ES2582339T3 - Composiciones que comprenden oligómeros de gemcitabina para su uso en terapia - Google Patents

Composiciones que comprenden oligómeros de gemcitabina para su uso en terapia

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ES2582339T3 ES13742177.2T ES13742177T ES2582339T3 ES 2582339 T3 ES2582339 T3 ES 2582339T3 ES 13742177 T ES13742177 T ES 13742177T ES 2582339 T3 ES2582339 T3 ES 2582339T3
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Abstract

Compuesto formado por 2-30 unidades de 2',2'-difluoro-2'-desoxicitidina (dFdC) unidas con enlaces de fosfato 5'- 3' para su uso en terapia.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones que comprenden oligomeros de gemcitabina para su uso en terapia
La presente invencion se refiere a derivados homooligomericos de la gemcitabina (dFdC), un antimetabolito de la citidina, para su uso en terapia.
Antecedentes de la invencion
La 2',2'-difluoro 2'-desoxicitidina (abreviada como dFdC), tambien conocida como gemcitabina, es un analogo sintetico del nucleosido natural desoxicitidina. Despues de su captacion a traves de la membrana celular por los transportadores de nucleosidos, la gemcitabina se convierte intracelularmente en primer lugar en monofosfato de difluorodesoxicitidina (dFdCMP) mediante la enzima cinasa de desoxicitidina, y posteriormente en sus metabolitos activos de difosfato (dFdCDP) y de trifosfato (dFdCTP). Durante la fase S, la dFdCTP es incorporada a la cadena de ADN naciente y esto da lugar a una terminacion prematura de la cadena, despues de la adicion de uno o mas nucleotidos, dado que las enzimas correctoras no son capaces de eliminar la dF-citosina y las polimerasas de ADN no pueden continuar con la smtesis. Adicionalmente la dFdCDP actua como un inhibidor de la enzima reductasa de ribonucleotido (RR). La RR es la unica enzima conocida que cataliza la conversion de ribonucleotidos en desoxiribonucleotidos, y por lo tanto mantiene la reserva de trifosfato de desoxinucleotido (dNTP). Por lo tanto, la inhibicion de la RR da como resultado una reduccion en la reserva de dCTP, lo que favorece la incorporacion de la dFdCDP en el ADN recien sintetizado. La RR humana tiene tres subunidades: un polipeptido mayor (RRMl) y dos menores (RRM2 y p53R2). La forma catalttica de la RR consiste en dos copias de la subunidad mayor y una copia de cada subunidad menor.
Se ha postulado que la dFdCDP se une irreversiblemente al RRMl y provoca su inactivacion (Davidson et al., 2004). Ademas, se ha demostrado que el RRMl esta regulado por aumento en las celulas de cancer de pancreas resistentes a la dFdC cuando se comparan con las celulas parentales. Ademas, se ha demostrado una correlacion significativa entre unos elevados niveles del RRMl y una baja supervivencia de los pacientes con cancer de pancreas tratados con gemcitabina (Nakahira et al, 2007).
La inactivacion de la dFdC tambien puede ser debida a la enzima desaminasa de citidina, que la convierte en 2,2'- difluorodesoxiuridina (dFdU). Ademas, la enzima 5'-nucleotidasa cataliza la conversion de nucleotidos en nucleotidos, contrarrestando asf la accion de las cinasas de nucleosido.
Despues de una administracion intravenosa, la dFdC tiene una semivida corta en el plasma humano, de aproximadamente 8-17 minutos (Abbmzzese et al, 1991; Reid et al, J 2004), debido probablemente a su rapida degradacion por la desaminasa en la sangre. En los tejidos, su semivida parece ser mas larga. Se ha demostrado que, en ratones, la dFdC radiomarcada permanece hasta 3 horas en los tejidos normales y en tejido de sarcoma implantado subcutaneamente, aunque el mdice de conversion en dFdU no se midio en estos estudios (Moog et al, 2002; Shipley et al, 1992). Es excretada en la orina principalmente en forma de su metabolito primario, la dFdU, y unicamente menos del 10 % se excreta sin procesar (Noble S, Goa KL, 1997; Moog et al, 2002). Por lo tanto, solo una pequena cantidad de dFdC puede alcanzar las celulas tumorales y puede ser convertida en su dFdCDP activa y en derivados de la dFdCTP. Esta podna ser la razon por la cual, aunque la gemcitabina muestra una fuerte actividad citotoxica in vitro comparable a la de otros farmacos antineoplasicos, tales como la doxorrubicina, para el tratamiento de pacientes oncologicos, tiene que ser administrada a la elevada dosis de 1.000 mg/m2 de superficie corporal. Dicha dosis elevada aumenta el riesgo de efectos secundarios dependientes de la dosis, lo mas notablemente una mielosupresion y toxicidad hepatica. Por lo tanto, la rapida degradacion de la dFdC en el suero, el hugado y el tejido tumoral por parte de la enzima desaminasa de citidina, que elimina el grupo amino en la posicion 4 de la base, representa un importante obstaculo para la eficacia de la dFdC. Ademas, otra razon para la necesidad de administrar unas dosis elevadas es que unicamente una fraccion de la dFdC administrada es activada mediante una fosforilacion.
Actualmente, la dFdC es el farmaco quimioterapeutico estandar usado en la terapia del cancer de pancreas. Sin embargo, la tasa de supervivencia en cinco anos de este cancer sigue siendo menor del 5 % debido a recafdas y a la resistencia a la dFdC. Por lo tanto, son urgentemente necesarias unas mejoras en la quimioterapia basada en dFdC.
Hasta la fecha han fracasado los intentos de superar los problemas mencionados anteriormente. Recientemente, Sampath et al (2010) han descrito un metodo basado en compuestos heteropolimericos que comprenden cadenas largas de analogos de nucleosidos o de un nucleosido, e incluyendo la dFdC, unidas por un grupo fosfodiester. Los inconvenientes del metodo de Sampath son dobles. En primer lugar, la eficacia de las moleculas del profarmaco heteropolimerico no se ha demostrado, siendo el principal problema que los compuestos activos (los analogos de nucleosidos o de un nucleosido) estan unidos por fracciones resistentes a la nucleasa, de acuerdo con el metodo descrito por Sampath. El segundo lugar, actualmente no hay metodos eficaces para proporcionar dichas largas moleculas polimericas a las celulas in vivo. Sampath et al no informan de que este metodo no funciona ni in vitro ni in vivo. En un informe anterior, Gmeiner et al describfan homooligonucleotidos que consisten en monomeros de 5'-
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monofosfato de 5-fluoruridina (5-FUMP) o de 5'-monofosfato de 5-fluodesoxiuridina (5-FdUMP) unidos covalentemente a traves de enlaces fosfodiester. Los problemas de este metodo son la rapida degradacion de los poUmeros, que puede ser debida a la inherente inestabilidad de los compuestos usados, y la toxicidad in vivo. Liu et al describen ensayos de la eficacia del tratamiento antineoplasico del 5-Fluorouracilo (5-FU). En particular, se presentan datos que indican que el 10mer FdUMP[lO] es mas toxico que el 5-FU frente a las celulas de tumor colorrectal humano (H63O), y tambien tiene una toxicidad reducida in vivo administrado a ratones balb-C en comparacion con el 5-FU (liu et al., 1999). El documento US 5.614.505 describe la smtesis de 5-Fluorouritdina y de 5-Fluorodesoxiuridina homooligomericas y los usos de las mismas como un sistema de administracion de farmacos polimericos para la produccion de FdUMP.
