KR101831713B1 - 공유결합적으로 폐쇄된 논-코딩 면역조절 dna 구조체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 공유결합적으로 폐쇄된 DNA 구조체, 약학 조성물 및 백신, 그리고 이들의 면역 시스템의 조절용으로 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특정 DNA 서열을 포함하는 면역조절용 DNA 구조체를 제공한다.

Description

공유결합적으로 폐쇄된 논-코딩 면역조절 DNA 구조체{COVALENTLY CLOSED NON-CODING IMMUNOMODULATORY DNA CONSTRUCT}
본 발명은 공유결합적으로 폐쇄된 DNA 구조체, 약학 조성물 및 백신, 그리고 이들의 면역 시스템의 조절용으로서의 용도에 관한 것이다.
용어 "면역치료(immunotherapy)"는 면역 반응을 유도, 증가 또는 억제함으로써 질병을 치료하는 것으로 정의된다. 면역치료의 전략은 암, 감염성 질병, 알레르기 및 천식과 같은 질병들과 싸우는 것이다.
면역치료에 사용될 수 있는, 소위 면역조절제라 불리는 다양한 활성제가 알려져 있다. 특정 DNA 서열은 이러한 공지된 면역조절제에 속한다. 가장 잘 알려진 면역조절의(immunomodifying) 짧은 DNA 서열은 비메틸화된 시토신 구아닌 모티프(CG 모티프)를 함유하며, 이는 Krieg 등에 의해 기술된바 있다(Nature 1995, 374: 6522 546-549). 비메틸화된 CG 모티프의 발생은 원핵 생물이나 바이러스에 비해 진핵 생물의 게놈에서 실질적으로 억제된다. 따라서, 이러한 모티프를 함유하는 DNA 분자는 자연적인 "위험 신호(danger signal)"로서 전개되며, 원핵 생물 또는 바이러스 병원체와 싸울 때 면역 시스템을 촉발시킨다. 이는 면역치료로 감염을 치료 또는 예방하기 위해 이러한 서열을 사용함으로써 치료적으로 또는 예방적으로 이용될 수 있다.
비메틸화된 CG 모티프를 포함하는 DNA 구조체는 수지상 세포, 마크로파지, 자연살 세포(NK) 및 NKT 세포를 포함하는 선천적 면역 시스템의 작동체 세포를 강하게 자극함으로써 상당한 생리적 효과를 이끌어낼 수 있다. 비메틸화된 CG 모티프는 선천성 면역 패턴 인지 리셉터 톨형(Toll-like) 리셉터(TLR) 9에 의해 검출된다. 정확한 인지 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않지만, 기저 경로를 푸는데 현저한 진전이 이루어져 왔다(A. Krieg, Nat. Rev. Drug Disc., 5:471-484, 2006).
비메틸화된 CG들을 함유하는 DNA 구조체의 리셉터와의 바인딩시, 다중 신호 캐스캐이드가 반응 세포에서 활성화된다. 특징적인 표면 분자의 상향조절 및 사이토카인의 분비에 의해, 두드러진 Th1 패턴을 갖는 적응적 면역성이 유도된다. 이러한 구조체는 예를 들어, 항체, 화학 요법 또는 방사선 치료, 백신 또는 사이토카인과 함께 사용될 수 있다. 알레르기 질병 및 천식은 주로 Th2-매개성이다. Th1/Th2의 비율을 증가시킴으로써, Th2-매개된 반응은 약화되고, 이에 따라 이러한 타입의 질병이 치료되거나 예방될 수 있다.
TLR-9 경로에 의해 상향조절되는 표면 분자는 예를 들어, CD40, CD69, CD80, CD86 또는 CD169를 포함하며, 이는 세포 타입에 따라 달라진다. 또한 사이토카인의 증가된 분비는 구별되는 세포 타입에 대한 특징이며, 사이토카인은 예를 들어 마크로파지 염증 단백질(MIP)-1 알파, MIP-1 베타, 인터루킨(IL)-6, IL-8, 인터페론(IFN)-알파, 종양 괴사 인자(TNF)-알파, IFN-감마, 단핵세포 화학주성 단백질(MCP)-1 또는 10kDa의 IFN-감마-유도 단백질(IP-10)을 포함한다.
질병을 예방하거나 치료하기 위하여, 예방접종은 매우 효과적인 접근법으로 증명되었다. 강하면서 오래가는 면역 반응을 확보하기 위해, 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포를 자극할 수 있는 보조제(adjuvant)가 보통 항원과 함께 투여되며, 그 때문에 TLR9 아고니스트는 강력한 면역자극제인 것으로 나타났다.
임상전 및 진행중인 임상 연구들은 면역조절제 및/또는 보조제로서 TLR-9 아고니스트의 사용을 뒷받침하며, 체액성 및 세포성 반응 모두를 증가시킴으로써 이들의 항종양 효과를 입증한다.
