respecto al estado de la tecnica, es un objetivo de la presente descripcion proporcionar construcciones de ADN inmunomoduladoras alternativas con un potencial inmunomodulador elevado que sea estable despues de transferirse a celulas eucariotas y evitar efectos secundarios perjudiciales.
La presente invencion proporciona una construccion de ADN para la inmunomodulacion que consiste en una cadena de residuos de ADN covalentemente cerrada, en forma de doble asa, parcialmente monocatenaria, que comprende dos veces la secuencia de ADN parcialmente hibridada de sec. con num. de ident.: 1.
Como una modalidad adicional de la presente descripcion, se proporciona una construccion en donde un bucle monocatenario comprende tres motivos CG.
La invencion proporciona ademas una construccion de ADN en donde cada motivo CG se flanquea en ambos lados por una desoxitimidina.
Se pretende ademas que un bucle monocatenario de una construccion de conformidad con la invencion tenga un contenido de pirimidina de al menos 50%. Una construccion de ese tipo puede tener desoxitimidina como pirimidina.
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Como una modalidad adicional, la construccion comprende al menos un nucleotido que se modifica con un grupo funcional seleccionado del grupo que comprende grupos carboxilo, amina, amida, aldimina, cetal, acetal, ester, eter, disulfuro, tiol y aldetndo.
Ademas, el nucleotido modificado puede unirse a un compuesto seleccionado a partir del grupo que comprende peptidos, protemas, carbohidratos, anticuerpos, Kpidos, micelas, vesfculas, moleculas sinteticas, poUmeros, micro proyectiles, partfculas metalicas, nanopartfculas o una fase solida.
Otro objeto de la presente invencion es una composicion farmaceutica que comprende una construccion de ADN como se describio anteriormente. La composicion farmaceutica puede comprender adicionalmente un quimioterapeutico.
Un objeto adicional de la presente invencion es una vacuna que comprende una construccion de ADN como se describio anteriormente o una composicion farmaceutica que comprende dicha construccion de ADN. Se preve ademas que la vacuna puede comprender la construccion de ADN de la presente descripcion como adyuvante.
Otro objeto de la presente invencion es el uso de una construccion de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, una composicion farmaceutica de conformidad con las reivindicaciones 8 o 9 o una vacuna de conformidad con las reivindicaciones 10 u 11 para el tratamiento de cancer o enfermedades autoinmunitarias.
Ademas se preve el uso de una construccion de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, una composicion farmaceutica de conformidad con las reivindicaciones 8 o 9 o una vacuna de conformidad con las reivindicaciones 10 o 11 para la modulacion del sistema inmunitario.
Descripcion detallada de la invencion
Dentro del significado de la presente descripcion, el termino construccion de ADN no indica una limitacion de la longitud de la secuencia de ADN correspondiente. Las unidades monomericas de las construcciones de ADN son nucleotidos.
Una construccion de ADN puede fabricarse sinteticamente o ser parcial o totalmente de origen biologico, en donde un origen biologico incluye metodos de fabricacion genetica de secuencias de ADN.
Un "tallo" de conformidad con la presente descripcion se entendera como un ADN bicatenario formado por el emparejamiento de bases ya sea dentro de la misma molecula de ADN (que es despues parcialmente autocomplementaria) o dentro de diferentes moleculas de ADN (que son parcial o completamente complementarias). El emparejamiento de base intramolecular designa el emparejamiento de bases dentro de las mismas moleculas y el emparejamiento de bases entre diferentes moleculas de ADN se denomina emparejamiento intermolecular de base.