Adicionalmente se han intentado diversas estrategias para superar la rapida degradacion de la dFdC y mejorar su estabilidad, su biodisponibilidad y su actividad antitumoral. Se han usado liposomas para proteger a la gemcitabina frente a la degradacion. La encapsulacion de la dFdC en liposomas puede conseguirse facilmente, ya que es una molecula pequena que puede difundir a traves de la capa liposomal (l5). De hecho, la dFdC ha sido encapsulada en un gel de fosfolfpido vesicular, que mostro un aumento en la concentracion plasmatica en comparacion con la dFdC libre (Moog et al, 2002; Bommann et al, 2008). Sin embargo, a un pH fisiologico, la dFdC no tiene carga y difunde a traves de la membrana liposomal. Ademas, parece que la dFdC induce la degradacion de los fosfolfpidos de la bicapa liposomal (Moog et al, 2000). Por lo tanto, la dFdC liposomal mostro un aumento en la toxicidad, debido probablemente a la liberacion incontrolada del farmaco desde los liposomas.
El problema tecnico subyacente en la presente solicitud podna ser contemplado en el sentido mas amplio como enfrentarse a los inconvenientes de la tecnica anterior. Espedficamente, el problema tecnico podna contemplarse como la superacion de la baja eficacia y la resistencia de los sujetos mairnferos a la terapia con dFdC.
La presente invencion resuelve el problema de la baja eficacia y de la resistencia a la terapia con dFdC proporcionando compuestos y formulaciones que aumentan la eficacia de la dFdC en el tratamiento de pacientes en necesidad de la misma con nuevos compuestos y formulaciones de dFdC homooligomerica, que se divulgan en esta invencion.
Breve sumario de la invencion
Aunque la dFdC tiene una fuerte actividad citotoxica in vitro, debe ser administrada a los pacientes oncologicos a unas elevadas dosis (superiores a 1.000 mg/m2 por dosis), un hecho que aumenta el riesgo de efectos secundarios. Ademas, dichas dosis parecen favorecer la seleccion de clones muy resistentes en el tejido tumoral, que son muy diffciles, y a menudo imposibles de eliminar, dado que la dosis de la dFdC ya no puede aumentarse mas.
Esta invencion se refiere a un compuesto formado por 2-30 unidades de dFdC unidas con enlaces de fosfato 5'-3' para su uso en terapia. La invencion tambien se refiere a una composicion que comprende dicho compuesto para su uso en terapia.
Estos compuestos y composiciones ayudan a superar esos problemas mediante la combinacion (es decir, la elaboracion) de moleculas de dFdC en forma oligomerica. Dichas formas oligomericas son preferiblemente homomericas. El termino “oligomero”, cuando se usa en el presente documento, incluye 2-mers, 3-mers, 4-mers, 5- mers, 6-mers, 7-mers, 8-mers, 9-mers, 10-mers, 15-mers, 20-mers, 25-mers o 30-mers de la dFdC. Un 3-mer particularmente preferido es un trinucleotido FpFpFp. Dichas composiciones que comprenden los compuestos de la presente invencion tienen unos efectos citotoxicos superiores, in vitro e in vivo, a unas dosis menores que la dFdC y son eficaces frente a las celulas tumorales resistentes a este farmaco. Por lo tanto, representan un nuevo agente antineoplasico y antivmco.
La presente invencion proporciona compuestos y composiciones utiles para el tratamiento del cancer, que incluyen los siguientes tipos de neoplasias: neoplasia del pancreas exocrino, del esofago, del estomago, de la vesfcula biliar, del tngado, del intestino delgado, del apendice vermiforme, del ano, del peritoneo, adenocarcinoma de colon y de recto; neoplasia de cuello de utero (desde una neoplasia intraepitelial cervical hasta un cancer cervical invasivo), adenocarcinoma endometrial, cancer de ovario, neoplasia de la vulva y de la vagina, sarcomas ginecologicos; neoplasias de la mama; leucemias mieloides agudas y cronicas, leucemias linfodticas agudas y cronicas, tricoleucemia, leucemia de mastocitos, smdromes mielodisplasicos, leucemia/linfoma por HTLV-1 y de los linfocitos T, enfermedad de Hodgkin, linfomas no Hodgkin; carcinoma de las celulas renales, neoplasia de la pelvis renal, de ureter, de vejiga, de uretra, de prostata, de testfculo, de pene; neoplasias de la pituitaria, de tiroides, de la corteza adrenal, del sistema neuroendocrino y endocrino enteropancreatico; neoplasias neuronales, meduloblastoma, schwannoma, meningioma, sarcoma meningeal, glioblastoma multiforme, astrocitoma, pineal, oligodendroglial, ependimal y neoplasias del plexo coroideo; carcinoma de celulas basales, carcinoma epidermoide, melanoma, dermatofibrosarcoma, tumor de las celulas de Merkel, rabdomiosarcoma, retinoblastoma; cancer de cabeza y cuello, tumores odontogenicos, neoplasias de la cavidad oral, de la faringe, de la laringe; carcinoma pulmonar macrodtico, carcinoma pulmonar microdtico, carcinoma pulmonar no microdtico, neoplasias del torax, mesotelioma maligno, timomas; sarcoma osteogenico, histiocitoma fibroso maligno, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, tumor neuroectodermico primitivo, angiosarcoma y sarcoma de Kaposi.
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Se prefieren los siguientes trastornos para el tratamiento con las composiciones de esta invencion: cancer de pancreas, cancer hepatocelular, cancer de pulmon, lesiones cervicales precancerosas y cancerosas, cancer de mama, cancer de ovario, cancer colorrectal y linfoma, tal como el linfoma no Hodgkin. Las composiciones de la presente invencion son especialmente utiles para el tratamiento del cancer de pancreas.
La presente invencion se refiere a compuestos que comprenden 2-30 unidades de dFdC unidas por puentes de fosfato 5'-3' para su uso en terapia, en particular en el tratamiento de enfermedades infecciosas o de neoplasias.
La presente invencion tambien se refiere a compuestos que comprenden 2-30 unidades de dFdC unidas por puentes de fosfato 5'-3', en particular a homooligomeros de dFdC, y otro agente antineoplasico para su uso en terapia, en particular en el tratamiento de enfermedades infecciosas o de neoplasias que comprende una administracion por separado o simultanea.