비메틸화된 CG 모티프가 면역 반응에 영향을 미치거나 조절하는 기저 메커니즘의 어떠한 설명과 별도로, 이러한 모티프들을 사용함으로써 면역 시스템의 조절을 위해 다수의 접근법들이 개발되었다. WO 1998/018810에는 비메틸화된 CG 모티프를 함유하는 면역자극 서열들이 단일 스트랜드의 일부인 경우에도 보다 효과적인 것으로 개시되어 있다. 그러나, 개방 사슬 단일 스트랜드 DNA 분자를 투여하는 것은, 단일 스트랜드 핵산의 빠른 분해로 인해 실행 불가능하다. 결과적으로, 비메틸화된 CG 모티프를 포함하는 단일- 또는 이중-스트랜드 DNA 구조체의 보호를 위한 다른 방법들이 개발되었다.
DNA 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 저항성을 이루기 위해, 핵산 폴리머의 백본 내의 포스포디에스테르 결합은 종종 포스포로티오에이트로 변형된다. 이러한 포스포로디오에이트-보호된 핵산의 다소 덜 자극적인 활성인 것 외에, 마지막 해에서의 임상 시험은 포스포로티오에이트-보호의 독성이 약학 조성물 또는 의약에서의 어떠한 사용으로부터 이러한 핵산을 배제하거나 심하게 제한하는 것으로 나타났다.
구별되는 면역조절 프로필을 갖는 4 부류의 알려진 활성제로부터 하나를 제외하고 모든 멤버들은 선형 DNA 분자들을 포함하여 구성된다. 그 예외는 EP 1 196 178에 개시되어 있다. 이 문헌에는 완전히 자연 DNA로 구성된 CG 모티프("dSLIM")를 포함하는 뉴클레오타이드 잔기의 부분적으로 단일 스트랜드, 아령형, 공유결합적으로 폐쇄된 서열을 포함하는 짧은 데옥시리보핵산(DNA) 분자가 개시되어 있다. EP 1 196 178의 개시내용에 따르면, CG 모티프는 개시된 분자의 이중 스트랜드 스템의 양 말단에 있는 단일 스트랜드 루프 내에 위치하거나, 또는 상기 이중 스트랜드 스템 내에 위치한다. 단일 스트랜드 헤어핀 루프는 세포의 안과 밖에서 DNA 뉴클레아제에 의한 분해로부터 이중 스트랜드 스템을 보호한다. 문헌 US 2009/0053250 A1에는 화학치료 약물과 함께 사용되는 CG 모티프를 포함하는 이러한 아령형, 공유결합적으로 폐쇄된 분자가 개시되어 있다. US 2007/0049546 A1에는 공유결합으로 부착된 하나 이상의 치환체를 갖는 CG 모티프를 포함하는 아령형, 공유결합적으로 폐쇄된 분자가 개시되어 있다. 공개문헌 "Schmidt M. et al., 2006, "Cytokine and Ig-production by CG-containing sequences with phosphorodiester backbone and dumbbell shape", Allergy, Vol. 61, pp. 56-63"에는, 특정 CG 모티프를 포함하는 이러한 아령형, 공유결합적으로 폐쇄된 분자가 알레르기 질병의 치료에 유용할 수 있음이 제시되어 있다.
문헌 WO 2010/039137에는 면역 자극 모티프가 측면에 있는 서열 내에 및/또는 변형이 아니라면 면역 자극이 될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 모티프 내에 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 TLR 매개 질병을 위한 안타고니스트로서 면역 조절 올리고뉴클레오타이드가 개시되어 있다. 따라서, WO 2010/039137의 개시된 올리고뉴클레오타이드의 의도는 TLR들에 의해 야기된 면역 반응을 억제하는 것이다.
WO 2005/042018에는 신규의 소위 C-부류 CpG 올리고뉴클레오타이드가 기재되어 있으며, 여기서 c-부류 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 그 분자의 5' 말단 또는 3' 말단에 또는 근처에 위치한 CpG 서열 및 일반적으로 그 분자의 다른 말단에 또는 근처에 위치한 GC-풍부 팔린드롬(palindrome)으로 특징지어진다. 상기 문헌에는 c-부류 DNA의 팔린드롬 서열의 변이가 개시되어 있다.
상기 인용된 공개문헌 "A. Krieg, Nat. Rev. Drug Disc., 5:471-484, 2006"에는 별개 부류의 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 이들의 효과에 대해 개시되어 있으나, 포스포로티오에이트 변형을 회피하는 CG 모티프를 포함하는 아령형, 공유결합적으로 폐쇄된 분자가 개시되어 있지 않다.
또한 WO 2004/000873 A2에는 보조제로서 융합 펩타이드에 부가될 수 있는 포스포로티오에이트-변형된 CG-함유 단일-스트랜드 DNA가 개시되어 있다. 이 문헌에는 CG 모티프를 포함하는 아령형, 공유결합적으로 폐쇄된 분자가 개시되어 있지 않다.
이와 유사하게, US 2003/0050263은 HIV 감염의 치료 컨텍스트로 CG-함유 올리고뉴클레오타이드를 다루고 있으나, 어느 시퀀스 컨텍스트에서도 CG 모티프를 포함하는 아령형, 공유결합적으로 폐쇄된 분자를 다루고 있지 않다.