Un "bucle" dentro del significado de la presente descripcion se entendera como una region monocatenaria no emparejada ya sea dentro o en el extremo de una estructura de tallo. Una "horquilla" es una combinacion distinta de un tallo y un bucle, que ocurre cuando dos regiones autocomplementarias de la misma molecula de ADN hibridan para formar un tallo con un bucle no emparejado. Una forma de doble asa describe una construccion de ADN lineal con horquillas en ambos extremos que flanquean una region de tallo. Asf, una "construccion de ADN lineal" dentro del contexto de la presente descripcion describe ya sea una construccion de ADN de cadena abierta lineal que comprende ADN monocatenario y/o bicatenario o una construccion de ADN lineal en forma de doble asa que comprende bucles monocatenarios en ambos extremos de un tallo de ADN bicatenario.
Una "fase solida" a la cual los nucleotidos se unen covalentemente o no covalentemente se refiere, pero no se limita a, una columna, una matriz, perlas, vidrio que incluyen vidrio modificado o funcionalizado, sflice o materiales a base de sflice que incluyen silicio y silicona modificada, plasticos (que comprenden polipropileno, polietileno, poliestireno y copolfmeros de estireno y otros materiales, acnlicos, polibutileno, poliuretanos, etc.), nylon o nitrocelulosa, resinas, polisacaridos, carbono, asf como vidrios inorganicos, metales, nanopartfculas y plasticos. Asf, las placas de microtitulacion estan ademas dentro del alcance de una fase solida de conformidad con la presente descripcion.
La inmunomodulacion de conformidad con la presente descripcion se refiere a inmunoestimulacion e inmunosupresion. La inmunoestimulacion significa preferentemente que las celulas efectoras del sistema inmunitario se estimulan para proliferar, migrar, diferenciarse o activarse en cualquier otra forma. La proliferacion de celulas B, por ejemplo, puede inducirse sin senales coestimuladoras por moleculas de ADN inmunoestimuladoras, que normalmente requieren una senal coestimuladora de las celulas T auxiliares.
La inmunosupresion, por otra parte, se entendera como la reduccion de la activacion o eficacia del sistema inmunitario. La inmunosupresion generalmente se induce deliberadamente para evitar por ejemplo el rechazo de un organo trasplantado, para tratar la enfermedad de injerto contra huesped despues de un trasplante de medula osea o para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como, por ejemplo, artritis reumatoide o enfermedad de Crohn.
En este contexto, la inmunomodulacion ademas puede referirse a la influencia de la naturaleza o el caracter de una
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reaccion inmunitaria, ya sea afectando una reaccion inmunitaria que se esta desarrollando o madurando o modulando el caracter de una reaccion inmunitaria establecida.
El termino "vacunacion" usado en esta descripcion se refiere a la administracion de material antigenico (una vacuna) para producir inmunidad a una enfermedad. Las vacunas pueden prevenir o mejorar los efectos de la infeccion por muchos patogenos tales como virus, hongos, parasitos protozoarios, bacterias, pero ademas de enfermedades alergicas y asma, asf como de tumores. Las vacunas contienen tipicamente uno o mas adyuvantes, por ejemplo acidos nucleicos inmunoestimuladores, usados para aumentar la respuesta inmunitaria. Generalmente se considera que la vacunacion es el metodo mas efectivo y rentable para prevenir enfermedades infecciosas y otras.
El material administrado puede ser, por ejemplo, formas vivas pero debilitadas de patogenos (bacterias o virus), formas muertas o inactivadas de estos patogenos, material purificado tales como protemas, acidos nucleicos que codifican antigenos o celulas tales como celulas tumorales o celulas dendnticas. Particularmente, se ha desarrollado recientemente la vacunacion con ADN. La vacunacion con ADN funciona mediante la insercion (y la expresion, activando el reconocimiento del sistema inmunitario) de ADN que codifica antigenos en celulas humanas o animales. Algunas celulas del sistema inmunitario que reconocen las protemas expresadas montaran un ataque contra estas protemas y contra las celulas que las expresan. Una ventaja de las vacunas de ADN es que son muy faciles de producir y almacenar. Ademas, las vacunas de ADN tienen una serie de ventajas sobre las vacunas convencionales, que incluyen la capacidad de inducir una variedad mas amplia de tipos de respuesta inmunitaria.