En una realizacion adicional, la presente invencion se refiere a compuestos que comprenden 2-30 unidades de dFdC unidas por puentes de fosfato 5'-3', en particular a homooligomeros de dFdC, conjugados con un peptido de direccionamiento, un aptamero o un anticuerpo terapeutico para uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa o de una neoplasia.
En otra realizacion mas de los compuestos para su uso de acuerdo con la presente invencion, el uso comprende la administracion por separado o simultanea de los compuestos de acuerdo con la presente invencion, en particular de homooligomeros de dFdC, conjugados con uno o mas peptidos de direccionamiento o anticuerpos terapeuticos y un agente antineoplasico.
En otra realizacion, la presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden los compuestos que comprenden 2-30 unidades de dFdC unidas por puentes de fosfato 5'-3', en particular a homooligomeros de dFdC, con o sin peptidos de direccionamiento, aminoacidos o una encapsulacion liposomal, y anticuerpos terapeuticos para su uso en terapia, para una administracion simultanea o secuencial. Los homooligomeros de dFdC de acuerdo con la invencion tambien pueden estar encapsulados en un liposoma.
Las composiciones de la presente invencion comprenden los compuestos segun se describe en el presente documento. Estos compuestos estan formados por 2-30 unidades de dFdC unidas por puentes de fosfato 5'-3' para su uso en terapia. Preferiblemente, estos compuestos estan formados por 2-10 unidades de dFdC unidas por puentes de fosfato 5'-3' para su uso en terapia. Mas preferiblemente, el compuesto es FpFpF.
Descripcion detallada de la invencion
El objetivo preferido de esta invencion es proporcionar composiciones, compuestos y composiciones farmaceuticas que contienen el trinucleotido FpFpF (denominado tambien en el presente documento trinucleotido de dFdC) como principio activo principal, asf como especificar unas dosis terapeuticamente eficaces que resulten tan eficaces o mas que la dFdC en terapia.
Compuestos activos:
En una realizacion se proporciona un compuesto de la Formula estructural (I):
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o una sal, un hidrato, un N-oxido o un solvato del mismo farmaceuticamente aceptable, en el que:
Ri es hidrogeno, un lfpido, un aminoacido, un peptido, un anticuerpo o un aptamero R2 es hidrogeno, un lfpido, un aminoacido, un peptido, un anticuerpo o un aptamero n = 1-30
TpF: timidinil 3'-5' fosfato 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina
FpF: 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidinil 3'-5' fosfato 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina (C18H21O10N6F4P)
FpFpF: 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidinil 3'-5'fosfato 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidinil 3'-5'fosfato-2'-desoxi-2',2'-
difluorocitidina (C27H3O16N9F6P2; pangemine™)
5'-FpFpF-3'-palmitoilo: 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidinil 3'-5' fosfato 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidinil 3'-5' fosfato-2'-desoxi-
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2',2'-difluorocitidinil 3'-5' fosfato-1-a(6-(palmitoilamino)hexil)-2-desoxi-D-ribosa
Por lo tanto, aparte del trinucleotido FpFpF preferido, la presente invencion tambien proporciona composiciones, compuestos y composiciones farmaceuticas que contienen oligomeros de dFdC como se ha descrito y definido en el presente documento, como principio activo principal, asf como espedfica dosis terapeuticamente eficaces que son tan eficaces o mas que la dFdC en terapia.
Composiciones farmaceuticas
Los compuestos de esta invencion pueden aplicarse terapeuticamente en una composicion farmaceutica aceptable. Pueden usarse junto con los vetnculos acuosos y no acuosos habituales conocidos por los expertos en la materia, incluyendo agua esteril, solucion salina, las sales obtenidas mediante la adicion de acidos inorganicos u organicos tales como acido clortndrico y acido lactico, y mediante la adicion de bases inorganicas u organicas como hidroxido de sodio y etanolamina sustituida, soluciones tamponadas a pH fisiologico, dextrosa de Ringer, regeneradores de electrolitos, espesantes, portadores, tensioactivos, disolventes no acuosos tales como polietilenglicol, oleato de etilo, soluciones alcoholicas, conservantes y otros aditivos tales como agentes quelantes, antioxidantes y antimicrobianos.
Dosis
La dosis debena decidirse de acuerdo con la enfermedad que se va a tratar y los antecedentes clmicos del paciente. Por lo tanto, normalmente la dosis variara con la edad, el genero y el estado clmico del paciente, y debena ser ajustada por el medico experto. La dosis recomendada estara en el intervalo de entre 0,01 mg/Kg y 100 mg/Kg, preferiblemente en el intervalo de 500-1.000 mg/m2, en una o mas administraciones en periodos de uno o mas dfas, preferiblemente mediante el uso de una tasa de dosis fija mediante una infusion intravenosa. Sin embargo, puede ser necesario ajustar las dosis usadas de acuerdo con los parametros toxicologicos y farmacocineticos de cada paciente y compuesto en particular, y de si el compuesto se administra solo o junto con otros farmacos o de si se usa un sistema de administracion de farmacos.
Sujetos
Los compuestos y las composiciones de la presente invencion se aplican para el tratamiento o la mejora de las enfermedades segun se describe en el presente documento en mairnferos, preferiblemente en seres humanos.
Usos
Los compuestos y las composiciones para su uso en terapia segun se describe en el presente documento, pueden usarse para el tratamiento de enfermedades de mamfferos, preferiblemente de seres humanos. De acuerdo con una realizacion de los compuestos y las composiciones para el uso, el uso comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion o de un compuesto de la presente invencion a un mamffero, preferiblemente un ser humano en necesidad de los mismos.
Figuras
Figura 1. Inhibicion de la proliferacion de celulas humanas cancerosas tratadas con dFdC o con homooligomeros y heterooligomeros que contienen dFdC. Las celulas HeLa que crecen en placas de 96 pocillos (5.000 celulas/pocillo) se trataron con: 1) TpF; 2) FpF; 3) TpFpF; 4) FpFpF; 5) dFdC. La concentracion del farmaco en el medio de cultivo era de 20 mM. La proliferacion celular se midio 5 dfas despues de iniciar el tratamiento mediante el uso del ensayo del WST-1. El valor medio obtenido con las celulas no tratadas se establecio en 1.
Figura 2. Proliferacion de celulas MIA PaCa-2 no tratadas (0) o tratadas con dFdC o con el trinucleotido FpFpF a las concentraciones indicadas.
Figura 3. Proliferacion de celulas ASPC no tratadas (0) o tratadas con dFdC o con el trinucleotido FpFpF a las concentraciones indicadas.
Figura 4. Proliferacion de celulas BXPC-3 no tratadas (0) o tratadas con dFdC o con el trinucleotido FpFpF a las concentraciones indicadas.