최신 기술과 관련하여, 본 발명의 목적은 진핵 세포 내로 전달한 후에 안정하고, 유해한 부작용을 회피하는 높은 면역조절 잠재력을 갖는 대체 면역조절 DNA 구조체를 제공하는 것이다.
본 발명은 부분적으로 하이브리드된 SEQ ID NO:1의 DNA 서열을 두 번 포함하며, 부분적으로 단일 스트랜드이고, 아령형이며, 공유결합적으로 폐쇄된 DNA 잔기의 사슬로 구성된, 면역조절용 DNA 구조체를 제공한다.
본 발명의 다른 구현으로, 단일 스트랜드 루프가 3개의 CG-모티프를 포함하는 구조체가 제공된다.
또한 본 발명은 각 CG-모티프는 양쪽에 데옥시티미딘이 측면에 있는 DNA 구조체를 제공한다.
또한 본 발명에 따른 구조체의 단일 스트랜드 루프는 적어도 50%의 피리미딘 함량을 갖는 것으로 의도된다. 이러한 구조체는 피리미딘으로서 데옥시티미딘을 가질 수 있다.
다른 구현으로서, 상기 구조체는 카보닐, 아민, 아미드, 알디민, 케탈, 아세탈, 에스테르, 에테르, 디설피드, 티올 및 알데히드 기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 작용기로 변형된 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함한다.
더욱이, 변형된 뉴클레오타이드는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 항체, 지질, 미셀(micelles), 소포, 합성 분자, 폴리머, 마이크로 프로젝틸(micro projectile), 금속 입자, 나노입자, 또는 고형상(solid phase)을 포함하는 그룹으로부터 선택된 화합물에 연결될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 DNA 구조체를 포함하는 약학 조성물이다. 상기 약학 조성물은 추가적으로 화학치료제를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 DNA 구조체를 포함하는 백신 또는 상기 DNA 구조체를 포함하는 약학 조성물이다. 또한 상기 백신은 보조제로서 본 발명의 DNA 구조체를 포함할 수 있는 것이 예상된다.
본 발명의 또 다른 목적은 청구항 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체, 청구항 제8항 또는 제9항에 따른 약학 조성물 또는 청구항 제10항 또는 제11항에 따른 백신의 암 또는 자가면역 질병의 치료를 위한 용도이다.
청구항 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체, 청구항 제8항 또는 제9항에 따른 약학 조성물 또는 청구항 제10항 또는 제11항에 따른 백신의 면역 시스템의 조절을 위한 용도가 또한 예상된다.
본 발명은 실시예 및 도면에 의해 더욱 상세히 설명되나 이러한 개시된 구현들로 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
도 1 DNA 구조체 30L204의 서열 및 구조
도 2 PBMCs에서 사이토카인 자극
도 2 단핵구에서 CD86 및 CD169의 자극, NK 세포에서 CD69의 자극 및 B 세포에서 CD86 빈도의 자극
본 발명의 개시내용의 의미 내에서, 용어 DNA 구조체는 이에 상응하는 DNA 서열의 길이의 한정을 나타내는 것은 아니다. DNA 구조체의 모노머 단위는 뉴클레오타이드이다.
DNA 구조체는 합성적으로 제조되거나 또는 부분적으로나 완전히 생물학적 기원의 것일 수 있으며, 여기서 생물학적 기원은 유전학에 기초한 DNA 서열의 제조방법을 포함한다.
본 발명의 개시내용에 따른 "스템(stem)"은 동일한 DNA 분자 내에서 염기 쌍 형성함으로써(이는 그 다음 부분적으로 자가 상보적으로 됨) 또는 다른 DNA 분자 내에서 염기 쌍 형성함으로써(이는 부분적으로 또는 완전히 상보적으로 됨) 형성된 DNA 이중 스트랜드로서 이해될 것이다. 분자 내 염기 쌍 형성은 동일한 분자 내에서의 염기 쌍 형성을 가리키며, 다른 DNA 분자들 간의 염기 쌍 형성은 분자 간 염기 쌍 형성이라 한다.
본 발명의 개시내용의 의미 내에서, "루프(loop)"는 스템 구조의 말단 내에 또는 말단에 쌍이 형성되지 않은 단일 스트랜드 부위로서 이해될 것이다. "헤어핀(hairpin)"은 스템과 루프의 독특한 조합이며, 이는 동일한 DNA 분자의 두 자가 상보적 부위가 하이브리드되어 쌍이 형성되지 않은 루프를 갖는 스템을 형성할 경우에 발생된다. 아령형은 스템 부위 측면의 양 말단에 헤어핀을 갖는 선형 DNA 구조체를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 개시내용의 문맥에서 "선형 DNA 구조체(linear DNA construct)"는 단일 및/또는 이중 스트랜드 DNA를 포함하는 선형 개방-사슬 DNA 구조체 또는 이중 스트랜드 DNA 스템의 양 말단에 단일 스트랜드 루프를 포함하는 선형의 아령형 DNA 구조체를 나타낸다.