La vacunacion puede usarse como un enfoque profilactico, conduciendo a la inmunidad contra el antigeno en el individuo sano, vacunado tras la exposicion al antigeno. Alternativamente, una vacunacion terapeutica puede causar una respuesta mejorada del sistema inmunitario del individuo enfermo vacunado, guiando el sistema inmunitario del individuo hacia los antigenos. Tanto la vacunacion profilactica como la terapeutica pueden aplicarse a seres humanos asf como a animales.
El termino "terapia genica" usado en esta descripcion se refiere a la modificacion genetica transitoria o permanente (por ejemplo, insercion, alteracion o eliminacion de genes) de las celulas y/o tejidos biologicos de un individuo para tratar enfermedades tales como tumores o enfermedades autoinmunitarias. La forma mas comun de terapia genica implica la insercion de genes funcionales en una localizacion genomica no especificada para reemplazar un gen mutado, pero otras formas implican corregir directamente la mutacion o modificar un gen normal que permite una infeccion viral o incluso transferir un gen o un fragmento genico en una celula para su transcripcion.
"Terapia genica autologa" se refiere al uso de tejidos o celulas del mismo individuo. Las celulas o tejidos aislados se modificaran mediante terapia genica y se reintroduciran en el donante. En contraste, la "terapia genica alogenica" se refiere al uso de celulas para terapia genica de un individuo distinto del individuo aceptor. Despues de la modificacion genetica, las celulas alogenicas se introducen en el aceptor.
El termino "terapia genica ex vivo" se refiere a un enfoque terapeutico en el que las celulas de un individuo, por ejemplo celulas madre hematopoyeticas o celulas progenitoras hematopoyeticas, se modifican geneticamente ex vivo y posteriormente se introducen en el individuo que se trata. El termino "terapia genica in-vivo" se refiere a un enfoque terapeutico en el que las celulas de un individuo, por ejemplo, celulas madre hematopoyeticas o celulas progenitoras hematopoyeticas, se modifican geneticamente in vivo, usando por ejemplo vectores virales u otras construcciones de expresion.
La terapia genica puede clasificarse ademas en "terapia genica de lmea germinal" y "terapia genica somatica". En el caso de la "terapia genica de lmea germinal", las celulas germinales, es decir, esperma u huevos, se modifican geneticamente. Los cambios geneticos se integran normalmente en sus genomas. Por lo tanto, el cambio debido a la terapia sena heredable y sena transmitido a generaciones posteriores. Este enfoque es util para el tratamiento de los trastornos geneticos y enfermedades hereditarias. En el caso de la "terapia genica somatica", los genes terapeuticos se transfieren a las celulas somaticas de un individuo. Cualquier modificacion y efecto se limitara al individuo solamente, y no sera heredado por la descendencia o generaciones posteriores del individuo.
El termino "cancer" comprende enfermedades cancerosas o un tumor que se trata o se previene que se selecciona del grupo que comprende, pero no se limita a, carcinomas mamarios, melanoma, neoplasmas de piel, linfoma, leucemia, tumores gastrointestinales, que incluyen carcinomas de colon, carcinomas de estomago, carcinomas de pancreas, cancer de colon, cancer de intestino delgado, carcinomas ovaricos, carcinomas cervicales, cancer de pulmon, cancer de prostata, carcinomas de celulas renales y/o metastasis hepaticas.
Las enfermedades autoinmunitarias de conformidad con la presente descripcion comprenden artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, lupus sistemico (SLE), tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis multiple, enfermedad de Graves, miastenia gravis, enfermedad celfaca y enfermedad de Addison.