Figura 5. Proliferacion de celulas HeLa no tratadas (0) o tratadas con dFdC o con el trinucleotido FpFpF a las concentraciones indicadas.
Figura 6. Proliferacion de celulas CaSki no tratadas (0) o tratadas con dFdC o con el trinucleotido FpFpF a las concentraciones indicadas.
Figura 7. Proliferacion de celulas C33A no tratadas (0) o tratadas con dFdC o el trinucleotido FpFpF a las concentraciones indicadas.
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Figura 8. Proliferacion de celulas Huh-7 no tratadas (0) o tratadas con dFdC o con el trinucleotido FpFpF a las concentraciones indicadas.
Figura 9. Proliferacion relativa de celulas MIA PaCa-2 tratadas con dFdC o con el trinucleotido FpFpF, que fueron preincubadas con suero humano en los periodos de tiempo indicados. Los valores de los porcentajes son relativos a las celulas no tratadas.
Figura 10. Inhibicion de la proliferacion de celulas MIA PaCa-2 tratadas con dFdC y con el trinucleotido FpFpF, que fueron preincubadas con suero humano en los periodos de tiempo indicados. Los valores de los porcentajes son relativos a las celulas no tratadas.
Figura 11. Proliferacion relativa de celulas HeLa tratadas con dFdC o con el trinucleotido FpFpF, que fueron preincubadas con suero humano en los periodos de tiempo indicados. Los valores de los porcentajes son relativos a las celulas no tratadas.
Figura 12. Inhibicion de la proliferacion de celulas HeLa tratadas con dFdC o con el trinucleotido FpFpF, que fueron preincubadas con suero humano en los periodos de tiempo indicados. Los valores de los porcentajes son relativos a las celulas no tratadas.
Figura 13. Proliferacion de celulas HeLa naturales despues del tratamiento con dFdC o con el trinucleotido FpFpF a las concentraciones indicadas.
Figura 14. Proliferacion de celulas HeLa resistentes a la dFdC despues del tratamiento con dFdC o con el trinucleotido FpFpF a las concentraciones indicadas.
Figura 15. Inhibicion de la proliferacion de celulas Bxpc-3 (A) y MIA PaCa-2 (B) tratadas con P-dFdC o con P- FpFpF, ambos conjugados con un peptido de union tumoral HBP-1, a las concentraciones indicadas. Los valores de la proliferacion se refieren a las celulas no tratadas.
Figura 16. Inhibicion de la proliferacion de celulas Panc-1 tratadas con dFdC (A), con FpFpF (B) o con FpFpF-Pal (C) a las concentraciones indicadas. Valores de proliferacion de las celulas no tratadas.
Ejemplos
La presente invencion se describe con mas detalle mediante los siguientes ejemplos, los ejemplos de referencia y los ejemplos de ensayo.
Ejemplo 1: smtesis de los reactivos necesarios para la preparacion de los oligonucleotidos.
Metodos y resultados: la smtesis de los diversos compuestos necesarios para la produccion de los oligonucleotidos ensayados en esta invencion se llevo a cabo como sigue:
W4-benzoil-2'-desoxi-2',2'-difIuorocitidina (2). A una suspension de 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina (Gemcitabina, F) (1, C16H15F2N2O5, Carbosynth Limited) (1,5 g, 6,35 mmol) coevaporada en piridina anhidra y disuelta en dimetilformamida, se anadieron 3,3 ml (15,8 mmol) de hexametildisilazano. Despues de agitar durante 1 hora a la temperatura ambiente, la solucion se concentro y el residuo se seco sobre tolueno. (Rf: 0,6 20 % de MeOH/DCM). El residuo se disolvio en piridina anhidra y se anadieron 1,1 ml de cloruro de benzoflo (9,52 mmol). Despues de 30 minutos de agitacion magnetica, la solucion se concentro a sequedad y despues se disolvio en tolueno y se coevaporo. El residuo se disolvio en DCM y se lavo con bicarbonato de sodio 1 M y se seco sobre MgSO4 anhidro y se concentro a sequedad (Rf. 0,93 7 % de MeOH). La eliminacion del grupo protector de trimetisililo se llevo a cabo mediante el tratamiento del residuo con una mezcla que contiene 10 ml de dioxano, 10 ml de metanol y 5 ml de NH3 (32 %) durante 15 min a la temperatura ambiente. La solucion se concentro, se disolvio en diclorometano (DCM) y se lavo con un 5 % de NaHCO3 y una solucion saturada de NaCl. Despues la fase organica se concentro a sequedad y el residuo se purifico mediante una cromatograffa en columna en gel de sflice mediante el uso de un gradiente desde el 1 % hasta el 4 % de metanol (MeOH) en DCM. Despues de la concentracion de las fracciones portadoras del compuesto deseado, se obtuvieron 1,34 g de la N4-benzoil-2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina (2). Rendimiento del 62 %. C16H15F2N3O5. RMN 1H (300 MHz, CDCh) 6 3,3 (m, 2H, H-5'), 3,8 (dd, 1H, H-4'), 3,9 (m, 2H, H-5'), 4,3 (m, 1H, H-3'), 6,6 (t, 1H, H-1'), 7,6-7,5 (m, 5H, arom-H), 7,9 (m, 1H, H-5), 8,4 (d, 1H, H-6). EM, masa esperada M = 367,1; encontrada 368,1 (M + H)+.
5'-0-(4,4'-dimetoxitritM)-W4-benzoil-2'-desoxi-2',2'-difluorocitidma (3). A una solucion de 2 (1 g, 2,93 mmol) en piridina anhidra se anadieron 24,4 g (0,2 mmol) de 4-dimetilaminopiridina y 1,09 g (3,2 mmol) de cloruro de 4,4'- dimetoxitritilo. Despues de agitar durante una noche a la temperatura ambiente, la reaccion se detuvo mediante la adicion de 1 ml de MeOH y la solucion resultante se concentro. Despues el residuo se disolvio en DCM y la capa organica se lavo con una solucion acuosa el 5 % de NaCO3 y una solucion saturada de NaCl y se seco sobre MgSO4 anhidro. La purificacion se llevo a cabo mediante una cromatograffa en columna en gel de sflice eluyendo con DCM
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al 2 % de MeOH/DCM, obteniendo 0,94 g de 3. Rendimiento del 86 %. RMN 1H (300 MHz, CDCI3) 6 3,5 (m, 2H, H- 5'), 3,8 (s, 3H, OCH3), 4,1 (dd, 1H, H-4'), 4,5 (m, 1H, H-3'), 6,5 (m, 1H, H-1'), 6,8-7,8 (m, 18H, arom-H), 8,2 (d, 1H, H- 5), 8,6 (m, 1H, H-6). EM esperado para C37H33F2N3O7: 669,23. Encontrado: 670,23 (M + H)+.