뉴클레오타이드가 공유결합 또는 비공유결합으로 부착된 "고형 상(solid phase)"은 이에 한정하는 것은 아니나 컬럼, 매트릭스, 비드, 변형 또는 기능화 유리를 포함한 유리, 실리콘 및 변형 실리콘을 포함한 실리카 또는 실리카계 물질, 플라스틱(폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 물질들의 코폴리머, 아크릴릭스, 폴리부틸렌, 폴리우레탄 등을 포함), 나일론 또는 니트로셀룰로즈, 수지, 폴리사카라이드, 탄소뿐만 아니라 무기 유리, 금속, 나노입자, 및 플라스틱을 지칭한다. 따라서, 마이크로타이터 플래이트가 또한 본 발명에 따른 고형 상의 범위 내에 포함된다.
본 발명에 따른 면역조절은 면역자극 및 면역억제를 지칭한다. 면역자극은 우선적으로 증식, 이동, 분화되거나 또는 어느 다른 형태로 활성적으로 되기 위해서 면역 시스템의 작동체 세포가 자극되는 것을 의미한다. 예를 들어, 일반적으로 헬퍼 T-세포로부터 동시 자극 신호가 요구되는 면역자극 DNA 분자에 의해 B 세포 증식이 동시 자극 신호 없이 유도될 수 있다.
다른 한편, 면역억제는 면역 시스템의 활성화 또는 효능을 감소시키는 것으로 이해될 것이다. 면역억제는 예를 들어, 이식된 장기의 거부를 억제하기 위해, 골수 이식 후 이식편대 숙주병(graft-versus-host disease)을 치료하기 위해, 또는 예를 들어, 류마티스성 관절염 또는 크론병과 같은 자가면역 질병의 치료를 위해 일반적으로 의도적으로 유도된다.
이러한 정황에서, 면역조절은 또한 아직 분화나 성숙하고 있는 면역 반응에 영향을 미침으로써, 또는 확립된 면역 반응의 특성을 조절함으로써 면역 반응의 성질이나 특성에 영향을 미치는 것을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "예방접종(vaccination)"은 질병에 대한 면역성을 생성하기 위한 항원 물질(백신)의 투여를 지칭한다. 백신은 바이러스, 균류, 원생 기생충, 박테리아의 병원체뿐만 아니라 알레르기 및 천식 그리고 종양의 병원체에 의한 감염의 영향을 억제하거나 완화할 수 있다. 백신은 전형적으로 면역 반응을 증가시키기 위해 사용되는 예를 들어 면역자극 핵산과 같은 하나 이상의 보조제를 함유한다. 예방접종은 일반적으로 감염 및 다른 질병을 예방하는 가장 효과적이고 비용-효율적인 방법인 것으로 간주된다.
투여되는 물질은 예를 들어, 살아있으나 약화된 형태의 병원체(박테리아 또는 바이러스), 사멸되거나 불활성화된 형태의 이러한 병원체, 단백질, 항원을 암호화하는 핵산과 같은 정제된 물질이나 또는 종양 세포나 수지상 세포와 같은 세포일 수 있다. 특히, DNA 예방접종이 최근에 개발되었다. DNA 예방접종은 항원을 암호화하는 DNA를 인간이나 동물 세포에 삽입함으로써 작동한다. 발현된 단백질을 인지하는 면역 시스템의 일부 세포들은 이러한 단백질들에 대한 그리고 이들을 발현하는 세포들에 대한 공격을 보호할 것이다. DNA 백신의 한 이점은 이것들을 생산 및 보관하기에 매우 용이하다는 것이다. 또한 DNA 백신은 보다 광범위한 범위의 면역 반응 타입들을 유도하는 능력을 포함하여 통상적인 백신에 비해 다수의 이점을 갖는다.
예방접종은 항원에 노출시 예방접종된 건강한 개체에서 항원에 대한 면역성을 형성하는 예방적 접근법으로서 사용될 수 있다. 변형적으로, 치료적 예방접종은 항원에 대해 개체의 면역 시스템을 가이드함으로써 예방접종된 병에 걸린 개체의 향상된 면역 시스템 반응을 일으킬 수 있다. 예방 또는 치료 예방접종 모두가 인간뿐만 아니라 동물에 적용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "유전자 치료(gene therapy)"는 종양이나 자가면역 질병과 같은 질병을 치료하기 위한 개체 세포 및/또는 생물학적 조직의 일시적 또는 영구적인 유전적 변형(예, 유전자의 삽입, 변경 또는 제거)을 지칭한다. 유전자 치료의 가장 보편적인 형태는 돌연변이된 유전자를 대체하기 위해 기능성 유전자를 불특정 게놈 위치 내로 삽입하는 것을 포함하나, 다른 형태는 돌연변이를 직접 정정하거나 바이러스 감염을 가능케 하는 정상 유전자를 변형시키거나, 또는 유전자 또는 유전자 프래그먼트를 이의 전사를 위해 세포 내로 이송하는 것을 포함한다.