La presente descripcion proporciona una construccion de ADN para la inmunomodulacion que consiste en una cadena de residuos de ADN covalentemente cerrada, en forma de doble asa, parcialmente monocatenaria, que comprende dos veces la secuencia de ADN de la sec. con num. de ident.: 1. La sec. con num. de ident.: 1 comprende motivos CG y
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ademas se denomina ODN2006-bucle. Dos oligonucleotidos de ODN2006-bucle se hibridaran parcialmente y resultaran una construccion de ADN lineal en forma de doble asa. La secuencia de la sec. con num. de ident.: 1 es la siguiente (comp fig. 1)
5’-AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT-3’
El efecto de las construcciones de ADN que contienen CG depende de su interaccion con TLR9. Como se muestra en los ejemplos y las figuras, las diferencias en los perfiles de inmunomodulacion entre las clases de agonistas de TLR9 parecen mas estrechamente relacionadas con su conformacion que sus secuencias de nucleotidos individuales, correspondientemente el contexto de los motivos CG.
Sorprendentemente, el patron de estimulacion inducido de una construccion de ADN en forma de doble asa de la presente descripcion difiere del patron de estimulacion inducido por el correspondiente oligonucleotido CG lineal o incluso la construccion de ADN en forma de doble asa descrito en el documento de patente EP 1 196 178.
El patron de estimulacion inducida difiere incluso inesperadamente del patron inducido por el ADN lineal protegido con fosforotioato oligo ProMune (ODN2006). La secuencia de ProMune es parte del bucle monocatenario de una construccion de ADN de conformidad con la presente descripcion, reforzando la relevancia del contexto de un motivo CG que contiene la secuencia de ADN.
De conformidad con la presente descripcion, el/los motivos CG se situan dentro de la region monocatenaria de la construccion. Como se ha descrito en el documento de patente EP 1 196 178, los motivos CG son capaces de desencadenar una respuesta inmunitaria independientemente de si se incluyen dentro de la region monocatenaria o dentro de la cadena bicatenaria de la molecula.
La descripcion comprende ademas modificaciones qmmicas de al menos un nucleotido con un grupo funcional seleccionado del grupo que comprende grupos carboxilo, amina, amida, aldimina, cetal, acetal, ester, eter, disulfuro, tiol y aldeddo. Esto permite acoplar la construccion de ADN a un compuesto seleccionado del grupo que comprende peptidos, protemas, carbohidratos, anticuerpos, lipidos, micelas, vesiculas, moleculas sinteticas, polimeros, micro proyectiles, particulas metalicas, nanopartfculas o una fase solida, por ejemplo, adsorcion, union covalente o ionica. La modificacion puede seleccionarse espedficamente para el proposito respectivo. La construccion puede usarse de ese modo, por ejemplo, para transferir otras moleculas a la celula espedfica que responde a los motivos CG incorporados. Ademas, es posible mediante tales modificaciones acoplar la construccion a micro proyectiles que pueden usarse para transferir la construccion a la celula. La construccion ademas puede acoplarse a una fase solida, por ejemplo una placa de microtitulacion.
La activacion sesgada de Th1 implica la activacion de celulas NKy celulas T citotoxicas y estas respuestas inmunitarias pueden explotarse para la terapia del cancer. Dado que las construcciones de ADN que contienen motivos CG no metilados conducen preferentemente a la activacion Th1, las construcciones de la presente descripcion pueden usarse para tratar el cancer. Numerosos ensayos clinicos que implican agonistas de TLR9 para el tratamiento del cancer, estan en curso. Tales moleculas se han administrado efectivamente solas o en combinacion con, por ejemplo, radioterapia, cirugia, quimioterapia y crioterapia (Krieg, J. Clin. Invest.2007 117: 1184-94). Debido a su potente inmunomodulacion, su pequeno tamano y su estabilidad, se espera que las construcciones de la presente descripcion sean altamente ventajosas a este respecto. Ademas, su perfil inmunologico distintivo los distingue de otros ligandos de TLR9 menos ventajosos, y este perfil puede explotarse para el tratamiento espedfico del cancer.