5-O-(4,4'-dimetoxitritM)-3'-O-(2-cianoetM-W,W-dMsopropNfosforamidito)-N4-benzoN-2'-desoxi-2',2'- difluorocitidina (4). A una solucion de 3 (0,5 g, 0,8 mmol) en DCM anhidro se anadieron 0,418 ml (2,4 mmol) de diisopropietilamina junto con 0,269 ml (1,2 mmol) de 2-cianoetil-W,W'-diisopropilclorofosforamidito (1,2 mmol, 268 jl) a 0 °C en una atmosfera de argon. Despues de 15 min se dejo que la reaccion alcanzara la temperatura ambiente y se agito durante 1 h. La reaccion se inactivo con lavados de NaHCO3 al 5 % y NaCl saturado, y la fase organica se seco sobre MgSO4 anhidro y se concentro. El residuo se purifico mediante una cromatograffa en columna en gel de sflice (hexanos/EtOAc 1:1 + 2 % de Et3N) para dar 0,67 g. Rendimiento: 57 % de 4 en forma de una mezcla de diastereoisomeros. RMN 1H (300 MHz, CDChs) 6 1,0-1,3 (m, 12H, 4 CH3), 2,3 (t, 2H, CH2CN), 2,6 (t, 2H, CH2O), 3,5 (m, 2H, H-5'), 3,6 (m, 1H, CH isp), 3,8 (s, 3H, OCH3), 4,1 (dd, 1H, H-4'), 4,6 (m, 1H, H-3'), 6,5 (m, 1H, H-1'), 6,8-7,8 (m, 18H, arom-H), 8,2 (d, 1H, H-5), 8,63 (m, 1H, H-6), 8,8 (s, 1H, NH). EM esperado para C46H30F2N5O8P: 869,34. Encontrado: 870,3 (M + H)+.
Funcionalizacion del soporte solido (CPG).
En primer lugar, se convierte el compuesto 3 en el derivado de hemisuccinato que esta cargado en el vidrio de poro de control de amino. El compuesto 3 (20 mg, 0,031 mmol) se disolvio en DCM y se trato con N,N- dimetilaminopiridina (DMAP, 5,75 mg, 0,047 mmol) y anhndrido sucdnico (4,71 mg, 0,047 mmol). La solucion se agito a la temperatura ambiente durante una noche. A continuacion, la fase organica se lavo con NaH2PO4 0,1 M y se seco sobre MgSO4 anhidro y se evaporo a vado para dar el compuesto 5 que se uso sin purificacion adicional.
Se mezclo 2,2'-ditio-bis-(5-nitropiridina) (0,03 mmol, 9,3 mg) disuelta en acetonitrilo/dicloroetano (1:1) con una solucion del derivado de succinato 5 (20 mg, 0,031 mmol) y DMAP (0,03 mmol, 3,66 mg) disuelto en 500 jl de acetonitrilo. A la solucion clara obtenida se anadieron 7,8 mg (0,03 mmol) de trifenilfosfina disuelta en 0,1 ml de acetonitrilo. La mezcla se agito vorticialmente y se anadio a un vial que contema resina LCA CPG (CPG, Inc.) (200 mg, 71 jmol/g). El soporte solido se recogio mediante filtracion y se lavo con CH2CI2, CH3CN, y posteriormente se seco a vado. Despues, el soporte solido se suspendio en 1 ml de anhndrido acetico/piridina/tetrahidrofurano (1:1:8) y 1 ml de una solucion (10 % de W-metilimidazol en tetrahidrofurano) durante 30 minutos. El soporte solido resultante (6) se recogio mediante filtracion y se lavo con MeOH y Et2O, y se seco a vado. La cantidad de carga se calculo mediante un ensayo de cation tritilo con un 70 % de HClO4-EtoH para dar 38,4 jmol/g.
Ejemplo 2: smtesis de hetero y homooligomeros de nucleotidos que contienen dFdC.
Metodos y resultados: los oligonucleotidos se sintetizaron mediante el uso de la metodologfa del fosforamidito en fase solida. Las smtesis se llevaron a cabo a una escala de 1 jmol en un sintetizador Applied Biosystems 3400 mediante el uso de 5'-O-DMT-3'-O-(2-cianoetil-W,W'-diisopropilfosforamidito-2'-desoxiimidina y del fosforamidito 4. Como soporte solido se uso el vidrio de poro controlado y (CpG) funcionalizado con 5'-O-DMT-W4-benzoil-2'-desoxi- 2',2'-difluorocitidina preparado anteriormente. Se usaron los siguientes soluciones: 1H-tetrazol 0,4 M en ACN (activacion); acido tricloroacetico al 3 % en DCM (destritilacion), anhndrido acetico/piridina/tetrahidrofurano (1:1:8) (proteccion A), W-metilimidazol al 10% en tetrahidrofurano (proteccion B), yodo 0,01 M en
tetrahidrofurano/piridina/agua (7:2:1) (oxidacion de fosfato a fosfato). El tiempo de acoplamiento fue de 15 min para el fosforamidito 4. Todos los oligonucleotidos se sintetizaron en modo DMT-ON. Despues de la smtesis en fase solida, el soporte solido se transfirio a un vial de vidrio con tapon de rosca y se incubo a 55 °C durante 1 h con 1,5 ml de una solucion de NH3 (33 %). Despues el vial se enfrio en hielo y el sobrenadante se transfirio a un tubo eppendorf de 2 ml y se evaporo a sequedad mediante el uso de una centnfuga de evaporacion. El residuo que se obtuvo se desalinizo en una columna NAP-5 mediante el uso de agua como eluyente y se evaporo a sequedad. El oligonucleotido se purifico mediante una HPLC (DMT-ON). Columna: Nucleosil 120-10 C18 (de 250 x 4 mm); 20 min de un gradiente lineal del 15 % al 80 % de B y 5 min de un 80 % de B, caudal 3 ml/min; la solucion A era un 5 % de ACN en trietilacetato de amonio acuoso 0,1 M (TEAA) y B un 70 % de ACN en TEAA acuoso 0,1 M. Las fracciones puras se combinaron y se evaporaron a sequedad. El residuo que se obtuvo se trato con 1 ml de una solucion de AcOH al 80 % y se incubo a la temperatura ambiente durante 30 min. El oligonucleotido desprotegido se desalinizo en una columna NAP-10 mediante el uso de agua como eluyente. Los oligonucleotidos AU se cuantificaron mediante una absorcion a 260 nm y se confirmaron mediante una espectrometna de masas MALDI. Los espectros de MALDI- TOF se realizaron mediante el uso de un espectrometro de masas Perseptive Voyager DETMRP, equipado con un laser de nitrogeno a 337 nm mediante el uso de un pulso de 3 ns. La matriz usada contema 2,4,6- trihidroxiacetofenona (THAP, 10 mg/ml en ACN/agua 1:1) y citrato de amonio (50 mg/ml en agua) o acido a-ciano-4- hidroxicinamico (ACH 10 mg/ml en ACN/agua 1:1). Dinucleotido TpF: EM esperado para C19H23F2N5O11P: 566. Encontrado: 566 (M). Dinucleotido FpF: EM esperado para C18H29F4N6O10P: 587. Encontrado: 587 (M). Trinucleotido FpFpF: EM esperado para C27H30F6N9O16P2: 913. Encontrado: 913 (M).