"자가(autologous) 유전자 치료"는 그와 동일한 개체의 조직이나 세포를 이용하는 것을 지칭한다. 분리된 세포 또는 조직은 유전자 치료에 의해 변형되고 도너 내로 재도입될 것이다. 이와 상반적으로, "동종 이계(allogenic) 유전자 치료"는 어셉터 개체가 아닌 개체로부터 유전자 치료를 위한 세포를 사용하는 것을 지칭한다. 유전적 변형 후, 동종 이계 세포는 어셉터 내로 도입된다.
용어 "생체 외(ex-vivo) 유전자 치료"는 예를 들어, 조혈모세포 또는 조혈 전구세포와 같은 개체의 세포가 생체 외에서 유전적으로 변형되고, 후속적으로 처리하고자 하는 개체에 도입되는 치료 접근법을 지칭한다. 용어 "생체 내(in-vivo) 유전자 치료"는 예를 들어, 조혈모세포 또는 조혈 전구세포와 같은 개체의 세포가 예를 들어, 바이러스 벡터나 다른 발현 구조체를 이용하여 생채 내에서 유전적으로 변형되는 것을 지칭한다.
또한 유전자 치료는 "생식 계열(germ line) 유전자 치료" 및 "체세포(somatic) 유전자 치료"로 분류될 수 있다. "생식 계열 유전자 치료"의 경우에, 생식 계열 세포, 즉, 정자나 난자가 유전적으로 변형된다. 유전적 변화는 보통 이의 게놈 내로 통합된다. 따라서, 치료에 기인한 변화는 유전될 수 있으며, 이후 세대에 전달될 수 있다. 이러한 접근법은 유전적 질병 및 유전병의 치료에 유용하다. "체세포 유전자 치료"의 경우에, 치료 유전자는 개체의 체세포 내로 이송된다. 어느 변형 및 효과는 그 개체에만 제한될 것이며, 그 개체의 자손이나 이후 세대에 유전되지 않을 것이다.
용어 "암(cancer)"은 치료 또는 예방하고자 하는 암 질병 또는 종양을 포함하며, 이에 한정하는 것은 아니나 포유류 암종, 흑색종, 피부 종양, 림프종, 백혈병, 결장암종, 위암종, 췌장암종, 결장암, 소장암을 포함하는 위장관 종양, 난소암종, 자궁경부암종, 폐암, 전립선암, 신장세포암종 및/또는 간 전이를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 명세서에 따른 자가면역 질병은 류마티스성 관절염, 크론병, 전신성 루프스(SLE), 자가면역 갑상선염, 하시모토씨 갑상선염, 다발성 경화증, 그레이브스병, 중증 근무력증(myasthenia gravis), 셀리악병(celiac disease) 및 에디슨병(Addison's disease)을 포함한다.
본 발명은 SEQ ID NO:1의 부분적으로 하이브리드된 DNA 서열을 두 번 포함하는 DNA 잔기의 부분적으로 단일 스트랜드의 아령형, 공유결합적으로 폐쇄된 사슬로 구성된, 면역조절용 DNA 구조체를 제공한다. SEQ ID NO:1은 CG 모티프를 포함하며, 이는 또한 ODN2006-루프라 칭하여진다. ODN2006-루프의 두 올리고는 부분적으로 하이브리드되고, 아령형 선형 DNA 구조체를 형성한다. SEQ ID NO:1의 서열은 다음과 같다(도 1 참조).
5'-AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT-3'
CG-함유 DNA 구조체의 효과는 이의 TLR9과의 상호작용에 따라 달라진다. 실시예 및 도면에 나타낸 바와 같이, TLR9 아고니스트 부류들 사이의 면역조절 프로필의 차이는 CG-모티프의 컨텍스트에서 각각 이들의 각 뉴클레오타이드 서열보다는 이들의 형태와 더 가까이 관련되는 것으로 보인다.
놀랍게도, 본 발명의 아령형 DNA 구조체의 유도된 자극 패턴은 이에 상응하는 선형 CG 올리고뉴클레오타이드 또는 심지어 EP 1 196 178에 개시된 아령형 DNA 구조체에 의해 유도된 자극 패턴과 상이하다.
유도된 자극 패턴은 심지어 선형 포스포로티오에이트 보호된 DNA oligo ProMune(ODN2006)에 의해 유도된 패턴과 예기치 않게 상이하다. ProMune의 서열은 본 발명에 따른 DNA 구조체의 단일 스트랜드 루프의 일부이며, 이는 CG-모티프 함유 DNA 서열의 컨택스트의 관련성을 보강한다.
본 발명에 따르면, 상기 CG 모티프/들은 구조체의 단일 스트랜드 및/또는 이중 스트랜드 부위 내에 위치한다. EP 1 196 178에 개시된 바와 같이, CG 모티프는 이들이 그 분자의 단일 스트랜드 부위 내에 포함되거나 이중 스트랜드 부위 내에 포함되는 면역 반응을 유발할 수 있다.