Por otra parte, los agonistas de TLR9 ademas se implican en la generacion de celulas T reguladoras y asi pueden usarse para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. La via de administracion parece ser una variable que determina el efecto de las construcciones de ADN que contienen in vivo motivos CG (Krieg, J. Clin. Invest.2007 117: 1184-94).
Se ha demostrado que el efecto inmunoestimulador de tales moleculas de ADN que contienen motivos CG mejora la eficacia de los enfoques terapeuticos estandar, tales como quimioterapeuticos, en la terapia del cancer. Por lo tanto, ademas se proporcionan composiciones farmaceuticas, que comprenden las construcciones de la presente descripcion. De nuevo, las caracteristicas ventajosas de las construcciones de la presente descripcion en comparacion con los agonistas de TLR9 del estado de la tecnica hacen que las construcciones de la presente invencion prometan herramientas para el tratamiento de enfermedades tales como cancer, enfermedades infecciosas, alergias y asma. El tratamiento de las alergias y el asma (principalmente mediado porTh2) se beneficia de ese modo de la preferencia de la activacion Th1.
Dado que se ha demostrado que los agonistas de TLR9 son potentes adyuvantes en vacunas, ademas se proporcionan vacunas que comprenden las construcciones de ADN de la presente descripcion. Las construcciones de la presente descripcion comprenden las secuencias relevantes para la estimulacion de TLR9 sin la necesidad de introducir
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modificaciones para estabilizar el ADN, lo que podria encausar efectos secundarios. La vida media mas larga de la molecula asegura la estimulacion eficiente de manera que se espera una respuesta inmunitaria fuerte.
Para revelar el efecto de las construcciones de ADN de la presente description, se usaron las siguientes construcciones
de ADN para los evperimentos descritos en la presente deccripcinn (Tabla 1)
Sec. con num. de ident.:
Nombre Secuencia (5'-3') Nucleotidos modificados/evplicacion de la secuencia
1
30L204 AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT Construccion de ADN en forma de doble asa, secuencia ODN2006 PD en bucles formados de dos secuencias parcialmente hibridadas
2
dSLIM AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGTTCTT Construccion de ADN en forma de doble asa del documento de patente EP 1 196 178formado por dos secuencias parcialmente hibridadas
3
ODN2006-2 TCGTCGTTTT GTCGTTTTGT CGTT Construccion de ADN lineal, todos los enlaces fosfodiester (PD) modificados a fosforotioatos (PTO)
4
30L210 AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT Construccion de ADN en forma de doble asa, secuencia ODN2006 PTO en bucles formados de dos secuencias parcialmente hibridadas
Breve descripcion de las figuras
La descripcion se ilustrara adicionalmente mediante ejemplos y figuras sin estar limitada a las modalidades descritas. Se muestra:
Fig. 1 Secuencia y estructura de la construction de ADN 30L204
Fig. 2 Estimulacion de citoquinas en las PBMC
Fig. 3 Estimulacion de CD86 y CD169 en Monocitos, CD69 en celulas NKy frecuencia de CD86 en celulas B
Descripcion detallada de las figuras
Se hace referencia al documento de patente EP 1 196 178 B1 que describe la fabrication de una construccion de ADN covalentemente cerrada, en forma de doble asa, parcialmente monocatenaria. Una construccion de la presente invention se hace en consecuencia.
La Figura 1 muestra la estructura y secuencia de una construccion de ADN de conformidad con la presente descripcion.
La Figura 2 muestra los resultados de las PBMC estimuladoras con 3 ^M de las construcciones de ADN indicadas descritas anteriormente en la Tabla 1.
El uso de construcciones de ADN que tienen esqueletos modificados con fosforotioato (ODN2006-2 y 30L210) no conduce a una estimulacion de IFN-alfa y de IP-10. Sorprendentemente, la construccion de ADN de la presente descripcion (30L204) conduce a una estimulacion significativamente mejorada de citoquina de IFN-alfa y de IP-10 en comparacion con la ya conocida construccion de ADN en forma de doble asa del documento de patente EP 1 196 178(dSLIM).