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Ejemplo 3: smtesis del derivado de palmitoMo del trinucleotido.
El derivado de palmitoMo del trinucleotido se sintetizo mediante el uso de la metodologfa del fosforamidito en fase solida como se ha descrito anteriormente. Las smtesis se llevaron a cabo a una escala de 1 jmol en un sintetizador Applied Biosystems 3400 mediante el uso del fosforamidito 4 y la CPG disponible comercialmente funcionalizada con palmtoilamino hexil 2-desoxirribosa (5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-1-a-(6-(palmitoilamino)hexil)-2-desoxi-D-ribosa en un vidrio de poro controlado de 3'-O-succinilo, Link Technologies) como soporte solido. Despues de la smtesis en fase solida, el soporte solido se transfirio a un vial de vidrio con tapon de rosca y se incubo a la temperatura ambiente durante 4 h con 1,5 ml de una solucion de NH3 (33 %)/dioxano (1:1). Despues de la filtracion del soporte solido, el sobrenadante se evaporo a sequedad. El residuo se purifico como se ha descrito anteriormente. Palmitoil- trinucleotido (5'-FpFpF-3'-palmitoil): EM esperado: 1.444. Encontrado: 1.444 (M).
Ejemplo 4: actividad citotoxica de los hetero y homooligomeros de la dFdC
Objetivo: cuantificar la actividad citotoxica de los hetero y homooligomeros de la dFdC en lmeas celulares cancerosas en comparacion con la dFdC.
Metodos: se incubaron lmeas celulares cancerosas cervicales (HeLa, SiHa, CaSki y C-33) a 37 °C/5 % de CO2 en medio que contiene DMEM con Glutamax™, piruvato de sodio 1 mM, penicilina/estreptomicina (PS) y un 10 % de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen/LifeTechnologies). Las lmeas celulares de cancer de pancreas se mantuvieron en RPMI 1640 complementado con Glutamax™, PS y un 10% de FBS. Para el ensayo de citotoxicidad, se colocaron en placas de 96 pocillos 1 x 104 celulas/pocillo. El volumen final del medio de cultivo en cada pocillo era de 100 |jl. Las celulas se trataron con diferentes concentraciones del farmaco, segun se indica. Las celulas del control sin tratar se establecieron en paralelo. Las celulas se incubaron durante 72 horas, tras lo cual se llevo a cabo el ensayo WST-1 (Roche). Este ensayo utiliza la sal de tetrazolio WST-1 [2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(disulfofenil)- 2H-tetrazolio], que es escindido a un formazan soluble en un proceso que se produce principalmente en la superficie celular. Debido a que la reduccion del WST-1 depende en su mayor parte de la produccion glucolttica de nAd(P)H en las celulas viables, la cantidad de pigmento de formazan formado se correlaciona directamente con el numero de celulas metabolicamente activas en el cultivo. Las celulas se incubaron con WST-1 durante 1 hora a 37 °C/5 % de CO2, despues se cuantifico la cantidad de pigmento de formazan producido mediante el uso de un espectrofotometro de barrido (lector de placas ELKA). La absorbancia se midio a una longitud de onda de ensayo de 450 nm y a longitud de onda de referencia de 630 nm. Despues se resto la absorbancia de fondo a 630 nm de la medicion a 450 nm. Tambien se resto el valor medio de una serie de pocillos vacrns, que contienen medio pero no celulas.
Resultados: 1) el analisis de los efectos citotoxicos de una serie de diferentes hetero y homooligomeros de la dFdC que se ensayaron en la lmea celular tumoral HeLa se ilustra en la Figura 1. El tri-homooligomero de dFdC (trinucleotido de FpFpF) mostro una tasa significativamente mayor de inhibicion de la proliferacion celular (-77 %) en comparacion con la dFdC (-63 %) (p < 0,05) y el di-homooligomero de FpF (-56 % de inhibicion) (p < 0,03). Ademas de la inhibicion de la proliferacion celular, las celulas tratadas con estos compuestos mostraron unos efectos citopaticos (cambios en la morfologfa a una forma redondeada, vacuolizacion y otros). En las mismas condiciones, los heterooligomeros, tales como el dinucleotido TpF y el trinucleotido TpFpF, eran menos activos en la inhibicion del crecimiento celular (19 % y 11 % de inhibicion, respectivamente).
2) Se ensayo el trinucleotido FpFpF en comparacion con la dFdC para comprobar su capacidad de inhibir el crecimiento celular de celulas tumorales de diferente origen: cancer de pancreas (MIA PaCa-2, ASPC) canceres cervical (HeLa, CaSki, C33A) y hepatico (Huh-7). En todos los casos, las celulas se colocaron en placas el dfa anterior al tratamiento a una densidad de 5.000 celulas/pocillos en placas multipocillo de 96. Las celulas (6 pocillos por condicion) se trataron a las concentraciones indicadas y se incubaron durante 72 horas adicionales. En ese momento se cuantifico la proliferacion celular mediante el uso del ensayo del WST-1 como se ha descrito anteriormente. Los pocillos de control con celulas sin tratar y sin celulas se analizaron en paralelo. Los valores obtenidos con el ultimo con se sustrajeron del resto. Los valores medios correspondientes a los pocillos que no se trataron se establecieron en el 100 % de proliferacion, y los valores medios obtenidos con las celulas tratadas se refirieron a los mismos. Segun se ilustra en la figuras C hasta I, en estas condiciones en todos los casos, el trinucleotido de FpFpF inhibio la proliferacion celular con una eficacia significativamente mayor que el monomero de dFdC.
Ejemplo 5: estabilidad del trinucleotido de FpFpF en suero humano.
Objetivo: demostrar una mayor estabilidad del trinucleotido FpFpF en suero humano en comparacion con la dFdC.
Metodos: las celulas se sembraron en placas de 96 pocillos un dfa antes del tratamiento a una densidad de 5.000 celulas/pocillo en 100 jl/pocillo de medio DMEM/Glutamax™/piruvato de 1 sodio mM/PS/10 %/FBS y se cultivaron a 37 °C/5 % de CO2. Se prepararon diluciones en suero individuales de la dFdC y del trinucleotido FpFpF a partir de soluciones madre 1 mM a una concentracion final de 20 jmol/l. Las almuotas de los sueros que conteman los farmacos se incubaron a 37 °C/5 % de CO2 durante los tiempos indicados antes de que fueran anadidas a las celulas a las concentraciones finales indicadas. Las celulas se cultivaron durante 72 horas adicionales, tras lo cual
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se cuantifico la proliferacion celular mediante el uso del ensayo del WST-1. En paralelo se analizaron dos controles: celulas sin tratar y celulas tratadas con dFdC o con trinucleotidos FpFpF que no fueron incubadas con suero.