본 발명은 카르복실, 아민, 아미드, 알디민, 케탈, 아세탈, 에스테르, 에테르, 디설피드, 티올 및 알데히드기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 작용기를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 화학적 변형을 더 포함한다. 이는 DNA 구조체가 예를 들어, 흡착, 공유결합 또는 이온 결합에 의헤 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 항체, 지질, 미셀, 소포, 합성 분자, 폴리머, 마이크로 프로젝틸, 금속 입자, 나노입자 또는 고형 상을 포함하는 그룹으로부터 선택된 화합물과 결합하는 것을 가능케 한다. 상기 변형은 각 목적에 특이적으로 선택될 수 있다. 이에 따라 그 구조체는 예를 들어, 다른 분자들을 통합된 CG 모티프/들에 반응하는 특이 세포로 실어 나르는데 사용될 수 있다. 또한, 이러한 변형에 의해 상기 구조체를 세포 내로 수송하는데 사용될 수 있는 마이크로 프로젝틸과 상기 구조체를 결합시키는 것이 가능하다. 또한 상기 구조체는 예를 들어, 마이크로타이터 플래이트와 같은 고형 상과 결합될 수 있다.
Th1-편향된 활성화는 NK 세포 및 세포독성 T 세포의 활성화와 관련되며, 이러한 면역 반응은 암 치료에 활용될 수 있다. 비메틸화된 CG 모티프를 함유하는 DNA 구조체는 바람직하게 Th1 활성화를 이끌기 때문에, 본 발명의 구조체는 암 치료에 사용될 수 있다. 암 치료를 위한 TLR9 아고니스트와 관련된 많은 임상 시험이 진행중이다. 이러한 분자들은 단독으로 또는 예를 들어, 방사선 치료, 수술, 화학요법 및 저온요법과 함께 효과적으로 투여되어 왔다(Krieg, J. Clin. Invest. 2007 117: 1184-94). 이들의 강력한 면역조절, 이들의 작은 크기 및 이들의 안정성에 기인하여, 본 발명의 구조체는 이와 관련하여 대단히 유리할 것으로 예상된다. 또한, 이들의 독특한 면역학적 프로필은 이들을 다른, 덜 유리한 TLR9 리간드와 구별되며, 이러한 프로필은 암-특이적 치료에 활용될 수 있다.
다른 한편, TLR9 아고니스트는 또한 조절 T 세포의 발생에 관련되며, 이에 따라 자가면역 질병의 치료에 사용될 수 있다. 투여 경로는 가변적인 것일 수 있는 것으로 보이며, 이는 생체 내에서 CG 모티프를 함유하는 DNA 구조체의 효과를 결정짓는다(Krieg, J. Clin. Invest. 2007 117: 1184-94)
CG-모티프를 함유하는 이러한 DNA 분자의 면역자극 효과는 암 치료에 있어 화학요법과 같은 표준 치료 접근법의 효능을 향상시키는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 구조체를 포함하는 약학 조성물이 또한 제공된다. 또한, 최신 기술의 TLR9 아고니스트와 비교하여 본 발명의 구조체의 유리한 특성은 본 발명의 구조체가 암, 감염 질병, 알레르기 및 천식과 같은 질병의 치료를 위한 유망한 도구가 되도록 한다. 이에 따라 알레르기 및 천식(주로 Th2-매개)의 치료는 Th1 활성화의 존재로부터 이익을 얻는다.
TLR9 아고니스트는 백신 내에서 강력한 보조제인 것으로 나타났기 때문에, 본 발명의 DNA 구조체를 포함하는 백신이 또한 제공된다. 본 발명의 구조체는 부작용을 야기할지도 모르는 상기 DNA를 안정화하기 위한 변형을 도입할 필요없이 TLR9 자극을 위한 관련 서열들을 포함한다. 분자의 보다 긴 수명은 효과적인 자극을 확실히 하여 강한 면역 반응이 예상된다.
본 발명의 DNA 구조체의 효과를 보여주기 위해, 하기 DNA 구조체들이 본 명세서에 기재된 실험에 사용되었다(표 1).
실험에 사용된 서열들
SEQ ID NO : 명칭 서열(5'-3') 변형된 뉴클레오타이드 /서열의 설명
1 30L204 AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT 아령형 DNA 구조체, 두 개의 부분적으로 하이브리드된 서열들로 형성된 루프 내의 ODN2006 PD 서열
2 dSLIM AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGTTCTT 두 개의 부분적으로 하이브리드된 서열들로 형성된 EP 1 196 178의 아령형 DNA 구조체
3 ODN2006-2 TCGTCGTTTT GTCGTTTTGT CGTT 선형 DNA 구조체, 모든 포스포디에스테르 결합(PD)이 포스포로티오에이트(PTO)로 변형됨
4 30L210 AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT 아령형 DNA 구조체, 두 개의 부분적으로 하이브리드된 서열들로 형성된 루프 내의 ODN2006 PTO 서열
도면의 상세한 설명
레퍼런스는 부분적으로 단일 스트랜드의, 아령형 공유결합적으로 폐쇄된 DNA 구조체의 제조에 대해 기재되어 있는 EP 1 196 178 B1로 이루어진다.