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El IFN-alfa ha sido conocido como una citoquina antiviral durante muchos anos. Estimula el desarrollo de celulas Th1, promoviendo por tanto los efectos de las moleculas de ADN que contienen CG. El IFN-alfa ademas exhibe actividad antitumoral en tumores malignos de raton y humanos y es capaz de disminuir la tumorigenicidad de celulas tumorales trasplantadas, parcialmente activando las celulas T citotoxicas y aumentando de ese modo la probabilidad de citolisis de celulas tumorales. La actividad de las celulas NK y de los macrofagos, ambas ademas importantes para la citotoxicidad antitumoral, se aumentan ademas por IFN-alfa (Brassard y otros, J. Leukoc. Biol. 2002 71: 565-81). Por lo tanto, se espera que el aumento de la cantidad de IFN-alfa tras la estimulacion con las construcciones de ADN de la presente descripcion sea beneficioso para el tratamiento del cancer.
Se ha demostrado recientemente que IP-10 es una potente protema angiostatica in vivo. As^ la induccion de IP-10 especialmente en el tratamiento de las enfermedades tumorales parece sertambien una ventaja.
La estimulacion de IFN-gamma ademas se aumenta por la construccion de ADN de la presente descripcion en comparacion con el dSLIM. La estimulacion del IFN-gamma parece ser dependiente de la secuencia, ya que el 30L210 ademas esta estimulando su secrecion, pero hay que tener en cuenta que 30L210 tiene un esqueleto fosforotioato, que puede causar efectos secundarios graves. Asf, la construccion de ADN de la presente descripcion es beneficiosa con respecto a aspectos de seguridad.
La IL-8 se estimula por ambas construcciones de ADN que tienen esqueleto fosforotioato (ODN2006-2; 30L210). Asf, el efecto observado puede deducirse con esta modificacion. La construccion de ADN de la presente descripcion no aumenta la produccion de IL-8, lo cual es beneficioso.
La IL-8 es una citoquina proinflamatoria, que se conoce que media la activacion y migracion de los neutrofilos en el tejido de la sangre periferica. La infiltracion neutrofflica resultante puede ser parcialmente responsable de la inhibicion del crecimiento tumoral como se ha demostrado para el cancer de ovario (Lee y otros, J. Immunol. 2000 164: 2769-75). Ademas, la IL-8 tambien es quimiotactica para las celulas T y basofilos. Por lo tanto, para el tratamiento o prevencion de al menos algunos tipos de tumores, es ventajoso aumentar selectivamente la IL-8 en respuesta a las construcciones de ADN que contienen CG. Por otra parte, se ha establecido que la IL-8 desencadena la angiogenesis de manera que la induccion de la secrecion de IL-8 puede ser contraproducente. Asf, los diferentes grados de induccion de IL-8 por las diferentes moleculas de ADN de la presente invencion podnan permitir una adaptacion de la molecula a los efectos terapeuticos deseados.
Asf, el patron de citoquinas espedfico inducido por una construccion de ADN de la presente descripcion es beneficioso para el tratamiento y la prevencion de tipos de tumores distintos. Obviamente, el contexto espedfico en el que el motivo CG no metilado se incorpora a TLR9 que incluyen la conformacion de la construccion de ADN determina el patron de estimulacion respectivo individual inducido en las celulas respondedoras.
La Figura 3 muestra la estimulacion de Monocitos con las construcciones de ADN enumerados en la tabla 1. La construccion de ADN de la presente descripcion mejora la activacion de monocitos con respecto a CD86 y CD169 en comparacion con dSLIM y el oligo lineal protegido con fosforotioato ODN2006-2. La mejor activacion de CD69 es en celulas NK ademas se logra con la construccion de ADN de la presente invencion.
Aunque la activacion de monocitos y celulas NK es mas o menos comparable con la ODN2006 lineal, de nuevo, hay que tener en cuenta que este oligo tiene un esqueleto fosforotioato que puede causar efectos secundarios graves.