Resultados: los datos obtenidos con las lmeas celulares MIA PaCa-2 y HeLa se muestran en las figuras J-K y L-M, respectivamente. Estos resultados obtenidos con ambas lmeas celulares demuestran que el FpFpF es estable en suero humano durante al menos 2 horas. La inhibicion de la proliferacion con FpFpF en este periodo permanecio en aproximadamente el 40 %, mientras que la inhibicion con dFdC decayo hasta un 5 % (HeLa) y hasta un 10 % (MIA PaCa-2) en el mismo periodo de tiempo.
Ejemplo 6: actividad citotoxica del trinucleotido FpFpF en celulas cancerosas resistentes a la dFdC
Objetivo: demostrar la actividad antiproliferativa del trinucleotido FpFpF en celulas tumorales con resistencia a la dFdC.
Metodos: se trataron secuencialmente celulas HeLa naturales (parentales) con cuatro rondas de concentraciones crecientes (desde 5 hasta 40 nM) de dFdC hasta que se volvieron resistentes al farmaco y fueron capaces de proliferar despues del tratamiento con dFdC a la mayor concentracion. Las celulas parentales y las resistentes se colocaron en placas un dfa antes del tratamiento a una densidad de 5.000 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos con 100 pl/pocillo de medio DMEM/Glutamax™/ piruvato de sodio 1 mM/PS/FBS al 10 % y se cultivaron a 37 °C/5 % de CO2. Los tratamientos (6 pocillos por condicion) con dFdC o con FpFpF se llevaron a cabo a las concentraciones especificadas en las figuras N y O, y las celulas se incubaron durante 72 horas, tras lo cual se midio la proliferacion mediante el uso del ensayo del WST-1. Las celulas sin tratar se usaron como referencia para establecer el 100 % de los valores de proliferacion.
Resultados. Las celulas HeLa resistentes a la dFdC eran significativamente sensibles a los efectos antiproliferativos del FpFpF (comparense las Figuras N y O).
Ejemplo 7: actividad citotoxica del trinucleotido FpFpF unido a un peptido
Objetivo: para probar y cuantificar la inhibicion de la proliferacion celular causada por el trinucleotido FpFpF conjugado con un peptido que se une espedficamente a las celulas tumorales.
Metodos: las terapias objetivo pretenden mejorar la acumulacion de los farmacos quimioterapeuticos en las celulas tumorales, provocando asf un efecto citotoxico mas potente. Una forma de conseguir esto es mediante el uso de peptidos que se unen a las protemas de la superficie de las celulas tumorales con una elevada afinidad. Previamente se ha demostrado que uno de dichos peptidos, H2N-SPRGDLAVLGHKY-COOH (HBP-1) (SEQ ID No: 1) (Nothelfer et al, 2009), se une a las celulas tumorales a traves del motivo intrmseco RGD. Este peptido se sintetizo, se purifico y se conjugo con FpFpF o con dFdC mediante el uso del reticulador de carbodiimida soluble en agua EDC (Thermo Scientific Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante. El exceso de reactivos y los subproductos de la reticulacion se eliminaron mediante pases sucesivos a traves de dos columnas Sephadex G-25. La concentracion de peptido en el producto reticulado se determino mediante el metodo del BCA (Thermo Scientific Pierce) y la concentracion de dFdC o de FpFpF unido al peptido en los conjugados purificados (abreviados como P- dFdC y P-FpFpF, respectivamente) se midio espectrofotometricamente (A 260 nm) frente a las curvas patron.
Resultados. Los efectos del P-dFdC y del P-FpFpF sobre la proliferacion de las lmeas celulares de cancer de pancreas BxPC-3 y MLA PaCa-2 se muestran en la figura 15. El tratamiento con P-FpFpF provoco una mayor inhibicion de la proliferacion celular en comparacion con el tratamiento con P-dFdC. Es probable que los dos productos entren en las celulas interactuando con las integrinas, tales como la integrina avp6, a traves del motivo RGD. La lmea celular de cancer de pancreas BxPC-3 expresa unos elevados niveles de avp6, mientras que las celulas MIA PaCa-2 no expresan la avp6 (Hausner et al, 2009). El ensayo del WST-1 demostro que en las celulas BxPC-3 la CI50 para el P-dFdC era de 0,17 pM y para el P-FpFpF era de 0,05 pM. Por su parte, con las celulas MIA PaCa-2, la inhibicion por parte del P-FpFpF era menor que por parte del P-dFdC: la CI50 para el P-dFdC era de 0,078 pM y para el P-FpFpF era de 0,105 pM. Los datos muestran que la conjugacion del FpFpF con un peptido de union a la avp6 mejora sus propiedades inhibidoras del crecimiento celular en celulas de cancer de pancreas que expresan la integrina avp6.
Ejemplo 8: actividad citotoxica del trinucleotido FpFpF acoplado a un lfpido
Objetivo: mejorar la permeabilidad celular y la actividad del FpFpF en las celulas tumorales
Metodos: el trinucleotido FpFpF se acoplo a un lfpido segun se ha descrito en el Ejemplo 3 para el palmitoil- trinucleotido (5'-FpFpF-3'-Pal). Se colocaron en placas celulas Panc-1 un dfa antes del tratamiento a una densidad de 5.000 celulas/pocillo en una placa de 96 pocillos con 100 pl/pocillo de medio RPMI/Glutamax™/ piruvato de sodio 1 mM/PS/FBS al 10 % y se cultivaron a 37 °C/5 % de CO2. Los tratamientos (6 pocillos por condicion) con dFdC, con FpFpF y con FpFpF-Pal se llevaron a cabo a las concentraciones indicadas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Resultados: el derivado FpFpF-Pal mostro el mayor poder inhibidor, con una DI50 de 0,28 pM en comparacion con 12,17 y con 5,52 pM para la dFdC y el FpFpF, respectivamente.
Ejemplo 9: encapsulacion del trinucleotido FpFpF en liposomas
Objetivo: mejorar la administracion del trinucleotido FpFpF a traves de una encapsulacion en liposomas.