도 1은 본 발명에 따른 DNA 구조체의 구조 및 서열을 나타낸다.
도 2는 상기 표 1에 나타낸 DNA 구조체 3μM로 PBMCs를 자극한 결과를 나타낸다.
포스포로티오에이트 변형된 백본을 갖는 DNA 구조체의 사용(ODN2006-2 및 30L210)은 IFF-알파 및 IP-10의 자극을 이끌지 못한다. 놀랍게도, 본 발명의 DNA 구조체(30L204)는 이미 알려진 EP 1 196 178의 아령형 DNA 구조체(dSLIM)와 비교하여 IFN-알파 및 IP-10의 현저히 증가된 사이토카인 자극을 이끈다.
IFN-알파는 다년간 항바이러스 사이토카인으로서 알려져 왔다. 이는 Th1 세포 발달을 자극하여, 이에 따라 CG-함유 DNA 분자의 효과를 촉진한다. IFN-알파는 또한 마우스와 인간에서 항종양 활성을 나타내며, 세포독성 T 세포를 활성화시키고 이에 따라 종양 세포의 세포 용해 가능성을 증가시킴으로써 이식된 종양 세포의 종양 형성을 부분적으로 감소시킬 수 있다. NK 세포 및 마크로파지 활성은 모두 항종양 세포독성에 중요하며, 또한 IFN-알파에 의해 증가된다(Brassard et al., J. Leukoc. Biol. 2002 71: 565-81). 따라서, 본 발명의 DNA 구조체로 자극시 IFN-알파의 양 증가는 암 치료에 유익할 것으로 기대된다.
IP-10은 최근에 생체 내에서 강력한 혈관형성 억제 단백질인 것으로 증명되었다. 따라서, 특히 종양 질병의 치료에 있어 IP-10의 유도 역시 유익한 것으로 사료된다.
IFN-감마의 자극은 또한 dSLIM과 비교하여 본 발명의 DNA 구조체에 의해 증가된다. IFN-감마 자극은 30L210이 역시 이의 분비를 자극함에 따라 서열 의존적인 것으로 여겨지나, 30L210은 포스포로티오에이트 백본을 갖고 있어 심각한 부작용을 야기할 지도 모른다는 것에 유념해야 한다. 따라서, 본 발명의 DNA 구조체는 안전성 측면에서 유익하다.
IL-8은 전염증성 사이토카인이며, 이는 호중구의 활성화 및 호중구의 말초혈액으로부터 조직 내로의 이동을 매개하는 것으로 알려져 있다. 그 결과적으로 형성된 호중구성 침투는 난소암에서 나타난 바와 같이 종양 성장의 억제에 부분적으로 관여할 수 있다(Lee et al., J. Immunol. 2000 164: 2769-75). 더욱이, IL-8은 또한 T 세포 및 호염구에 대해 화학주성을 갖는다. 따라서, 적어도 일부 종양 타입의 치료 또는 예방을 위해, CG-함유 DNA 구조체에 반응하여 IL-8을 선택적으로 상향조절하는 것이 유익하다. 다른 한편, IL-8은 혈관형성을 유발하여 IL-8 분비의 유도가 역효과를 낳을 수 있는 것이 확립되어 왔다. 따라서, 본 발명의 다른 DNA 분자들에 의한 IL-8 유도의 상이한 정도는 분자들을 원하는 치료 효과에 맞추는 것을 가능케 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 DNA 구조체에 의해 유도된 특이적 사이토카인 패턴은 뚜렷한 종양 타입의 치료 및 예방에 유익하다. 분명히, 비메틸화된 CG 모티프가 상기 DNA 구조체의 형태를 포함하는 TLR9에 편입된 특정 컨텍스트는 반응 세포에서 유도된 개별적인 각 자극 패턴을 결정한다.
도 3은 표 1에 열거된 DNA 구조체를 이용한 단핵구의 자극을 나타낸다. 본 발명의 DNA 구조체는 dSLIM 및 포스포로티오에이트 보호된 선형 올리고 ODN2006-2와 비교하여 CD86 및 CD169와 관한 단핵구의 활성화를 향상시킨다. CD69의 최대 활성화는 NK 세포에서 이루어지며, 이는 또한 본 발명의 DNA 구조체로 달성된다.
단핵구 및 NK 세포의 활성화는 선형 ODN2006과 다소 대등하나, 이 올리고는 심각한 부작용을 일으킬 수 있는 포스포로티오에이트 백본을 가지고 있음에 또한 유념해야 한다.
선형 ODN2006-2와 본 발명의 아령형 DNA 구조체 사이에서 B 세포의 활성화는 다소 대등하다. 두 아령형 DNA 구조체 dSLIM 및 30L204를 비교하면, 30L204가 놀랍게도 dSLIM보다 훨씬 더 강력한 활성인자임을 보여준다.