La activacion de celulas B es mas o menos comparable entre el ODN2006-2 lineal y la construccion de ADN en forma de doble asa de la presente descripcion. La comparacion de las dos construcciones de ADN en forma de doble asa dSLIM y 30L204 muestra que 30L204 es sorprendentemente un activador mucho mas potente que dSLIM.
En conclusion, los experimentos muestran que la construccion de ADN en forma de doble asa de la presente descripcion es inesperadamente un mejor activador de celulas inmunitarias que la ya conocida construccion de ADN en forma de doble asa dSLIM y el oligodesoxinucleotido lineal ODN2006 (PROMUNE®). Fue sorprendente que la introduccion de la secuencia de ADN de ODN2006 sin fosforotioato en los bucles monocatenarios de una construccion de ADN lineal en forma de doble asa conduzca a una mejora del potencial inmunomodulador.
ODN2006 (ProMune ®) y dSLIM son conocidos como inmunomoduladores potentes. La introduccion del fosforotioato ODN2006 en los bucles monocatenarios de dSLIM no resulta en un inmunomodulador eficiente (comp. figura 1 IFN-alfa y de IP-10). La construccion de ADN de la presente descripcion que tiene la secuencia de ODN2006 con enlaces fosfodiester en los bucles monocatenarios resulta en una nueva construccion con una eficiencia que esta mas alla de la mera adicion de los efectos de ODN2006 y dSLIM. Asf, se ha de concluir que la construccion de ADN de la presente descripcion es un nuevo agonista de tLR-9 que puede usarse para el tratamiento de cancer o enfermedades autoinmunitarias aumentando la secrecion de citoquinas de la citoquina anticancer central IFN-alfa, la potente citoquina angiostatica IP-10, o IFN-gamma, el activador clave de NK-, NKT- y respuestas de celulas T citotoxicas.
Ademas fue posible mostrar que la construccion de ADN de la presente descripcion es un fuerte regulador de los
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Claims (9)

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    Reivindicaciones
    1. Una construccion de ADN para la inmunomodulacion que consiste en una cadena de residuos de ADN, covalentemente cerrada, en forma de doble asa, parcialmente monocatenaria, que comprende dos veces la secuencia de ADN parcialmente hibridada de sec. con num. de ident.: 1.
  2. 2. La construccion de conformidad con la reivindicacion 1, en donde al menos un nucleotido se modifica con un grupo funcional seleccionado del grupo que comprende grupos carboxilo, amina, amida, aldimina, cetal, acetal, ester, eter, disulfuro, tiol y aldehfdo.
  3. 3. La construccion de conformidad con la reivindicacion 2, en donde el nucleotido modificado se une a un compuesto seleccionado del grupo que comprende peptidos, protemas, carbohidratos, anticuerpos, lfpidos, micelas, vesfculas, moleculas sinteticas, polfmeros, micro proyectiles, partfculas metalicas, nanopartfculas, o una fase solida.
  4. 4. Una composicion farmaceutica que comprende una construccion de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  5. 5. La composicion farmaceutica de conformidad con la reivindicacion 4, que comprende adicionalmente un quimioterapeutico.
  6. 6. Una vacuna que comprende una construccion de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  7. 7. La vacuna de conformidad con la reivindicacion 6, en donde la construccion de ADN se comprende como adyuvante.
  8. 8. Una construccion de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una composicion
    farmaceutica de conformidad con las reivindicaciones 4 o 5 o una vacuna de conformidad con las
    reivindicaciones 6 o 7 para su uso en el tratamiento de cancer o enfermedades autoinmunitarias.
  9. 9. Una construccion de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una composicion
    farmaceutica de conformidad con las reivindicaciones 4 o 5 o una vacuna de conformidad con las
    reivindicaciones 6 o 7 para su uso en la modulacion del sistema inmunitario.
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