Metodos. Los liposomas desnudos o dirigidos a anticuerpos (LP) portadores de compuestos antineoplasicos pueden aumentar la eficacia terapeutica de estos agentes. Los ifpidos se hidrataron en solucion salina durante dos horas a la temperatura ambiente (LP). Despues, los LP reconstituidos se diluyeron con 1 ml de solucion salina y se aplicaron a filtros de centnfuga Amicon Ultra-4 NMWLl 00 kDa (Millipore) y se lavaron tres veces con 1 ml de solucion salina. Los fosfolfpidos activados con maleimida son adecuados para su reaccion con los grupos sulfhidrilo de los anticuerpos. Para la conjugacion de los anticuerpos anti-Muc1 con los liposomas, el anticuerpo se anadio a una concentracion final de 40 pg/ml (Ab-LP). La mezcla se incubo a la temperatura ambiente durante dos horas. Se incubaron celulas MCF-7 (106 celulas/ml) en medio RPMI con 1) gemcitabina, 2) homooligomeros de dFdC o 3) 1 mg (LP)/ml de Ab-LPs. Despues de 30 minutos, se centrifugaron alfcuotas iguales de las celulas y se lavaron dos veces con medio RPMI.
Resultados: en comparacion con el FpFpF no encapsulado, el trinucleotido FpFpF mostro una mayor actividad inhibidora de la proliferacion de las lmeas celulares Panc-1 y BxPc-3.
Ejemplo 10: actividad antiproliferativa del trinucleotido FpFpF in vivo
Objetivo: comparar las actividades antitumorales del trinucleotido FpFpF y de la dFdC in vivo en un modelo de xenoinjerto. En este ensayo se usaron celulas HeLa y ratones inmunodeficientes, como se describe a continuacion.
Metodos. Los ratones inmunodeficientes CAnN.Cg-Foxn/m/Crl (BALB/c) (The Jackson Laboratories) son adecuados para el xenotrasplante de tumores humanos. Se mezclaron celulas HeLa (5 x 106) a 1:1 con matrigel en un volumen final de 0,1 ml y despues se inyectaron subcutaneamente en el costado derecho de cada raton. Los tratamientos se iniciaron en el momento en el que el volumen del tumor alcanzo aproximadamente 200 mm3. Los farmacos (trinucleotido FpFpF o dFdC) se administraron intraperitonealmente a 10 mg/kg cada cuatro dfas durante un total de cuatro dosis. Los volumenes de los tumores se calcularon con la formula del volumen elipsoidal (L x W x H x rc/6) (Tomayko y Reynolds, 1989). Los valores de los volumenes de los tumores se transformaron a una escala logantmica. Se uso un analisis de la varianza bifactorial por tiempo y por tratamiento. Los datos se expresaron finalmente como las medias y los errores estandar para cada grupo de tratamiento frente al tiempo. Se asumio una distribucion de Weibull para calcular los tiempos medios y los errores estandares para cada grupo de tratamiento. El retraso en el crecimiento tumoral se definio como la diferencia en el tiempo medio entre cada grupo tratado y el grupo de control.
Resultados. Los datos de la Tabla 1 muestran los efectos del trinucleotido FpFpF en comparacion con la dFdC. El tratamiento con el trinucleotido FpFpF provoco un retraso estadfsticamente significativo (p < 0,01) en el crecimiento tumoral en comparacion con la dFdC.
Tabla 1. Retraso en el crecimiento tumoral con diferentes tamanos de tumor
Grupo de tratamiento
500 mm3 700 mm3 900 mm3
Media ± EEM, (dfas)
Media ± EEM, (dfas)
Media ± EEM, (dfas)
Suero salino
0,0 ± 0,8 0,0 ± 0,7 0,0 ± 0,7
dFdC
2,8 ± 0,3 4,9 ± 0,6 7,7 ± 0,5
Trinucleotido FpFpF
14,8 ± 0,7 17,7 ± 0,5 27,3 ± 0,8
Referencias
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Bommann et al 2008, Cancer Chemother Pharmacol 61: 395-405
Davidson et al 2004, Cancer Res 64: 3761-3766
Gmeiner et al (1995) Patente de EE.UU. numero 5.457.187
Hausner et al 2009, Cancer Res 69: 5843-5850
Uu et al 1999, Nucleosides & Nucleotides, 18 (8): 1789-1802
Moog et al 2000, Int J Pharm 206: 43-53
Moog et al 2002, Cancer Chemother Pharmacol 49: 356-66
Nakahira et al 2007, Int J Cancer 120: 1355-1363
Noble y Goa 1997. Drugs 54: 447-72
Nothelfer et al 2009, J Nuclear Medicine 50: 426-434
Reid et al 2004, J Clin Oncol 22: 2445-2451
Sampatii et al (2010), Solicitud de Patente de EE.UU. US 2010/0081627
Shipley et al 1992, Drug Metab Dispos 20: 849-855
Tomayko y Reynolds 1989, Cancer Chemother Pharmacol 24: 148-154

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Compuesto formado por 2-30 unidades de 2',2'-difluoro-2'-desoxicitidina (dFdC) unidas con enlaces de fosfato 5'3' para su uso en terapia.
  2. 2. Compuesto formado por 2-30 unidades de dFdC unidas con enlaces de fosfato 5'-3' para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa o de un cancer.
  3. 3. El compuesto para el uso de la reivindicacion 1 o 2, que esta formado por 2-10 unidades de dFdC unidas con enlaces de fosfato 5'-3'.
  4. 4. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es FpFpF (trinucleotido de dFdC) unidas con enlaces de fosfato 5'-3'.
  5. 5. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 con una molecula unida covalentemente de cualquiera de los grupos que consisten en un lfpido, un aminoacido, un peptido, un anticuerpo o un aptamero en el terminal 5' o en el terminal 3', o en ambos terminales.
  6. 6. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que esta encapsulado en un liposoma.
  7. 7. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho compuesto esta modificado para aumentar su estabilidad en el suero y la permeabilidad celular, por ejemplo, mediante su conjugacion con un lfpido.
  8. 8. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicho uso comprende una administracion de dicho compuesto simultaneamente con dFdC.
  9. 9. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicho uso comprende una administracion de dicho compuesto y de clorhidrato de dFdC por separado, en cualquier orden, en un intervalo terapeuticamente eficaz.
  10. 10. El compuesto para el uso de la reivindicacion 8 o 9, en el que dicha administracion es a traves de la via parenteral.
  11. 11. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en el que dicho cancer es cancer de pancreas, cancer hepatocelular, cancer de pulmon, precancer cervical y lesiones cancerosas, cancer de mama, cancer de ovario, cancer colorrectal o linfoma, tal como linfoma no Hodgkin.
  12. 12. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que dicho compuesto es homomerico.
  13. 13. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 que tiene la Formula estructural (I)
    imagen1
    o una sal, un hidrato, un N-oxido o un solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que:
    R1 es hidrogeno, un lfpido, un aminoacido, un peptido, un anticuerpo o un aptamero R2 es hidrogeno, un lfpido, un aminoacido, un peptido, un anticuerpo o un aptamero n = 1-30
  14. 14. Una composicion que comprende el compuesto para su uso segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
  15. 15. La composicion de la reivindicacion 14 que es una composicion farmaceutica.
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