결론적으로, 본 실험은 본 발명의 아령형 DNA 구조체가 예기치 않게도, 이미 알려진 아령형 DNA 구조체 dSLIM 및 선형 올리고데옥시뉴클레오타이드 ODN2006(PROMUNE®)보다 더 우수한 면역세포 활성인자임을 보여준다. 아령형 선형 DNA 구조체의 단일 스트랜드 루프 내로 포스포로티오에이트없이 ODN2006의 DNA 서열을 도입하는 것이 면역조절 포텐셜의 향상을 이끈다는 것은 놀라운 것이었다.
ODN2006(PROMUNE®) 및 dSLIM은 모두 강력한 면역조절제로 알려져 있다. 포스포로티오에이트 ODN2006의 dSLIM의 단일 스트랜드 루프 내로의 도입은 효과적인 면역조절제를 형성하지 못한다(도 1 IFN-알파 및 IP-10 참조). 단일 스트랜드 루프 내에 포스포르디에스테르 결합을 갖는 ODN2006의 서열을 함유하는 본 발명의 DNA 구조체는 ODN2006 및 dSLIM의 효과의 단순 부가를 넘는 효율성을 갖는 새로운 구조체이다. 다라서, 본 발명의 DNA 구조체는 중요한 항암 사이토카인 IFN-알파, 강력한 혈관형성 억제제인 사이토카인 IP-10, 또는 IFN-감마, NK-, NKT- 및 세포독성 T-세포 반응의 중요한 활성인자의 사이토카인 분비를 증가시킴으로써 암 또는 자가면역 질병의 치료에 사용될 수 있는 새로운 TLR-9 아고니스트인 것으로 결론지어져야 한다.
본 발명의 DNA 구조체는 pDCs의 CD80, B 세포의 CD86, 단핵구의 CD86 및 CD169, NK-, NKT- 뿐만 아니라 T 세포의 CD69를 포함하는 PBMC의 관련 세포 부분모집단의 활성화 표면 마커들의 강한 상향조절인자임을 나타내는 것이 또한 가능하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Mologen AG <120> Covalently closed non-coding immunomodulatory DNA construct <130> 80541GB <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 30L204 <400> 1 aggtggtaac ccctaggggt taccaccttc atcgtcgttt tgtcgttttg tcgttctt 58 <210> 2 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dSLIM <400> 2 aggtggtaac ccctaggggt taccaccttc attggaaaac gttcttcggg gcgttctt 58 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN2006 linear PTO <400> 3 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN2006 PTO in Loops <400> 4 aggtggtaac ccctaggggt taccaccttc atcgtcgttt tgtcgttttg tcgttctt 58

Claims (13)

  1. 부분적으로 하이브리드된 SEQ ID NO:1의 DNA 서열을 두 번 포함하며, 부분적으로 단일 스트랜드이고, 아령형이며, 공유결합적으로 폐쇄된 DNA 잔기의 사슬로 구성된, 면역조절용 DNA 구조체.
  2. 제1항에 있어서,
    단일 스트랜드 루프는 3개의 CG-모티프를 포함하는, 면역조절용 DNA 구조체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    각 CG-모티프는 양쪽에 데옥시티미딘이 측면에 있는, 면역조절용 DNA 구조체.
  4. 제1항에 있어서,
    단일 스트랜드 루프는 적어도 50%의 피리미딘 함량을 갖는, 면역조절용 DNA 구조체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 피리미딘은 데옥시티미딘인, 면역조절용 DNA 구조체.
  6. 제1항에 있어서,
    적어도 하나의 뉴클레오타이드는 카르복실, 아민, 아미드, 알디민, 케탈, 아세탈, 에스테르, 에테르, 디설피드, 티올 및 알데히드기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 작용기로 변형된, 면역조절용 DNA 구조체.
  7. 제6항에 있어서,
    변형된 뉴클레오타이드는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 항체, 지질, 미셀(micelles), 소포, 합성 분자, 폴리머, 마이크로 프로젝틸(micro projectile), 금속 입자, 나노입자, 또는 고형상(solid phase)을 포함하는 그룹으로부터 선택된 화합물에 연결된, 면역조절용 DNA 구조체.
  8. 제1항의 DNA 구조체를 포함하며, 암 또는 자가면역 질병의 치료용으로 사용되거나 또는 면역 시스템의 조절용으로 사용되는, 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    화학치료제를 더 포함하는, 약학 조성물.
  10. 제1항에 따른 DNA 구조체를 포함하는 백신으로서, 상기 DNA 구조체는 보조제(adjuvant)로서 포함되는, 백신.
  11. 암 또는 자가면역 질병의 치료용, 또는 면역 시스템의 조절용으로 사용하는, 제1항에 따른 DNA 구조체.
  12. 암 또는 자가면역 질병의 치료용, 또는 면역 시스템의 조절용으로 사용하는, 제10항에 따른 백신.
  13. 삭제
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